试剂和材料

 

货号	名称
11-0038-42	CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), FITC, eBioscience™
222026	流式缓冲液
352058	流式管 (12×75 mm, 5 mL)

 

操作步骤

 

1．将分离的PBMC和T细胞分别悬浮于PBS缓冲液中，制备成1 x 107细胞/mL的单细胞悬液。具体分离操作步骤见T细胞的分离。

2．两支流式管中分别加入50 μL PBMC细胞悬液和50 μL T细胞悬液。

3．将5 μL CD3-FITC抗体混合于流式染色缓冲液中，使检测终体积达到100 μL(例如，50 μL细胞加入50 μL抗体混合液)轻轻涡旋以混合均匀。

4．2-8°C或冰上避光孵育至少30分钟。

5．每支流式管加入2 mL流式细胞缓冲液洗涤细胞。室温400-600xg离心5分钟。弃上清。

6．重复步骤5。

7．用适量的流式细胞缓冲液重悬细胞。

8．使用流式细胞仪分析样本。

 

 

人CD3+细胞分选试剂盒分离正常人外周血单个核细胞中的CD3+细胞后，利用Anti-Human CD3-FITC标记细胞，对分选前（左）或分选后（右）的细胞进行流式分析

 

 

 

 

分离后的T细胞通过体外刺激扩增，达到需要的细胞数量用于后续研究。T细胞活化需要两个信号，第一信号是APC表面的MHC-抗原肽复合物与TCR的相互作用和结合，第二信号是微生物产物或者固有免疫针对微生物的应答成分即共刺激分子。第二信号又分为抗原依赖的(需要抗原和来自抗原提呈细胞或抗CD28抗体等的共同刺激)不依赖于抗原的(不需要抗原而是有丝分裂原[PHA或Con A])两种。抗原依赖刺激只扩增抗原特异性的T细胞，而不依赖抗原的刺激则扩增样本培养中的所有T细胞。本文介绍CD3/CD28共刺激扩增T细胞。

 

试剂和材料

货号	名称
661350	HapClut™人T细胞扩增培养基
AH1003125	Anti-human CD3，Functional Grade(功能性抗体/T细胞激活剂）
AH1028125	Anti-human CD28，Functional Grade(功能性抗体/T细胞激活剂)
16-0037-81	CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), Functional Grade, eBioscience™
16-0289-81	CD28 Monoclonal Antibody (CD28.2), Functional Grade, eBioscience™
200-02-10	重组人IL-2

 

操作步骤

抗体包被微孔板

1. 用无菌 PBS 稀释 Anti-human CD3 功能抗体 (PBM#AH1003110)包被抗体，浓度为 5~10 µg/mL。
2. 向 96 孔板中加入抗体包被，每孔 50 μL。对照孔加 50 μL 无菌 PBS。
3. 盖上微孔板盖，放置于 37℃恒温培养箱，孵育 2 小时或放置 4℃过夜包被。
4. 在接种细胞之前，吸出微孔板中的液体，然后加入 200 μL 无菌 PBS 洗涤微孔 2 次（注意不要刮划
包被的微孔板底部），同时防止微孔干燥。
扩增培养 T 细胞
1. 制备人 PBMC 或 T 单细胞悬液。
2. 进行细胞计数，300×g 离心 10 分钟洗涤细胞。
3. 去除上清后用 T 细胞扩增培养基重悬细胞，加入适量的培养基调整细胞浓度至 106/mL。
4. 向细胞悬液中加入 hIL-2(Peprotech #200-02-10)至终浓度 50 ng/mL，Anti-human CD28 功能抗体
(PBM#AH1028110)至终浓度 2 µg/mL 进行共刺激。
5. 接种细胞到包被好的微孔板中，每孔接种细胞悬液 200 μL，37℃, 5% CO₂孵育培养。
6. 培养 2~4 天。可收集细胞或每两天进行一次半量换液继续培养。
注：6-8 天，T 细胞处理静止期，可再次刺激继续培养扩增。

 

什么是调节性T细胞（Treg）？

调节性T细胞（Treg）对维持自身耐受性和免疫细胞稳态至关重要，这在免疫失调多内分泌病肠病x连锁综合征中发生的Treg丢失或丧失功能导致的严重后果得到了证明。研究还发现Treg在调节自身免疫性疾病的免疫反应中发挥了重要作用，包括1型糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮（SLE）和重症肌无力。

调节性T细胞分类和命名

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Treg的分类和命名已经标准化，包括三个主要的Treg种群：（1）胸腺衍生的Treg （tTreg），此前被称为天然Treg，与CD4单阳性源祖细胞亚群CD25+ Foxp3 -或CD25 - Foxp3Low不同。（2）外周Treg（pTreg）是由抗原刺激诱导外周淋巴组织（如肠道相关淋巴组织）中的naïve T细胞而来。（3）体外诱导的Treg（iTreg）则来源于在IL-2和转化生长因子β存在下用抗CD3刺激naive CD4+ T细胞。虽然没有独特的标志物区分这三个亚群，但Foxp3的表达对它们的抑制功能至关重要。

Treg的鉴定和分型因其具有效应T细胞的表型和转录特性而变得复杂。例如，控制肠道免疫反应的Treg除了表达Foxp3和CD25外，还表达RORγt和CD196 (CCR6)，而内脏脂肪组织中的Treg则只表达Foxp3和PPARγ。这种可塑性是由IL-6、IL-1、肿瘤坏死因子-α、IL-23等细胞因子促进的，它使Treg对组织特异性化学诱剂作出反应，并迁移到靶部位调节免疫应答。我们对Treg的表型和基因特征的了解大多来自对小鼠模型的研究。在T细胞受体（TCR）的刺激可以诱导低水平的Foxp3和Treg的其他表面标志物瞬时表达，因此对人Treg的研究更加复杂。表观遗传修饰的研究发现，对于tTreg和pTreg而言，位于Foxp3基因座的Treg特异性去甲基化区域（TSDR）的CpG岛发生去甲基化，但在iTreg和传统的T细胞则显示低甲基化或不表达Foxp3。因此，TSDR的去甲基化被认为是鉴定tTreg &pTreg的真正方法；继续寻找能够对特定、活的Treg进行分类的表面标志物。

表 1.Treg细胞的性质

性质	胸腺来源的Treg（tTreg）	外周Treg（pTreg）	体外诱导的 Treg （iTreg）
开发	胸腺	外周（主要是肠道）	体外
祖细胞	CD4单阳性细胞 CD25+Foxp3– 或 CD25– Foxp3Low	NaiveCD4+细胞	NaiveCD4+细胞
表面表型	CD4+CD25Hi CD127Low CD62LHiCD44Low CD45RBLow （小鼠） CD4+ CD25HiCD127Low Low CD4+CD25HiCD45ROHi （人）	CD4+CD25+CD62LLow CD44Hi	CD4+CD25+CTLA-4+ CD62LLow
TSDR甲基化状态	去甲基化	去甲基化	甲基化
转录因子	Foxp3 c-Rel EOS Helios STAT5	Foxp3 GATA-3（亚群） Helios（亚群） IRF4（亚群） PPARγ（亚群） RORγt（亚群） STAT5 T-bet（亚群）	Foxp3 Helios（亚群） STAT5
其他相关表面标志物	CD31（亚群） CD45RA（亚群） CD49d CD101 CD103 CD121a（活化） CD121b（活化） CD134 (OX-40) CD137 (4-1BB) CD152 (CTLA-4) CD197 (CCR7) CD304 (NRP1) CD357 (GITR) FR4 GARP（活化） LAP （活化） TIGIT	CD45RA（亚群） CD49b CD 194（CCR 4；亚群） CD 196（CCR 6；亚群） CD 183（cxcr 3；亚群） CD223 (LAG3) CD226 CD278 (ICOS) CD279 (PD-1) GARP（活化） LAP （活化）	CD152 (CTLA-4) GARP（活化） LAP （活化）
体外扩增	CD3抗体和IL-2	n/a	n/a
体外分化	n/a	n/a	Anti-CD3, anti-CD28, IL-2, 和 TGFβ
Low：低表达水平，Hi：高表达水平，+：细胞亚型存在表达标志物，-：细胞亚型不存在表达标志物。

 

疾病中的调节性T细胞

据报道，Treg有许多不同的免疫抑制机制。细胞接触依赖性抑制由TIGIT、CD39、CD73和CD152 （CTLA-4）介导，也可以由颗粒酶A和B对靶细胞的细胞溶解介导。虽然Treg在活化时不分泌IL-2，但它们可以分泌免疫调节细胞因子，如IL-10、转化生长因子β和IL-35。据报道，在微环境和其他代谢紊乱中消耗IL-2是Treg抑制免疫反应的机制。

以Treg为靶点的一些治疗药物，通过增强Treg在自身免疫性疾病和移植物抗宿主病（GVHD）中的功能，或在某些癌症中阻断Treg的功能。例如，抗肿瘤坏死因子抗体可扩增类风湿性关节炎患者的Treg并稳定其功能，而低剂量IL-2可提高Foxp3+细胞上CD25的表达，并扩增Treg，在移植物抗宿主疾病、丙型肝炎病毒诱导的血管炎、1型糖尿病、斑秃和系统性红斑狼疮方面具有良好的效果。其他研究包括使用抗cd3抗体、抗cd25抗体、IL-2/抗IL-2复合物、抗il -6受体抗体和CTLA-4:Ig靶向自身免疫性疾病中的Treg针对治疗用途的Treg体外扩增和稳定的方法正在探索中。

活的Treg的分离和分选

Treg最初被鉴定为CD4+ CD25+ T细胞群，具有抑制免疫反应的能力。磁性细胞分离方法利用Treg高表达的CD25来富集人和小鼠的Foxp3+细胞。将Foxp3确定为Treg的“主要调节因子”是定义Treg为独特的T细胞谱系的关键一步。但是，缺乏抑制功能的T细胞也可能被诱导表达CD25和Foxp3。此外，Foxp3在细胞核表达，不适用为分离活的Treg的标志物。

通过对Treg表面抗原标志物的鉴定，可以对存活的Treg进行鉴定和流式细胞仪分选，从而得到高度富集和带抑制功能的Treg。除CD4和CD25外，小鼠和人Treg均可表达高水平的CD357 （GITR/AITR）和CD152 （CTLA-4），但CD127（IL-7Ra）的表达较低。添加CD45RO、CD39和CD73等标志物可以提高人Treg的富集，事实上已有多项研究表明，仅使用CD4、CD25和CD127分离人Treg显著富集活化的T细胞。CD45RA也被证明是区分人静息和效应Treg的标志物。类似地，在小鼠模型中，将CD39、CD45RB、CD101、FR4和CD73添加到CD4、CD25和CD127标记物panel中可以提高Treg的富集。

Treg以不同的状态（静息或活化）存在于特定的组织（肠道、脂肪、皮肤或肌肉）中，这可以根据其归巢和迁移标志物的表达来进一步区分。使用各种表面标记的一组抗体方案来鉴定和分离活的Treg，可以富集Treg亚群并对其下游抑制活性进行分析，以及离体扩增并转移回小鼠或人体内以调节免疫应答 。

Treg的扩增分化和功能

Treg能有效抑制免疫应答；但是，它们不是非常丰富的细胞种群。因为数量缺乏，所以体外扩增的方法很关键，包括扩增现有的Treg或将Treg从常规CD4+T细胞中分化出来，以便获得足够数量的细胞来研究其在体内和体外的功能。

在通过磁珠细胞分选或多参数流式细胞仪分选从人或小鼠中分离出活Treg后，再通过刺激TCR和IL-2以及添加或不添加雷帕霉素在体外扩增获得该细胞群体。可使用培养板包被的抗CD3抗体、抗CD3抗体/CD28抗体偶联的磁珠或抗CD3抗体包被的抗原提呈细胞来实现对TCR的刺激。人Treg的扩增通常需要共刺激信号，但体外扩增小鼠Treg可能是不必要的。当使用磁珠分选试剂时，使用雷帕霉素可能是有利于Treg的分离，因为众所周知，它可以抑制传统T细胞的扩增，从而促进Treg优先扩增和存活。

对于小鼠，在IL-2和转化生长因子β存在的情况下，使用抗CD3抗体体外刺激naive CD4+ Foxp3-T细胞分化成Treg。抗CD28抗体的共刺激是必要的，因为其促进Foxp3表达的能力主要是通过增强内源性IL-2表达。有趣的是，虽然人的naive CD4+T细胞在类似的培养条件下可以被诱导表达Foxp3，但这些细胞没有抑制功能，并且在应对再刺激的反应中能分泌炎性细胞因子。一些研究表明，添加雷帕霉素或维甲酸有助于促进人细胞的抑制功能，但其他实验室尚未重现该结果。

可以在体外使用Treg和效应T细胞的共培养系统研究Treg的抑制功能。Treg的来源可以是新鲜分离的、体外扩增的或iTreg。通常，在TCR刺激下以不同的比例的Treg和效应T细胞培养达4天。最常见的评判标准是效应T细胞的增殖，要么通过稀释的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE），掺入的5-溴-2-脱氧尿苷（BrDU）或3H-胸苷。细胞因子生成、活化标志物的上调以及细胞计数也能进行评估。有趣的是，利用效应T细胞上CD25和CD134 （OX-40）的表达进行为期两天的研究表明，CD25和CD134 （OX-40）的表达与增殖相关，可以作为评判Treg抑制功能的短期替代分子。

表 2.tTreg体外扩增试剂。

介质	功能
抗CD3	TCR交联
抗CD28	共刺激
Gibco CTS (细胞治疗系统) Dynabeads CD3/CD28	TCR交联和共刺激
IL-2	生长因子
雷帕霉素	抑制传统T细胞的扩增

表 3.体外生成iTreg的试剂。

介质	功能
抗CD3	TCR交联
抗CD28	共刺激
IL-2	生长因子
TGFβ	生长因子
视黄酸	稳定Foxp3的表达和有抑制功能？
雷帕霉素	稳定Foxp3的表达和有抑制功能？

表 4.用于体外研究Treg抑制功能的试剂。

介质	功能
抗CD3	TCR交联
抗CD28	共刺激
Gibco CTS (细胞治疗系统) Dynabeads CD3/CD28	TCR交联和共刺激
IL-2	生长因子
CFSE	细胞分裂
CellTrace染料	细胞分裂
抗CD25	活化标志物
抗CD134	活化标志物
Brdu还是EdU	DNA合成/增殖
3H-胸苷	DNA合成/增殖

细胞因子谱

Treg细胞已通过多种方法被证明可以抑制T细胞的功能，机制包括接触依赖和细胞因子介导。其中包括TGF-b的分泌，它已被证明能强有力的抑制效应T细胞功能，IL-10作为T细胞抑制性细胞因子在特定环境中发挥作用，有研究表明IL-35对T细胞增殖有抑制作用。此外，研究表明趋化因子CCL3和CCL4可以作为诱导剂，能使细胞毒性T细胞靠近Treg从而被抑制。实验还表明，与被刺激的Naive T细胞相比，Treg细胞表达高亲和力的IL-2受体的表面而竞争结合IL-2，间接影响T细胞增殖和功能。

表5：参与Treg分化和分泌的关键细胞因子。

	分化	分泌
细胞因子和趋化因子	IL-2、TGF-b	IL-10、TGF-b、IL-35、IL-9、CCL3、CCL4

Treg也表达许多免疫关卡分子，包括细胞毒T淋巴细胞相关抗原4、PD‐1、Tim‐3、LAG‐3和TIGIT，它们能与抗原呈递细胞上表达的同源配体结合并传递正向或负向的免疫调节信号。这些免疫关卡分子中有几个以可溶形式存在，由其膜相关形式的蛋白水解切割而形成，或以可溶性形式表达。这些可溶形式可能具有活化或抑制抗肿瘤活性的功能，并可在血清或血浆中使用多重免疫分析试剂盒进行检测。

物种	描述	分析物	货号
人	Th1/Th2/Th9/Th17 Cytokine 18-Plex Human ProcartaPlex Panel	GM-CSF、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17A （CTLA-8）、IL-18、IL-22、IL-23、IL-27、TNF alpha	EPX180-12165-901
	Immuno-Oncology Checkpoint 14-Plex Human ProcartaPlex Panel 1	D27, CD28, CD137 (4-1BB), GITR, HVEM, BTLA, CD80, CD152 (CTLA4), IDO, LAG-3, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3	EPX14A-15803-901
	Immuno-Oncology Checkpoint 14-Plex Human ProcartaPlex Panel 2	MICA，MICB，穿孔素，ULBP-1，ULBP-3，ULBP-4，精氨酸酶-1，CD73 （NT5E），CD96（Tactile），上皮钙粘蛋白，粘连蛋白-2，PVR，Siglec-7，Siglec-9	EPX140-15815-901
小鼠	Th1/Th2/Th9/Th17/Th22/Treg Cytokine 17-Plex Mouse ProcartaPlex Panel	GM-CSF、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17A （CTLA-8）、IL-18、IL-22、IL-23、IL-27、TNF alpha	EPX170-26087-901
	Immuno-Oncology Checkpoint 7-Plex Mouse ProcartaPlex Panel 2	CD137L (4-1BBL), CD152 (CTLA4), CD276 (B7-H3), CD80, PD-1, PD-L1, PD-L2	EPX070-20835-901
	Immuno-Oncology Checkpoint 4-Plex Mouse ProcartaPlex Panel 1	BTLA、CD27、LAG-3、TIM-3	EPX040-20830-901

 

 

调节性T(Treg)细胞是一种具有免疫抑制功能的T细胞亚群。Treg细胞在对自体抗原的免疫耐受和控制对外来病原菌的过度反应方面具有重要作用。鉴于其在免疫系统中的重要作用，Treg细胞成为免疫学领域的热门研究对象。美夭旎作为免疫学研究完整解决方案的提供者，同样为Treg细胞研究的每—步提供优质的产品和服务。

-丰富的Treg细胞研究产品，满足您的一切需求

-专为Treg细胞分选、培养和扩增而优化的试剂

-优质的细胞培养基和细胞因子，甚至满足GMP级Treg细胞培养条件的要求

良好的试验开端 初始样本的好坏是实验成功与否的关键

 

gentleMACS™组织处理器

 

gentleMACS系列多功能、台式组织处理器，最多可同时处理8个样本。用户可以根据实验样本自己编程，同时，优化的温控设计保证了样本组织解离的标准化和可靠性。

-温和：得到高活性的单细胞悬液，并且抗原表位保留完好

-可重复：预设程序保证了组织处理的标准化及实验结果的稳定

-快速：使用gentleMACS八通道组织处理器最多可同时处理8个样本

-安全：在封闭和无菌的系统中进行样本处理，保障操作者和样本的安全

即用型组织解离试剂盒及预设程序，让您可以高效解离各种常见类型的组织样本。

注意：由于Treg细胞表面的CD25抗原比较敏感，因此，在进行组织解离时，需要选择合适的蛋白酶和实验方案。

图1：gentleMACS™系列组织处理器及解离试剂盒，可以用于高效、可靠的组织解离，最多同时处理8个样本。

gentleMACS™管子

 

gentleMACS管子是经严格的工程学设计的，保证高效和高质量的组织解离或组织匀浆。

-gentleMACS C管：紫色盖子的C管可以用于高效的组织解离，得到高活力的单细胞悬液。

-gentleMACS M管：橙色盖子的M管可以用于组织匀浆，用于下游实验，如分子分析筹。

图2：gentleMACS C管和M管，用于高效的组织解离或组织匀浆。

 

最佳直选 选择最适合的实验方案

 

MACS^®磁性细胞分选技术

丰富的MACS细胞分选产品满足您对T细胞分选的一切要求，您可以根据需要选择最适合的产品和方案。美天旎MACS磁性细胞分选技术已经得到广大生命科学工作者的充分认可，并在不断创新和进步，为您提供从基础科研到临床应用的完整解决方案。

T细胞分选的多种选择

-纳米级磁珠（基于分选柱的MACS磁珠、细胞分选试剂盒、全血磁珠），可用于分选高纯度的目的细胞，且最大限度保证回收率

-微米级磁珠（无需分选柱的MACSxpress^®分选技术），适用于直接从全血中进行快速、高效的细胞分选

	纳米级磁珠	微米级磁珠
优势	- 最全面的细胞分选技术 - 适用于几乎任何物种或样本- 适用范围广——从基础研究到临床应用	-直接从全血分离细胞，仅需20分钟-无需密度梯度离心-最大化减少样本处理步骤，保证结果的高度可重复
组成	-MACS分选-MACS分选器柱-MACS磁珠	-MACSxpress分选器-MACSxpress磁珠
起始样本	-外周血单个核细胞(PBMC)-全血 -骨髓-组织来源的单细胞悬液	-全血
	MACS磁性细胞分选技术	MACSxpress全血分选技术

MACS分选柱 最温和的细胞分选方法

MACS分选柱的优势

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MACS分选柱作为MACS磁分选技术的核心部分，内部填充专利的超顺磁铁珠（图3）。基于其独特设计和内部基质构造，使用MACS分选柱能获得高纯度、高活力的目的细胞，从而为细胞分选提供理想的解决方案，并且不受细胞类型或样本体积限制。

-最少的细胞标记：MACS分选柱能够将磁场放大1000-10000倍，因此，只需用少量纳米级磁珠标记，即可实现细胞的高效分选

-温和：细胞可以自由流穿MACS分选柱，过程温和，对细胞活性无影响

图3：MACS磁性细胞分选技术。根据不同的分选柱类型，MAC分选柱中填充的微球直径250-500 µm，并且，分选柱中微球之间的距离约是淋巴细胞体积的20倍，因此，细胞能够自由流穿分选柱，不会聚集或堵塞。

探索一切可能

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美天旎基于分选柱的细胞分选策略适用于几乎任意类型或体积的样本，并且提供多种实验方案，从适合少量样本的手动分选到高通量、全自动的磁性细胞分选，让您可以自由选择（图4）。您可以与我们的技术支持沟通，根据需要制定最佳细胞分选方案。

 - 手动分选系统适用于小样本量的细胞分选

 - 利用MultiMACS™Cell 24 Plus分选仪可以进行高通量磁性细胞分选，最多处理24个样本

 - 使用autoMACS Pro分选仪可以进行全自动磁性细胞分选

手动细胞分选：最多可同时处理8个样本，使用方便，实验室都可轻松配备。		全自动磁性细胞分选：可同时处理多个样本，全自动、标准化，结果可重复性高。
半自动化细胞分选：最多可同时处理24个样本，实现快速、高质量的细胞分选。		将自动化流水线整合到细胞分选方案中，迸一步简化工作流程。

图4：从MACS手动分选器到整合MACS设备的自动化流水线系统。MACS分选柱及填充基质是实现快速、高效细胞分选的关键，为您的生命科学研究提供全方位的支持。

便捷的细胞分选方案 轻松分选Treg细胞、高纯度、高回收率

起始样本不受限制

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美天旎为您提供Treg细胞分选试剂盒，可以轻松分选功能完好的CD4⁺CD25⁺ Treg及其亚群（图5）。利用MACS^®技术，不论是阳性分选还是阴性分选方案，都可以得到高纯度的Treg细胞，并且细胞功能不受影响，可以直接用于下游实验，如体外抑制试验。

人源起始样本					动物来源的起始样本
全血	PBMCs				小鼠脾脏单细胞悬液	非人灵长类PBMCs
MACSxpress  Treg lsolaton Kit#130-109-557	CD4+CD25+Regulatory T Cell   lsolation Kit #130-091-301	CD4+CD25+CD127dim/-Regulatory T Cell   lsolation Kit #130-094-775	CD4+CD25+CD45RA Regulatory T Cell   lsolation Kit#130-093-631	CD25+CD49d-Regulatory  T Cell   lsolation Kit #130-094-551	CD4+CD25+Regulatory T Cell   lsolation Kit #130-091-041	CD4+CD25+Regulatory T Cell   lsolation Kit #130-092-984

图5：根据起始样本及目的细胞，美天旎为您提供多种相应的细胞分选试剂盒，让您轻松获得高纯度、高活力、功能完好的Treg细胞及其亚群。   

 

直接从全血样本中分选Treg

 

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MACSxpress®Treg lsolation Kit, human

使用美天旎MACSxpress Treg分选试剂盒，可以从经过抗凝处理的新鲜全血样本中直接分选CD4⁺CD25⁺Treg细胞，一次最多处理30mL全血：

-快速：30分钟内完成全血中Treg细胞的分选（图6）

-简便：简单五步，无需密度梯度离心（图7）

-可靠：Treg细胞的回收率高

 

图6：使用MACSxpress全血分选技术进行快速的细胞分选．分别使用美天旎MACSxpress全血分选技术祀其它磁分选产品，从全血中分选Treg细胞．数据显示，使用MACSxpress Treg分选试剂盒，可以在30分钟内完成Treg细胞的分选，并且富集到的细胞可以直接用于下游实验，无需进行额外的清洗或其它处理。

 

 

10分钟	CD4+细胞分选 将全血样本与一系列免疫磁珠共孵育，非目的细胞和目的细胞分别被大磁珠和纳米级磁珠标记。样品在混悬仪上孵育10分钟。
15分钟	CD4+细胞分选 将孵育后的样本放置在MACSxpress全血分选器中，去除白细胞和红细胞。
	CD4+细胞分选 收集上清液，即含有CD4-细胞组份。若起始样本体积大于8mL，建议通过离心减少此时的样本体积。
5分钟	CD25+绷胞富集 将上一步收集到的上清液转移到LS分选住或autoMACS Pro全自动磁性细胞分选仪上，洗两次分选柱。
30分钟	CD25+细胞富集 将分选柱从分选器中移出，用2mL缓冲液洗分选柱，获得CD4+CD25-Treg细胞。

 

图7：直接从全血中快速、简便地分选Treg细胞。

 

一直被模仿，从未被超越 高效分选Treg细胞及其亚群

从PBMCs中分选Treg细胞亚群

 

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美天施提供多种Treg分选试剂盒，用于从PBMCs中高效分选Treg细胞及其亚群。—般仅需两个步骤：

 

人PBMCs

步骤1：去除non-CD4+非目的细胞

预富集CD4+细胞（流穿组分）

步骤2：阳性分选CD25+细胞

CD4+CD25+细胞或其它Treg亚群

 

CD4⁺CD25⁺ Regulatory T Cell  IsoIation Kit,Human

-高纯度、高得率、高活力

-同时获得CD4⁺CD25⁺和CD4⁺CD25^-细胞组份，可以完美兼容体外细胞抑制功能试验，如：便用Treg Suppression Inspector试剂盒

-每10⁸ PBMCs可分选到约6x10⁵ CD4⁺CD25⁺Treg细胞

CD4⁺CD25⁺CD127^dim/- ReguIatory T Cell IsoIation Kit,Human

-分选高纯度的FoxP3⁺细胞

-纯度可达96%

-每10⁸PBMCs可分选到4x10⁵CD4⁺CD25⁺CD127^dim/-Treg细胞

CD25⁺CD49d^-ReguIatory T Cell IsoIation Kit,Human

- 高效分选或去除CD25⁺CD49⁺效应T细胞

- 获得的Treg细胞功能完好，有较高的抑制功能活性

- 每10⁸ PBMCs可分选得到约5x10⁵CD25⁺CD49d^-Treg细胞

CD4⁺CD25⁺CD45RA ReguIatory T Cell IsoIation Kit,Human

- 高效分选naive Treg细胞

- 高活力的Treg细胞，可用于体外长期培养和扩增

- 每10⁸ PBMCs可分选得到约1.5x10⁵ naive Treg细胞

高效分选小鼠CD4⁺CD25⁺Treg细胞

 

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从小鼠脾脏或淋巴结单细胞悬液中快速、简便地分选CD4⁺CD25⁺Treg细胞。仅需简单两步，即可分选到高活力的CD4⁺CD25⁺ Treg细

胞和CD4⁺CD25^-应答T细胞。获得的目的细胞可以直接用于下游实验，如体外师制功能实验、过继性转移实验。

CD4⁺CD25⁺ Regulatory T Cell lsolation Kit. mouse

- 同时分选CD4⁺CD25⁺ Treg细胞和CD4⁺CD25^-细胞，如体外抑制功能实验

- 纯度可达95%

- 每10⁸脾脏单细胞可分选得到1.6X10⁶ Treg细胞

图8：用CD4⁺CD25⁺Regulatory T Cell lsolation Kit，mouse从小鼠脾脏单细胞悬液中分选Treg细胞。细胞分别用CD4-FITC (A)或Anti-FoxP3-APC (B)标记后进行流式检测（注：细胞在分选过程中已标记CD25-PE抗体）。

高效分选非人灵长类CD4⁺CD25⁺Treg细胞

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从恒河猴PBMCs中快速、简便地分选CD4⁺CD25⁺Treg细胞，分选到的细胞纯度高、得率高，且完美兼容下游实验应用，如表型鉴定或功能实验等。

CD4⁺CD25⁺ Regulatory T Cell lsolation Kit.non-human primate

- 纯度高达92%

- 每107 PBMCs可分选得到9x10³ Treg细胞

- 可以高效分选恒河猴中的Treg细胞

- 可以识别猕猴(Macaca fascicularis)Treg细胞

 

特殊实验方案：分选非人灵长类CD4⁺CD25⁺CD127^dim/-Treg细胞

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我们已将人的CD4⁺CD25⁺CD127^dim/- Regulatory T cell lsolationKit ll使用方法做了优化，可以用于分选非人灵长类的CD4⁺CD25⁺CD127^dim/-Treg细胞，纯度高、活性好。

Treg细胞分选相关产品

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名称	规格	货号
MACSxpress®Treg lsoIation Kit,  human	3x30 mL whole blood	130-109-557
MACSxpress CD4 T CellIsoIation Kit, human	3x30mL whole blood	130-098-195
Whole Blood CD4 MicroBeads, human	40mL whole blood	130-090-877
MACSxpress Starting Kit with MACSxpress  Separator,   MACSmixn'i Tube RotatoC and one MACSxpress IsoIation Kit of  choice		130-101-319
MACSxpress®Separator		130-098-308
CD4+CD25+ Regulatory T Cell lsoIation Kit, human	1xl09 total cells	130-091-301
CD4+CD25+CD1 27dim/- Regulatory T Cell Isdation  Kit II,  human	1x109 total cells	130-094-775
CD4+CD25+CD45RA+ Regulatory T Cell IsoIation  Kit,  human	2xl09 total cells	130-093-631
CD25+CD49d- Regulatory T Cell Isolation  Kit,  human	1x109 total cells	130-094-551
MACS MultiStand		130-042-303
MidiMACS separator		130-042-302
LS Columns	25 pieces	130-042-401
LD Columns	25 pieces	130-042-901
MS Columns	25 pieces	130-042-201
CD25 MicroBeads II, human	1x109 total cells	130-092-983
CD127 MicroBead Kit,  human	1xl09 total cells	130-094-945
CD4+CD25+ Regulatory T Cell  IsoIation  Kit,  mouse	1x109 total cells	130-091-041
CD4+CD25+ Regulatory T Cell IsoIation Kit, non-human primate	1xl09 total cells	130-092-984

 

无需Ficoll密度梯度离心，更快、更高效： 在流式分选前，先用WhoIe B|ood CD4 MicroBeads（阳性分选）或MACSxpress CD4 T CelI Isolation Kit（去除分选）进行细胞预富集。

理想的培养条件保证理想的实验结果 Treg细胞培养/扩增工具

 Treg细胞培养、扩增、分析的完美方案

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美天旎专家们研发了一系列产品，用于Treg细胞的体外激活、培养、扩增以及表型鉴定等，包括TexMACSn'i培养基、MACSa细胞因子、Treg细胞扩增试剂盒、Treg抑制功能检测试剂盒等。

TexMACS™Medium. Research

TexMACS™科研级培养基是—款无动物源成份的优化培养基，可以用于人和小鼠T细胞、Treg细胞的体外培养和扩增，品质可靠，保证实验结果的稳定和可重复性。

 

Treg Suppression Inspector. human

人Treg抑制功能检测试剂盒是根据体外抑制试验原理而设计的，用于人Treg细胞的功能检测。该试剂盒含耦联了CD2、CD3和CD28抗体的MACSiBead磁珠，用于模拟T细胞激活荆，刺激T细胞活化。Treg抑制功能检测试剂盒为抑制试验提供理想的细胞刺激环境：应答T细胞( Tresp)被激活并保留对Treg细胞抑制功能的敏感性。同时，Treg细胞在实验过程中傈持低增殖状态，可以通过3H-胸腺嘧啶核苷掺入法或细胞稀释实验检测细胞增殖情况（图9）。

图9：用人Treg Suppression Inspector检测Treg细胞的抑制功能。分别在添加和不添如Treg Suppression Inspector的条件下，将Treg和Tresp细胞按不同比例共培养．共培养5天后添加3H-胸腺嘧啶核苷酸，16小时后检测Tresp细胞的增殖情况（左）：或者在共培养5天后，根据已标记的Tresp细胞的稀释示踪实验检测细胞增殖情况。

分选后的Treg细胞扩增方案

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美天旎Treg细胞扩增试剂盒是基于负载了CD3和CD28抗体的MACSiBeadT¨纳米级微球而发挥作用的。经反复优化的刺激剂比例能够保证Treg的稳定扩增，并保持FoxP3的持续表达。细胞扩增后，MACSiBead微球可以利用MACSiMAGT¨分选器去除，因此，下游实验完全不受影响。

Treg Expansion Kit, human

使用MACSxpress Treg lsolation Kit, human试剂盒从人血液或PBMCs中分选得到Treg细胞，然后用Treg Expansion Kit, human

进行诱导扩增，刺激过程能够完美保护FoxP3的表达（图10）。

Treg Expansion Kit, mouse

使用CD4⁺CD25⁺ Regulatory T Cell lsolation Kit试剂盒从小鼠中分选到得到Treg细胞，进—步用Treg Expansion Kit, mouse进行

Treg细胞的诱导扩增，该试剂盒适用于高效扩增鼠源Treg细胞。

图10：用Treg Expansion Kit, human刺激获得Treg细胞的高教扩增。用MACSxpress Treg lsolation Kit．human从人血液中分选获得Treg细胞，进而用Treg Expansion Kit．human进行刺激扩增14天。图为扩增前(A)／后(B)细胞表面FoxP3表达情况检测结果。

Treg细胞培养和功能检测相关产品

 

名称	规格	货号
TexMACS™Medium, research grade	3x30 mL whole blood	130-097-196
Treg Suppression Inspector, human	2.5 mL	130-092-909
Treg Expansion Kit, human	2 mL  2 x 2 mL	130-095-345130-095-353
Treg Expansion Kit, mouse	2 mL	130-095-925
MACSiMAGT Separator	Components:  MACSiMAGSeparator Tube rack for tubes from 0.5 mL t0 5 mL in size	130-092-168
Human IL-2		200-02
Mouse IL-2		212-12

流式分析Treg细胞亚群 精确分析Treg细胞

为Treg细胞分析提供完美的工具

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在实验设计和优化过程中，可靠的流式分析数据能够让您更快确定方案，获得高度可重复的实验结果。美天旎为您提供一系列Treg特异性的流式抗体（图11、12），以及即用型的Treg细胞检测试剂盒（人和小鼠）。

Treg Detection Kits

Treg细胞检测试剂盒含有预滴定的抗体，使得Treg细胞流式分析变得更加简便。该试剂盒中的试剂经过反复优化，是一款即用型抗体组合产品，适用于人或小鼠Treg细胞的流式检测，使用简便，如同使用单个试剂一样，并且保证实验结果的可靠和高度可重复。

REAfinity™重组基园工程改造抗体

美天妮针对Treg细胞的大部分流式抗体都是REAfinity基因工程重组抗体，有效降低背景信号。与其它流式抗体类似，REAfirtity流抗也可以耦联多种荧光素，如FITC、VioBrightFITC、PE、APC、VioBlue、VioGreen^TM、PE-Vio  770、APC-Vio 770、PerCP-Vio 700等，用于多色流式实验。

图11：流式检测Treg细胞表面活化分子．利用CD4⁺CD25⁺CD127^dim/- Treg cell lsolation Kit , human分选试剂盒从人PBMCs中获得的Treg细胞，然后用PMA／lonomycin刺激，16h后进行流式检测，分别标记Viobility 405/520 Fixable Dye、CD4-APC-Vi0 770、Anti-FoxP3-APC、CD154-VioBlue和

CD137-VioBright FITC。以上数据是基于CD4⁺FoxP3⁺淋巴细胞圈门后的分析结果。

人和小鼠Treg细胞检测试剂盒

 

名称	规格	货号
Treg Detection Kit (CD4/CD25/CD127), human	25 tests100 tests	130-096-076130-096-082

 

用REAFinity重组基因改造抗体精确检测Treg细胞

不同Treg细胞亚群表达不同的表面抗原标记。同时检测膜表面和胞内分子标记，能够更明确地区分不同亚群的Treg细胞。

Treg亚群	表面抗原	胞内抗原	分群
Freshly isolated Tregs	CD4+CD25+CD127dim/-	FoxP3. Helios	P1
Naive Tregs	CD4+CD25+CD127dim/-CD45RA+	FoxP3, Helios	P2
Memory Tregs	CD4+CD25+CD127dim/-CD45RO+	FoxP3, Helios, Ki-67 (partially)	P3

       

           

图12：圈门分析不同的Treg细胞亚群．利用美天旎CD4⁺CD25⁺CD127^dim/-。Regulatory T cell lsolation Kit human试剂盒从人PBMCs中分选Treg细胞，然后染色进行流式分析。通过Viobility 405/520 Fixable Dye和CD4-APC-Vio 770染色鉴定活的CD4⁺细胞．通过标记CD25-VioBright FITC、CD127-PE-Vio 770、Anti-FoxP3-APC、Anti-Helios-PE、CD45RA-PE-Vio 615、CD45RO-VioBlue和Anti-Ki-67-PE标记Treg细胞胞进行圈门分析不同的Treg细胞亚群。

     

 

该应用方案中，利用Treg 扩增试剂盒,人，有效扩增 CD4⁺CD25⁺CD127^dim/– Treg细胞分离试剂盒分离的Treg表达Foxp3。它包括一个Treg细胞完整的工作流程，描述从外周血单个核细胞(PBMCs)分离人Treg细胞，细胞体外扩增，以及随后的流式细胞分析。

01. PBMC分离
免疫密度梯度离心分离PBMC
所需试剂	操作流程
Septube-15密度梯度离心管（PBM,#601115） Septube-50密度梯度离心管（PBM,#601150） ImunoSep™ Density Gradient Cell Separation Medium /淋巴细胞分离液/密度梯度分离液）(PBM,#LSB1077) ImunoSep™ Cell Separation Buffer/细胞分选液（PBM,#604050）	1.将淋巴细胞分离液通过隔板中心的孔注入 SepTube管。 注入分离液的体积请参考下表。
	Septube™密度梯度离心管	起始样本（mL）	密度梯度离心液（mL）
	15	0.5-5.0	4.5
	50	4.0-17.0	17.0
	2. 抗凝血用等体积 ImunoSep™ Cell Separation Buffer/细胞分选液 稀释，混合均匀。如：5 mL 抗凝 血用 5 mL ImunoSep™ Cell Separation Buffer/细胞分选液 稀释。  3. 保持 SepTube管垂直，通过血清移液管将稀释的样品沿 管壁加入管中。样品将会和隔板上方的分离液混合，但不会影响分离效果。  注：样品也可以直接倒入 SepTube®管中，但要小心避免样品通过隔 板中央的小孔直接进入隔板下方的分离液中。 4. 在开启离心机制动器的情况下，室温 1200×g 离心 10 分钟。 注：如果样品在体外超过 24h 以上，建议离心 20 分钟以上。离心力（g）和转速（rpm）转换公式： 注：rpm：每分钟转速；RCF：相对离心力；Radius：离心机转子半 径（cm） 5. 离心完成后，可以将最上层不含细胞的 ImunoSep™ Cell Separation Buffer/细胞分选液 稀释液吸出弃掉，或者直接将包含 MNCs 的上层稀释液直接倒入新的无菌离心管中。请勿倒置 SepTube®管超过 2 秒，以免底层红细胞倒出。 注：离心后，SepTube®隔板上表面可能存在少量红细胞，但这些少量的红细胞不会影响下游实验和细胞分离效果。如果 SepTube®隔板上表面发现有较多的红细胞，可能是由于采血时间较长引起的，此时可以继续 1200×g 离心 10 分钟，以减少红细胞的残留。 6. 向分离的 MNCs 中添加 0.5-1 倍体积 ImunoSep™ Cell Separation Buffer/细胞分选液，室温 300×g 离心 8 分钟洗涤细胞。 注：为去除分离 MNCs 中的血小板，可以关闭离心机制动器，室温120×g 离心 10 分钟洗涤 MNCs。

02. Treg细胞分离
所需试剂	操作流程
CD4+CD25+CD127dim/– 调节性T细胞分选试剂盒(MB，# 130-094-775) LD Columns, 1 for 1×108 labeled cells (MB，# 130-042-901) ImunoSep™ Cell Separation Buffer/细胞分选液（PBM,#604050） MS Columns, 2× per isolation (MB，# 130-042-201) MidiMACS™ Separator (Separator for LD Column), (MB，# 130-042-302) MiniMACS™ Separator (Separator for MS Column), (MB，# 130-042-102) MACS MultiStand (MB，# 130-042-303) (Optional) Pre-Separation Filters, 30 µm (MB，# 130-041-407)	1. 含3%乙酸的亚甲基蓝进行有核细胞计数. 2. 将分离的MNC重悬至1 x 107细胞/40µL。 3. 每1 x 107细胞中加入10 µL 生物素标记的CD4+ CD25+ CD127dim/– T 细胞抗体混合物。 4. 混匀，2-8℃孵育5分钟。 5. 每1 x 107细胞中加入30 µL 缓冲液和20 µL抗生物素磁珠。 6. 混匀，2-8℃孵育10分钟。 7. 用缓冲液将反应体积调整到500µL。 8. 将LD分选柱置于Midi分选器，用2 mL缓冲液润洗分选柱。 9. 将细胞悬液加入分选柱。 10. 收集通过分选柱的细胞。 11. 用2 x 1 mL缓冲液清洗分选柱。收集所有的馏分并与步骤10的细胞混合和。混合后的细胞即为预富集的CD4+细胞。 12. 300 xg离心细胞10分钟，去掉上清。 13. 将细胞重悬至1 x 107细胞/90µL。 14. 每1 x 107细胞中加入10 µL CD25磁珠。 15. 混匀，2-8℃孵育15分钟。 16. 通过添加1-2mL缓冲液和300 x g离心10分钟，清洗细胞。 17. 将细胞重悬至1 x 108细胞/500µL。 18. 将MS分选柱置于Mini分选器，用500µL缓冲液润洗分选柱。 19. 将细胞悬液加入分选柱。 20. 收集通过分选柱的细胞。 21. 用3 x 500µL缓冲液清洗分选柱。收集通过分选柱的未经标记的细胞，并与来自步骤19的细胞混合。 22. 拿出分选柱将其置于一支细胞收集管上。 23. 分选柱中加入1 mL缓冲液，迅速推动分选柱活塞，洗脱磁性标记的细胞 24. 为了提高CD4+CD25+CD127dim/-细胞的纯度，洗脱部分可以在第二个MS柱上再次富集。

03.流式检测
所需试剂	操作流程
Mouse Anti-Human CD4- FITC, FlowCyto™ （PBM,#AH0104110） Mouse Anti-Human CD25- PE, FlowCyto™ （PBM,#AH0225310 ） Mouse Anti-Human FOXP3- APC, FlowCyto™ （PBM,#AK0373210  ） CD4 Monoclonal Antibody (RPA-T4), FITC（ eBioscience，#11-0049-42）   CD25 Monoclonal Antibody (BC96), PE（eBioscience™，#12-0259-41）   FOXP3 Monoclonal Antibody (PCH101), APC（eBioscience™，#17-4776-41）   eBioscience™ Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set（eBioscience™，#00-5523-00）   流式缓冲液（PBM，#222026）   5 mL流式管 (12×75 mm)（corning, #352058）	1. [可选]染色前，将细胞用10 µL纯化的人Fc受体结合抑制剂/50 µL细胞 2-25°C预孵育10-20分钟。 2. 每个管中加入等量的50 µL细胞悬液（105-108个细胞） 3. 将CD4和CD25抗体各5 μL在40 µL的流式细胞术染色液中进行混合并加入到细胞中，使最终的染色体积为100 µL（即50 µL细胞样品 + 50 µL混合好的抗体混合物）。 轻轻地涡旋混合。 4. 2-8°C或冰上孵育30分钟以上。避光。 5. 加入流式细胞术染色液洗涤细胞。对于微量滴定板，使用2 mL/管或200 µL/孔。 在室温下400-600 x g离心5分钟。 弃上清。通常保留约100 μL残余体积。 6. 向每个管中加入1 mL Foxp3固定/破膜缓冲液并涡旋 7. 2-8°C或室温孵育30-60分钟。避光。 8. 每管加入2 mL 1x透化液，在室温下400-600 x g离心样品5分钟。 弃上清。 9. [可选]重复第8步。 10. 在剩余体积的1x破膜液中重悬沉淀。通常为100 μL。 11. [可选]直接向细胞中加入2 μL 2％正常小鼠/大鼠血清封闭。在室温下孵育15分钟。 12. 不洗涤，加入5 μL FoxP3荧光抗体，并在室温下孵育30分钟以上。避光。 13. 每管加入2 mL 1x破膜液，在室温下400-600 x g离心样品5分钟。 弃上清。 14. 重复第13步。 15. 将染色细胞重悬于适当体积的流式细胞术染色液中。 16. 通过流式细胞术分析样品。

04.Treg细胞激活、扩增
所需试剂	扩增流程
HapClut™人T细胞扩增培养基(PBM,#661350) Anti-human CD3，Functional Grade(功能性抗体/T细胞激活剂）(PBM,#AH1003125） Anti-human CD28，Functional Grade(功能性抗体/T细胞激活剂)（PBM,#AH1028125） CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), Functional Grade, eBioscience™(eBioscience,#16-0037-81) CD28 Monoclonal Antibody (CD28.2), Functional Grade, eBioscience™(eBioscience,#16-0289-81) 重组人IL-2(PeproTech,#200-02-10)	抗体包被微孔板 1. 用无菌 PBS 稀释 Anti-human CD3 功能抗体 (PBM#AH1003110)包被抗体，浓度为 5~10 µg/mL。 2. 向 96 孔板中加入抗体包被，每孔 50 μL。对照孔加 50 μL 无菌 PBS。 3. 盖上微孔板盖，放置于 37℃恒温培养箱，孵育 2 小时或放置 4℃过夜包被。 4. 在接种细胞之前，吸出微孔板中的液体，然后加入 200 μL 无菌 PBS 洗涤微孔 2 次（注意不要刮划 包被的微孔板底部），同时防止微孔干燥。 扩增培养 T 细胞 1. 制备人 PBMC 或 T 单细胞悬液。 2. 进行细胞计数，300×g 离心 10 分钟洗涤细胞。 3. 去除上清后用 T 细胞扩增培养基重悬细胞，加入适量的培养基调整细胞浓度至 106/mL。 4. 向细胞悬液中加入 hIL-2(Peprotech #200-02-10)至终浓度 50 ng/mL，Anti-human CD28 功能抗体 (PBM#AH1028110)至终浓度 2 µg/mL 进行共刺激。 5. 接种细胞到包被好的微孔板中，每孔接种细胞悬液 200 μL，37℃, 5% CO2孵育培养。 6. 培养 2~4 天。可收集细胞或每两天进行一次半量换液继续培养。 注：6-8 天，T 细胞处理静止期，可再次刺激继续培养扩增。

 

 

 

 

 

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返回  Treg (调节性T细胞)一站式研究工具

试剂和材料

 

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货号	名称
11-0049-42	CD4 Monoclonal Antibody (RPA-T4), FITC, eBioscience
12-0259-41	CD25 Monoclonal Antibody (BC96), PE, eBioscience™
17-4776-41	FoxP3 Monoclonal Antibody (PCH101), APC, eBioscience™
00-5523-00	eBioscience™ FoxP3 / Transcription Factor Staining Buffer Set 破膜液套装
00-4222-26	eBioscience™ Flow Cytometry Staining Buffer 流式染色液
352058	5 mL流式管

操作步骤

 

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1. [可选]染色前，将细胞用10 µL纯化的人Fc受体封闭/50 µL细胞 2-25°C预孵育10-20分钟。

2. 每个管中加入等量的50 µL细胞悬液（10⁵-10⁸个细胞）

3. 将CD4和CD25抗体各5 μL和40 µL的流式细胞术染色液进行混合均匀并加入到上述50 µL细胞悬液中，使最终的染色体积为100 µL（即50 µL细胞样品 + 50 µL混合好的抗体混合物）。 轻轻地涡旋混合。

4. 2-8°C或冰上孵育30分钟以上。 避光。

5. 加入流式染色液洗涤细胞。 在室温下400-600 x g离心5分钟。 弃上清。通常保留约100 μL残余体积。

6. 向每个管中加入1 mL FoxP3固定/破膜缓冲液并涡旋。

7. 2-8°C或室温孵育30-60分钟。 避光。

8. 每管加入2 mL 1x透化液，在室温下400-600 x g离心样品5分钟。 弃上清。

9. [可选]重复第8步。

10. 在剩余体积的1X破膜液中重悬沉淀。 通常为100 μL。

11. [可选]直接向细胞中加入2 μL 2％正常小鼠/大鼠血清封闭。 在室温下孵育15分钟。

12. 不洗涤，加入5 μLFoxP3荧光抗体，并在室温下孵育30分钟以上。 避光。

13. 每管加入2 mL 1X破膜液，在室温下400-600 x g离心样品5分钟。 弃上清。

14. 重复第13步。

15. 将染色细胞重悬于适当体积的流式细染色液中。

16. 进行流式细胞分析样品。

 

 

 

 

 

调节性T细胞（Treg）经CD3\CD28\CD2刺激活化后能够抑制应答细胞CD4⁺CD25^-( Tresp）和CD8⁺ T细胞的活化和增殖。Treg一旦被活化，其免疫抑制作用即为非抗原特异性，并且这种免疫抑制性不具有MHC限制性，能够抑制同种同型或同种异型CD4⁺CD25^-（Tresp）和CD8⁺T细胞的活化、增殖。除此之外，Treg还能对NK细胞的增殖、细胞因子分泌、单核/巨噬细胞、树突状细胞、B 细胞等免疫活性细胞起到抑制作用。

Treg抑制功能检测

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流式检测Treg抑制功能试验

 

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试剂和材料

 

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货号	名称
65-0840-85	eBioscience™ Cell Proliferation Dye eFluor™ 670
65-0842-85	eBioscience™ Cell Proliferation Dye eFluor™ 450
65-0850-84	eBioscience™ CFSE
07060	3% Acetic Acid + Methylene Blue, 100mL

Treg对CD8⁺T细胞抑制功能检测操作流程

 

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方式一：培养皿未经抗体包被

Day 0（分选）

1．用eFluor 450标记的细胞增殖染料标记外周血单个核细胞（PBMC）

简要步骤如下：      1)用PBS洗涤细胞2次，含3%乙酸的亚甲基蓝（#07060）进行细胞计数，然后用PBS调整细胞浓度至2×107细胞/mL。      2)用无菌PBS稀释增殖染料（10 mM母液）至10µM，混合1mL染料和1mL细胞，终浓度分别达到5 µM和1×107细胞/ mL），涡旋。37℃,避光孵育10分钟。      注：不同批次染料进行试验之前应通过滴定试验，以确定最佳染色浓度。     3)通过添加5倍体积含10% FBS的Immunocult™- XF T细胞扩增培养基终止标记。冰上孵育5分钟。     4)离心沉淀细胞团，弃去上清。     5)用Immunocult™-XT细胞扩增培养基（不含FBS）洗涤细胞2次     6)含3%乙酸的亚甲基蓝（#07060）进行细胞计数，调整细胞浓度至2×106细胞/mL。

2. 用EasySep人CD4⁺CD127^lowCD25⁺ 分离试剂盒（Stemcell，#18063）分离Treg细胞(CD4⁺CD25⁺CD127^low)和应答细胞Tresp(CD4⁺CD25^-)。

3.300×g离心分离的Treg和Tresp细胞10分钟。用Immunocult™-XF T细胞扩增培养基洗涤细胞2次。重悬细胞至1×10⁶细胞/mL，然后梯度稀释至0.5×10⁶细胞/mL和0.25×10⁶细胞/mL。不同浓度将用于1：1，1：2和1：4（试验孔Treg：PBMC和阴性对照孔Tresp+PBMC）条件的培养。

4.吸取50 µL步骤1中被染料标记的PBMC(1×10⁵细胞)加入到96孔圆底培养板中。

5.按照浓度，在每孔中加入100 µLTreg或Tresp。

6.在培养基中添加50 µL CD3/CD28活化剂。

    注意：做不同浓度的滴定试验是有必要的。将激活剂10µL/mL稀释到2.5µL/mL、20µL/mL到终浓度5µL/mL和40µL到终浓度10µL/mL。

7.预留额外的未经eFluor 450标记的PBMC培养孔作为FAC分析的对照。

8.37℃，5% CO₂条件下孵育4天。

9.离心培养板，弃去上清液。

10.在含20% BSA和1mM EDTA的PBS中加入Fc阻滞剂（StemSep™ Anti-Human CD32 Blocker，#14551）使其终浓度为1µg/mL，并在每孔加入50µL。室温孵育10分钟。

11.离心培养板，弃去上清液。

12.用含2% BSA和1mM EDTA的PBS重悬细胞，含CD45抗体（可选），CD8和CD4抗体并根据标准流程标记。

13.准备合适的单染和对照。　

方式二: 培养板被CD3/CD8 T 细胞激活剂包被

    Day-1(实验提前1天准备包被培养板)

    1.准备激活剂：试验发现5µL/mL效果好，但是不同的浓度还需通过滴定试验来检测。推荐准备5µL/mL，10µL/mL和20µL/mL用PBS稀释的激活剂溶液，吸取50µL加入96孔平底培养板的孔中。

    2. 4℃，过夜孵育培养板，然后封闭，如下所述。

    注：激活剂也可以在检测当天37℃孵育2小时。

Day 0

1. 将培养孔中的激活剂吸出，用PBS(100 µL/孔)洗涤培养孔2次。

2. 加入50µL含2% BSA的PBS封闭，并在37℃孵育30分钟至1小时。吸出孔中的PBS然后用不含BSA的PBS洗涤培养孔2次，然后按照流程1中描述的比例加入PBMC+Tregs，PBMC+Tresp混合液。使Immunocult-XF培养基达到终体积200 µL。无需加入另外的激活剂。到第4天的时候，细胞已经达到足够数量用于抑制性检测。

Day 4(分析)

1.离心培养板，弃去上清液。

2.在含20% BSA和1mM EDTA的PBS中加入Fc阻滞剂（StemSep™ Anti-Human CD32 Blocker，#14551）使其终浓度为1µg/mL，并在每孔加入50µL。室温孵育10分钟。

3.离心培养板，弃去上清液。

4.用含2% BSA和1mM EDTA的PBS重悬细胞，含CD45抗体（可选），CD8和CD4抗体并根据标准流程标记。

5.准备合适的单染和对照。

    注：用额外激活的未标记的PBMC和e450标记的PBMC作为未染色和单染的对照。

6.用细胞活性染料（如7AAD）染色去除死细胞。

7.分析，设门先观察活细胞，再看CD45，然后看CD8/CD4。

 

检测体系设3次重复实验。

 

 

 

 

 

 

 

1. 1. Treg调节性T细胞分选攻略

2. 2. T细胞的培养

3. 3. Treg 细胞鉴定

4. 4. Treg细胞的调节功能检测

 

 

从患者的外周血中分离富集高纯度的Treg细胞，在CD3和CD28抗体的刺激下体外培养，伴随适当剂量的IL-2，可以扩增得到大量的Treg细胞，并且在流式分析检测后，转移至患者体内，有可能在体内发挥良好的免疫调节作用。

 

01.Treg分离

人Treg细胞的表型为CD4+CD25high并高表达转录因子FoxP3，CD127的表达与FoxP3的表达呈负相关，去除CD4⁺CD25^high细胞群内的CD127^high细胞可富集高表达FoxP3以及具有高扩增潜能的Treg亚型。通过使用红细胞裂解液（#07800/07850或#00-4333-57）裂解红细胞、羟乙基淀粉（#07906）沉降红细胞或者用密度梯度离心管（ #601115/601150/86450）和淋巴细胞分离液（#07801/07851）进行密度梯度离心去除外周血中的红细胞，从而获得MNC或者PBMC。再利用免疫磁珠分选试剂盒（#18063）等分选高纯度的Treg细胞。

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货号	名称
07801/07851	Lymphoprep淋巴细胞分离液
86415	SepMate-15 密度梯度离心管
86450	SepMate-50密度梯度离心管
601115	Septube  15 密度梯度离心管
601150	Septube 50 密度梯度离心管
07800/07850	红细胞裂解液
00-4333-57	1X RBC红细胞裂解缓冲液
00-4300-54	10X RBC 红细胞裂解缓冲液
07906	HetaSep Solution,   100mL
07060	3% Acetic Acid +   Methylene Blue, 100mL
717805	Brand 血细胞计数板，Neubauer型
15861	人CD4+CD127lowCD25+Treg细胞完整试剂盒
18062	EasySep   CD4+CD25+Treg分选试剂盒
18063	EasySep™ 人CD4+CD127lowCD25+ Treg分选试剂盒
130-094-775	CD4+CD25+CD127dim/-   人Treg 分选试剂盒 II
602005	分选磁极
130-042-401	LS Separation   columns
130-042-901	LD separation   columns
130-042-303	MACS MultiStand
130-042-102	MiniMACS Separator
130-091-376	MACS BSA Stock   Solution 6 x 75 ml
130-091-222	autoMACS Rinsing   Solution 6 x 1,45 L
205025	细胞分选缓冲液

 

02.Treg鉴定

分离得到的Treg可以通过特异性标记CD4\CD25\CD127或者胞内转录因子FoxP3抗体（#17-4776-41）进行流式鉴定，从而确定分选纯度。由于FoxP3是胞内表达，因此检测时，需要进行破膜处理。FoxP3 / Transcription Factor Staining Buffer Set（#00-5523-00）专利配方设计和优化，可使用抗体对转录因子和核蛋白（例如 FoxP3 和 Ki-67）以及细胞因子和趋化因子进行核内染色。

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货号	名称
11-0049-42	CD4 Monoclonal   Antibody (RPA-T4), FITC, eBioscience™
12-0259-41	CD25 Monoclonal   Antibody (BC96), PE, eBioscience™
17-4776-41	FoxP3 Monoclonal   Antibody (PCH101), APC, eBioscience™
00-5523-00	eBioscience™   FoxP3 / Transcription Factor Staining Buffer Set金标准
00-4222-26	eBioscience™ Flow   Cytometry Staining Buffer
352058	5 mL流式管

 

03.Treg激活扩增

RPMI 1640培养基（#11875093）中添加抗CD3（#16-0037-81）和CD28（#16-0289-81）单克隆抗体或者CD3/CD28激活剂（#10971）和人细胞因子IL-2（#200-02-10），添加人血清对人Treg进行体外扩增。ImmunoCult-XF（#10981）是一款无异种动物源的T细胞的扩增培养基，可用于Treg细胞的培养。另外，由于分离的Treg细胞中不可避免的混有一定量的应答T细胞，因此通常在培养Treg的时候加入抑制性药物雷帕霉素（RAPA）用以进行选择性扩增。RAPA能够抑制应答T细胞的扩增，从而提高体外扩增Treg的纯度。

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货号	名称
11875093	RPMI 1640 Medium
200-02-10	Human IL-2
5318893	雷帕霉素
03-031-5C	青链双抗，10浓缩液
904705	Human serum
10981	ImmunoCult-XF T   Cell Exp Medium, 500 mL
10970	ImmunoCult   HuCD3/CD28/CD2 TCellAct, 2mL
10971	ImmunoCult Hu   CD3/CD28 TCell Act, 2 mL
00-4506-51	eBioscience™   Brefeldin A Solution (1000X)
00-4978-03/93	eBioscience™   Concanavalin A (Con A) Solution (500X)
00-4977-03/93	eBioscience™   Phytohemagglutinin-L (PHA-L) Solution (500X)
00-4970-03/93	eBioscience™ Cell   Stimulation Cocktail (500X)
00-4505-51	eBioscience™   Monensin Solution (1000X)
16-0037-81	CD3 Monoclonal   Antibody (OKT3), Functional Grade, eBioscience™
16-0289-81	CD28 Monoclonal   Antibody (CD28.2), Functional Grade, eBioscience™
16-0039-81	CD3 Monoclonal   Antibody (HIT3a), Functional Grade, eBioscience

 

04.T reg调节功能检测

Treg细胞经CD3\CD28刺激活化后能够抑制应答细胞CD4⁺CD25^-( Tresp）和CD8⁺ T细胞的活化和增殖。Treg一旦被活化，其免疫抑制作用即为非抗原特异性，并且这种免疫抑制性不具有MHC限制性，能够抑制同种同型或同种异型CD4⁺CD25^-（Tresp）和CD8⁺T细胞的活化、增殖。除此之外，Treg还能对NK细胞的增殖、细胞因子分泌、单核/巨噬细胞、树突状细胞、B 细胞等免疫活性细胞起到抑制作用。 将分离的Treg细胞与CFSE（#65-0840-85）标记的应答细胞（Tresp）或者CD8T细胞共培养，流式检测CFSE的荧光强度。通过CFSE的荧光强度确定细胞的增殖情况。

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货号	名称
65-0850-84	eBioscience™ CFSE
07060	3% Acetic Acid +   Methylene Blue, 100mL
65-0840-85	eBioscience™ Cell   Proliferation Dye eFluor™ 670
65-0842-85	eBioscience™ Cell   Proliferation Dye eFluor™ 450

 

05.Treg冻存

培养的Treg细胞，可以用无血清冻存液Cryostor CS10（#07930）进行低温冻存。如果进行短距离运输，还可使用HypoThermosol FRS（#07934）进行4℃保存，无需担心由于冻存复苏影响细胞活力。

 

货号	名称
07930	Cryostor CS10
07932	CryoStor CS2
07933	CryoStor CS5
07939	BloodStor 100,   100mL
07934	HypoThermosol FRS,   10mL, Bundle
	细胞冻存管、冻存盒、液氮罐

 

 

 

 

 

 

MACS ®分选技术采用无毒、可降解、50nm超顺磁磁珠结合分选柱分离细胞。具体流程为：首先用抗体偶联的纳米磁珠标记细胞，然后将标记后的细胞加入专用分选柱，被抗体偶联磁珠标记的细胞吸附在分选柱内，而未经标记的细胞自然流出，从而达到将标记细胞和未标记细胞分离开，分离得到高纯度、高活性目的细胞。

利用各类MACS~细胞分选产品，您可以根据实验需求自由地选择细胞分选方案，更加灵活、可靠。

那么，MACS技术为何如此独特呢？因为它不仅结合了公认可靠的细胞磁性分选技术，更可以满足灵活多变的用户需求——涵盖了从基础研究到临床应用的全套细胞分选方案。  

MACS产品让您的研究方案拥有无与伦比的灵活性，提供结合纳米级磁珠的有柱式分选技术和结合微米级磁珠的无柱式分选技术。

阅读本文，让我们一起来探讨如何利用MACS技术为您的研究带来全新的改变吧！

	纳米级磁珠	微米级磁珠
优势	- 最全面的细胞分选技术  - 适用于几乎任何物种或样本 - 适用范围广——从基础研究到临床应用	-直接从全血分离细胞，仅需20分钟 -无需密度梯度离心 -最大化减少样本处理步骤，保证结果的高度可重复
组成	-MACS分选 -MACS分选器柱 -MACS磁珠	-MACSxpress分选器 -MACSxpress磁珠
起始样本	-外周血单个核细胞(PBMC) -全血  -骨髓 -组织来源的单细胞悬液	-全血
	MACS磁性细胞分选技术	MACSxpress全血分选技术

MACS分选柱                 最温和的细胞分选方法

• MACS分选柱的优势

MACS分选柱作为MACS磁分选技术的核心部分，内部填充专利的超顺磁铁珠。基于其独特设计和内部基质构造，使用MACS分选柱能获得高纯度、高活力的目的细胞，从而为细胞分选提供理想的解决方案，并且不受细胞类型或样本体积限制。

 - 仅用最少量的纳米级磁珠标记，就足以高效分离目的细胞：

 - 细胞可以自由流出，过程温和：

 - 便于向临床应用转化，基于MACS技术的CliniMACS CD34试剂系统，已通过美国FDA认证。

• 探索一切可能

基于MACS分选柱的磁性细胞分选策略适用于任何细胞类型，且不受样本体积限制。

 - 手动分选系统适用于小样本量的细胞分选

 - 利用MultiMACS^TM Cell 24 Plus分选仪可以进行高通量磁性细胞分选，最多处理24个样本

 - 使用autoMACS~ Pro分选仪可以进行全自动磁性细胞分选

如果您的研究比较特殊，可联系当地的技术支持，订制个性化细胞分选方案。

手动细胞分选： 最多可同时处理8个样 本，使用方便，实验室 都可轻松配备。		全自动磁性细胞分选： 可同时处理多个样本， 全自动、标准化， 结果可重复性高。
半自动化细胞分选： 最多可同时处理24个样 本，实现快速、高质量 的细胞分选。		将自动化流水线整合到 细胞分选方案中，迸一 步简化工作流程。

图1：从MACS手动分选器到整合MACS设备的自动化流水线系统。MACS分选柱及填充基质是实现快速、高效细胞分选的关键，为您的生命科学研究提供全方位的支持。

 

MACS分选柱                 最强的磁场、最少量的细胞标记

                         有柱式磁性细胞分选技术的优势                                                 无柱式磁性细胞分选技术的弊端

分选柱基质

根据分选柱类型的不同，填充基质球体(A)

直径介于250-500 um之间。

在分选柱的基质内，球体之间的距离是淋巴

细胞(B)体积的20倍。

  

 

MACS分选柱---实现最佳分选效果的分选柱选择策略

有柱式细胞分选在维持目的细胞的状态、表面表位完整的同时可令细胞分选过程达到最高的性能。选择最满足应用的分选柱是关键，

方能在保证高纯度的同时实现高回收率。

为了选择最适分选柱，您首先需要考虑如下几个问题：

1．您使用MACS Cell lsolation还是MACS MicroBeads?

2．目的细胞类型是常见细胞还是罕见细胞？抗原表达强还是弱？

3．您需要分选多少细胞？

 

      

稀有细胞分选

通常表达频率<5%被认为是稀有细胞，在阳性分选中连续使用2个分选柱，可实现更高的分选纯度：用一根分选柱做第一次分选，阳性成分再过一次新的分选柱。

大细胞、植物细胞分选

Large Cell column专门用来分选植物细胞、原生动物或者比较大的哺乳动物细胞，如皮肤朗格汉斯细胞、巨核细胞和神经元等。

MACS分选器---搭配适配的分选器

 

MACS分选器是磁性细胞分选不可缺少的部件，美天旎为您提供定制化的实验方案，您可以通过下面列表来选择合适的分选器和耗材。

-手动细胞分选：为您提供简便、直观且可靠的细胞分选方法。

-多样本的自动化分选：MultiMACS^TM Cell 24和autoMACS Pro分选仪为您提供高通量、自动化的细胞分选方案，标准化操作，结果更可靠，高度可重复。

 

	MiniMACS分选器（#130-042-102）	OctoMACS分选器	MidiMACS分选器	QuadroMACS分选器	autoMACS Pro分选器	MultiMACS Cell24分选器
分选器
分选柱	MS Columns （#130-042-201）， Large Cell Columns	MS Columns （#130-042-201）， Large Cell Columns	LS Columns（#130-042-401）,LD Columns（#130-042-901）, Whole Blood  Columns	LS Columns（#130-042-401）,LD Columns（#130-042-901）, Whole Blood Colums	autoMACS Columns	Multi-24Column Block,LS Columns（#130-042-401）,LD Columns（#130-042-901）, Whole Blood  Columns,
可容纳的总细胞量	MS: 2x108 Large Cell：2x108	MS: 2x108 Large Cell：2x108	LS: 2x109 LD:5x108 Whole blood:up  to 15 mL blood	LS: 2x109 LD:5x108 Whole blood:up  to 15 mL blood	4x109 cells or 15  mL whole blood	Multi-24 Column Block: lx109 LS: lx109 LS:2x109 LD: 5x108 Whole blood: 10 mL blood
可容纳的标记细胞量	MS: 1x107 Large Cell: 1x107	MS: 1x107 Large Cell: 1x107	LS: 1x108 LD:1x108	LS: 1x108 LD:1x108	2x108cells	Multi-24 Column Block: lx108 LS: lx108 LD:1x108

 

MACS分选器起始套装
MiniMACSTM和MidiMACSTM分选器一分选不可或
	MiniMACS Starting Kit（130-090-312）   MidiMACS Starting Kit(130-042-301)   LD MidiMACS Starting Kit (130-090-329)    Mini& MidiMACS Starting Kit (130-042-501)    Mini& MidiMACS Starting  Kit (MS, LD) (130-091-632)	1个MiniMACS Separation Unit; 1 MACS  MultiStand 25 MS Columns;可选择一款MACS分选试剂   1个MidiMACS Separation Unit; 1 MACS  MultiStand ; 25 LS Columns;可选择一款MAC5分选试剂 1 MidiMACS Separation Unit;1 MACS MultiStand; 25 LD Columns;可选择一款MACS分选试剂 1 MiniMACS Separation Unit;1 MidiMACS Separation Unit；1 MACS  MultiStand; 25 MS Columns; 25 LS Columns;可选择一款MACS分选试剂 1 MiniMACS Separation Unit;1MidiMACS Separation Unit；1 MACSMultiStand; 25 MS Columns; 25 LD Columns;可选择一款MACS分选试剂

OctoMACSTM Separator -用于多个样品同时分选
OctoMACS Starting Kit (130-042-108)	1 OctoMACSTM Separation Unit;1 MACS MultiStand; 25 MS Columns；可选择一款MACS分选试剂

 

QuadroMACSTM Separator -用于多个样品同时分选
	QuadroMACS Starting Kit  (130-091-051)	1 Quadro Separation Unit;1 MACS Multi5tand; 25LS Columns； 1 MACS 15 mL Tube Rack；可选择一款MACS分选试剂

纳米级磁珠，结合MACS分选柱                MACS磁珠，最巧妙的磁性细胞分选方法

 

仅需简单三步

从您的样本中得到高活性的目的细胞不再是困难的事情。使用美天旎MACS磁分选技术将会大大简化您的实验流程，只需三步即可！

 

1. 磁性标记                                        2.磁性分选                                   3.洗脱标记的细胞

最灵活、最温和的细胞分选方法

目前，基于纳米级磁珠的细胞磁分选策略主要有两种：有柱式分选和无柱式分选。MACS磁分选技术是利用纳米级超顺磁磁珠的有柱式分选，对此，我们有长期成功的经验。MACS分选柱中会形成高强度的梯度磁场，也只有采用有柱式分选技术才能确保将较少磁性标记的细胞分选出来，得到高活眭、活化状态不受影响的目的细胞。

MACS有柱分选技术优势

电镜观察从人PBMC中分离得到的单核细胞：（A）采用MACS有柱分选技术，分选的细胞表面无可见的磁珠，细胞膜表面特性无变化。（B）采用无柱分选技术，分选的细胞表面会结合大量的磁珠残留（箭头所示），并且细胞的形态已发生改变。进行流式分析时，SSC和FSC分析的细胞群将向右上角偏移。

项目	有柱分选	无柱分选
磁珠大小	50nm	＞100nm1
细胞回收率	＞70%	20%-70%
细胞纯度	＞90%	50%-80%
流式检测变化情况	无变化	SSC上移， FSC右移2
细胞分选后颜色变化	无变化	细胞颜色呈现磁珠试剂样棕色3
临床应用验证	无毒，可生物降解 ；FDA批准可用于临床4	不可用于临床应用

1.无柱分选，细胞在进行无柱阳性分选时细胞回收率较低。

2.无柱分选中，由于磁珠滤径较大，分选后的细胞，在流式分析时，FSC,SSC细胞群向右上角漂移。

3.无柱阳性分选的细胞结合磁珠大滤径的磁珠，细胞颜色发生变化。

4.FDA批准临床分选CD34细胞，T细胞应用于患者治疗。

纳米级磁珠，结合MACS分选柱---提高实验结果的可靠性

MACS阳性细胞分选技术，最大限度减少对靶细胞的影响

置于分选器中时，MACS分选柱中会产生强大的梯度磁场，因此，只需要少量磁珠标记即可完成高效的细胞分选，确保细胞表面剩余足够的抗原表位用于后续实验，如荧光染色和流式检测等（图4）。

此外，MACS磁珠标记浓度低、体积小，分选过程中不会激活靶细胞，不影响其分选后的活化状态（图5）。

图4：从4mL全血中分离得到的CD138+细胞。右上图采用的是美天旎CD138全血磁珠和全血分选柱分选的结果：右下图采用其他厂家的CD138纳米磁珠和无柱式分选。左边的图代表原始的全血样本。细胞用CD45、CD19和CD138抗体孵育，然后进行流式检测。结果显示：使用美天旎MACS技术进行有柱式分选得到的细胞在后续的流式检测实验中，才能得到真实可靠的结果。

图5：用美天旎有柱式分选技术和其他厂家无柱式分选技术对人B细胞进行富集后活化状态检测情况比较。将得到的B细胞分别进行直接

检测，或分别在含有B细胞刺激因子(CD40-Ligand/Anti—His抗体和IL-4)或不合刺激剂的培养基中培养7天后，用流式检测其表面的活

性标记物，CD69、CD80及CD86。

 

之所以强调最小量的细胞标记，是因为我们更关注您的下游实验应用 -分选出来的细胞可以直接用于任意下游实验 -保留原有的细胞特性 -从科研到临床转化应用，无缝对接

 

MACS阴性细胞分选技术：获得真正untouched细胞

使用MACS磁珠进行阴性分选能够让您获得真正untouched的细胞。正是由于分选柱的存在，将磁场放大，才能保证最少的磁珠标记即足以去除非目的细胞，避免非特异性结合，使目的细胞上完全没有磁珠残留。然而，若使用纳米级无柱式分选技术，则需要加入高浓度的磁珠，才足以去除非目的细胞，增加磁珠非特异性结合的几率，从而使目的细胞上有磁珠残留的风险（图6）。

图6：分别使用美天旎MACS Monocyte lsolation Kit，human试剂盒(A)以及其他厂家的无柱式磁分选试剂盒(B)，采用阴选的方法分选单核细胞，随后分别用CD14/CD16抗体（红色）以及Dextran抗体（绿色）进行染色，在荧光显微镜下观察。结果显示，MACS分选得到的目的细胞非常干净，无磁珠结合；而无柱式分选获得的目的细胞上残留非特异结合的磁珠。

 

纳米级磁珠，结合MACS分选柱---为您的研究选择正确的磁珠

MACS磁分选技术-适用于基础科研和临床应用，最值得信赖的产品

基于分选柱的MACS磁分选技术为您提供最灵活，最成熟的细胞分选方案。

-既可分选常见的细胞类别又可分选稀有细胞

-为基础科研和临床应用提供最成熟的技术支撑

-已有超过35，000例临床细胞应用案例

UltraPure系列磁珠减少细胞碎片，从而得到高质量的实验结果

 

UltraPure系列磁珠适合所有类型的细胞分离，包括稀有细胞的分离。当初始样本合有较多细胞碎片时，美天旎的UltraPure系列磁珠就能够为您的实验提供令人信服细胞分选结果。

 

图7：分别使用美天旎UltraPure CD34试剂盒结合有柱式MACS分选技术（上图）和其他厂家的无柱式CD34磁珠产品（下图）同时分选CD34细胞。结果显示，相对于无柱式分选，Ultra Pure系列磁珠结合分选柱得到的细胞活性更好，细胞碎片更少。使用美天旎Whole Blood全血磁珠来分选目的细胞，不需要进行红细胞裂解，亦无须进行密度梯度离心步骤。

全血磁珠——分选目的细胞最快速、最简便的方法

 

使用美天旎Whole Blood全血磁珠来分选目的细胞，不需要进行红细胞裂解，亦无须进行密度梯度离心步骤。

全血磁珠大大简化了您的实验流程，并且最大限度减少手动操作步骤，从而保证了在最短时间内获得高回收率、高活性的目的细胞。此外，由于省去了离心步骤，操作更安仝，尤其是处理未经检测的血样。值得一提的是，Whole Blood全血磁珠也可以用于骨髓样本中目的细胞的分离。

-分选过程温和，获得的目的细胞得率高、活性好

-操作更安全，尤其对于危险的血液样本

-操作流程简单，节省时间

纯化后的细胞适用于下游实验，包括流式分析、细胞分选、以及体外实验等。

目前美天旎Whole Blood全血磁珠产品可用于CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD14⁺、CD15⁺、CD19⁺、CD33⁺、CD45⁺、CD56+、CD66b⁺和CD138⁺细胞的分选。

 

从全血样本中全自动分选目的细胞 用美天旎autoMACS Pro磁性细胞分选仪，结合Whole Blood全血磁珠，可以从全血样本中进行全自动的细胞分选，标准化程序，结果更可靠。autoMACS Pro磁性细胞分选仪可以处理0.25-15 mL的样本，并且该仪器具有全自动磁珠孵育、传感器自动控制、自动启动、关机、自动清洗等功能，真正实现全自动的细胞分选。

 

微米级磁珠---快速分离目的细胞

MACSxpress技术——直接从全血中分离目的细胞

MACSxpress全血分选技术能快速、大规模地从全血中分选目的细胞，并且不需要离心。虽然是微米级磁珠，但同样只需少量磁珠标记目的细胞即可，因此不会导致磁珠的非特异性结合以及目的细胞活化（图8）。

MACSxpress全血分选技术用免疫磁珠标记非目的细胞进而将其去除，获得高纯度的目的细胞。同时，红细胞会因沉降过程而去除，进一步提高目的细胞的纯度。

-20分钟内完成全血中目的细胞的分选；

-无需离心；

-磁珠与细胞结合量少，因此不会活化目的细胞。

图8：用美天旎MACSxpress lsolation Kit和MACSxpress分选器，或用其他厂家的纳米级磁珠进行无柱式细胞分选，从全血中分选中性粒细胞。分选前后的细胞都用CDllb和CD62L流抗标记，进而进行流式检测，对比可见，MACSxpress磁珠不会改变细胞的活化状态，而用其它厂家的无柱式分选磁珠分选后会导致中性粒细胞的活化。

 

图9：MACSxpress全血细胞分选技术基本原理。

充分利用MACS技术的优势---选择最恰当的细胞分选方案

 

纳米级磁珠	阳性分选策略（标记目的细胞）	阴性分选策略（标记非目的细胞）
MACS有柱式磁分选技术	·尽可能少的磁珠标记   ·不影响细胞特性和活化状态	·目的细胞上无非特异性结合的磁珠 ·不影响细胞特性和活化状态
无柱式磁分选技术	·大量磁珠标 ·影响细胞特性和活化状态记	·目的细胞上残留非特异性结合的磁珠 ·影响细胞特性和活化状态
微米级磁珠	阳性分选策略（标记目的细胞）	阴性分选策略（标记非目的细胞）
MACSxpress全血分选技术	·为避免激活细胞，不建议用于阳性分选	·不会激活目的细胞

 

 

Products for the isolation of human T cells

T cells

CD3 MicroBeads# 130-050-101 Whole Blood CD3 MicroBeads#130-090-874 ImunoSep Human T cell enrichment kit/人T细胞富集分选试剂盒（710205，710210,710220）		CD2 MicroBeads#130-091-114 Pan T cell isolation Kit Ⅱ#130-091-156		CD6 MicroBeads# 130-091-264
CD4+T cells	Treg  cells	DN T cells	CD8+ T cells	γ/δ + T Cells	NKT Cells
人CD4 T细胞富集分选试剂盒 （710405,710410,710420）	CD4+CD25+ Regulatory T cell Isolation  Kit# 130-091-301	Double-negative T Cells Isolation Kit # 130-092-614	人CD8 T细胞富集分选试剂盒   (710805,710810,710820)	Anti-TCRγ/δ Micobead Kit#130-050-701	CD3+CD56+ NKT Cell Isolation Kit# 130-093-064
CD4 MicroBeads # 130-045-101	CD4+CD25+CD127dim/- Regulatory T cell Isolation Kit Ⅱ # 130-094-775		CD8 Micobeads# 130-045-201	TCRγ/δ + T Cell Isolation Kit# 130-092-892	Anti-INKT Micobeads # 130-094-842
Whole Blood CD4 MicroBeads # 130-090-877	CD25+CD49d- Regulatory T cell Isolation Kit # 130-094-551		Whole Blood CD8 MicroBeads # 130-090-878
CD4+ T cell isolation Kit Ⅱ #130-091-155	CD4+CD25+CD45RA+ Regulatory T Cell isolation Kit # 130-093-631		CD8+ T cell isolation Kit # 130-094-156

 

Activated T cell subsets
CD25 MicroBeadsⅡ# 130-092-983 CD30 MicroBeadsⅡ# 130-051-401 Pre-selection of CD4+ T cells with： CD4+ T Cell Isolation Kit Ⅱ# 130-091-155 CD4 MultiSort Kit# 130-055-101	CD69 MicroBead Kit Ⅱ# 130-092-355 CD154 MicroBead Kit# 130-092-658	CD137 MicroBead Kit# 130-093-476 Pre-selection of CD8+ T cells with： CD8+ T Cell Isolation Kit# 130-094-156 CD8 MultiSort Kit# 130-055-201

 

CD4+ T cell subsets
CD4+ RTE		Naive CD4+ T cells		Skin-homing T cells
CD4+ Recent Thymic Emigrant Isolation Kit # 130-094-299		人CD4 naïve T细胞富集分选试剂盒  （710505,710510,710520）		CD4+CLA+ T Cell Isolation Kit # 130-092-435
		Naive CD4+ T Cell Isolation KitⅡ # 130-094-131
		Pre-selection with: CD 4+ T cell Isolation Kit Ⅱ
		CD62L MicroBeads# 130-091-758		Anti-CLA MicroBead Kit# 130-092-464
		CD45RA MicroBeads# 130-045-901
		CD45RO MicroBeads# 130-046-001
Memory
CD4+ T Cells	TEM cells	TCM cells	TH1 cells	TH2 cells	TH17 cells
人CD4记忆T细胞富集分选试剂盒   (710605,710610,710620)	CD4+ Effector Memory T Cell Isolation Kit # 130-094-125	CD4+ Central Memory T Cell Isolation Kit # 130-094-302	IFN-γ Secretion Assay-Cell Enrichment and Detection Kit(PE) # 130-054-201	CD294(CRTH2)MicroBead Kit # 130-091-274	IL-17 Secretion Assay-Cell Enrichment and Detection Kit（PE） # 130-094-542
Memory CD4+ T Cell Isolation Kit# 130-091-893				IL-4 Secretion Assay-Cell Enrichment and Detection Kit（PE）# 130-054-101

 

CD8+ T cell subsets
Naive CD8+ T cells	Memory CD8+ T cells	TEMRA cells	Cytotoxic T cells	Effector T cells
人CD8 naïve T细胞富集分选试剂盒   (710905,710910,710920)	人CD8记忆T细胞富集分选试剂盒   (711005,711010,711020)	CD8+CD45RA+ Effector T cell Isolation Kit# 130-094-485	CD8+CD57+ T Cell Isolation Kit # 130-093-396	CD27 MicroBeads # 130-051-601
Naïve CD8+ T Cell Isolation Kit # 130-093-244
Pre-selection with: CD8+ T Cell Isolation Kit	CD8+ Memory T Cell Isolation Kit# 130-094-412
CD45RA MicroBeads # 130-045-901
CD45RO MicroBeads #130-046-001

 

Products for the isolation of mouse T cells

T cells
CD3ε MicroBead Kit# 130-094-973 CD90.1 MicroBeads# 130-094-523	CD90.2 MicroBeads# 130-094-101	CD5（Ly-1）MicroBeads# 130-049-301	Pan T Cell Isolation Kit Ⅱ# 130-095-130
CD4+ T cells	Treg cells	CD8+ T cells	γ/δ+ T cells
小鼠CD4 T细胞富集分选试剂盒 （720405,720410,720420）	CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit# 130-091-041	小鼠CD8+细胞分选试剂盒   （722805,722810,722820）	TCRγ/δ+ T Cell Isolation Kit # 130-092-125
CD4(L3T4)MicroBeads # 130-049-201	CD25 MicroBead kit # 130-091-072	CD8a（Ly-2）Microbeads # 130-049-401
CD4+ T Cell Isolation Kit  Ⅱ # 130-095-248	CD62L (L-selectin)Microbeads # 130-049-701	CD8a+ T Cell Isolation Kit  Ⅱ # 130-095-236

 

T cell subset
Naive CD4+ T cells	Memory CD4+ T cells	Activated T cells	TH1 cells	TH2 cells	TH17 cells
小鼠CD4 naïve T细胞富集分选试剂盒         （720505,720510,720520）	Pre-selection with: CD4+ or CD8+ T Cell Isolation Kit  Ⅱ	CD25 MicroBeads Kit # 130-091-072	Mouse IFN-γ Secretion Assy-Cell Enrichment and Detection Kit（PE） # 130-090-517	Mouse IL-4 Secretion Assay-Cell Enrichment and Detection Kit(PE) # 130-090-515	Mouse IL-17 Secretion Assay-Cell Enrichment and Detection Kit(PE) # 130-094-213
CD4+ CD62L+ T Cell Isolation Kit  Ⅱ# 130-093-227	CD62L(L-selectin)MicroBeads # 130-049-701	CD154 Enrichment and Detection Kit（PE） # 130-093-129

 

Color code for the use of MACS^® MicroBeads

  Positive selection(labeling of target cells)

  Depletion(labeling for removal of an unwanted cell type)

  Isolation of untouched cells using a depletion cocktail

  Isolation of cells directly from whole blood

  Sequential separation(combination of depletion of non-target cells and positive selection)

 

 

Human

Pan markers	Th1	Th2	Th17	Tfh	Treg
CD2 CD3 CD4 CD5 CD6 CD7 CD25↑ CD27 CD28 CD45RA(naïve：high,effector:low,menory:high) CD69↑ CD127(IL7Rα) CD134（OX40）↑ CD137(4-1BB)↑ CD152(CTLA-4)↑ CD154(CD40L)↑ CD272(BTLA)↑ CD279(PD-1)↑	分泌因子 IFNγ IL-2 TNFα TNFβ(LTα)	分泌因子 Amphiregulin IL-4 IL-5 IL-13	分泌因子 GM-CSF IL-17A IL-17AF IL-17F IL-21 IL-22	分泌因子 IL-21	分泌因子 IL-10 TGFβ
	细胞表面 CD94 CD119(IFNγR1) CD183(CXCR3)○ CD186(CXCR6) CD191(CCR1) CD195(CCR5) CD212(IL-12Rβ1) CD218a（IL-18Rα） CD254(RANKL) CD366(TIM3)	细胞表面 CD184(CXCR4) CD194(CCR4) CD198(CCR8) CD294(CRTH2)○ CD365(TIM1) IL-25R(IL-17RB) IL-33R(ST2)	细胞表面 CD121a CD161 CD194(CCR4) CD196(CCR6)○ CD360(IL-21R) CD212(IL-12Rβ1) IL-33R	细胞表面 CD183(CXCR3)● CD185(CXCR5)○ CD278(ICOS)○ CD279(PD-1)○	细胞表面 CD25○ CD39 CD73 CD101 CD121a CD121b CD137(4-1BB) CD152(CTLA-4) CD357(GITR/AITR) GARP↑ LAP↑ TIGIT●
	胞内/转录因子 SAT1 SAT4 T-bet○	胞内/转录因子 BATF GATA-3○ IRF4 STST6	胞内/转录因子 AHR BATF c-Maf IkBζ IRF4 RORα RORγt○ STAT3	胞内/转录因子 BATF Bcl-6 c-Maf IRF4 STAT3	胞内/转录因子 c-Rel Eos Foxp3○ Helios STAT5

↑=Upregulated ↓=Downregulated ○=Key marker ●=Subset

 

人全血10色免疫表型分析

鉴别多种T细胞亚群和髓细胞

 

 

抗体组合

CD56 Mouse anti Human mAb， PE	CD14 Mouse anti Human mAb，APC-Cy™7
CD33 Mouse anti Human mAb，FITC	CD19 Mouse anti Human mAb， Pacific Green™
CD11c Mouse anti Human mAb，PE	CD3 Mouse anti Human mAb， Alexa Fluor™700
CD4 Mouse anti Human mAb， Percp-Cy™5.5	HLA－DR Mouse anti Human mAb，PE-Cy™7
CD25 Mouse anti Human mAb，APC	CD62L Mouse anti Human mAb， Pacific Blue

 

 

 

 

染料	Excitation(nm)	Emission(nm)
Pacific Blue	405	440/50
Pacific Green	405	512/25
Pacific Orange	405	603/48
FITC	488	530/30
PerCP-Cy5.5	488	695/40
PE	561	685/16
PE-Cy7	561	780/60
APC	637	670/14
Alexa Fluor 700	637	720/30
APC-Cy7	637	780/60

 

人全血13色免疫表型分析

B细胞、T细胞亚群、NK细胞和髓系细胞免疫表型分析

抗体组合

 

CD45 Mouse anti Human mAb，Pacific Orange	CD3 Mouse anti Human mAb， Alexa Fluor 700
CD8 Mouse anti Human mAb，Pacific Blue	HLA－DR Mouse anti Human mAb，PE-Cy7
CD4 Mouse anti Human mAb， PerCP-Cy™5．5	CD62L Mouse anti Human mAb， APC-Alexa Fluor 750
CD25 Mouse anti Human mAb，APC	CD33 Mouse anti Human mAb，PE-Cy™5
CD19 Mouse anti Human mAb， Pacific Green	CD45RA Mouse anti Human mAb，FITC
CD14 Mouse anti Human mAb，Qdot 705	CD56 Mouse anti Human mAb， PE

 

 

 

Mouse

 

Pan markers	Naive CD4+ T	Th1	Th2	Th17	Tfh	Treg
CD3 CD4 CD5 CD7 CD25↑ CD27 CD28 CD44↑ CD62L(naïve：high,effector:low,menory:high)   CD69↑ CD127(IL7Rα) CD134（OX40）↑ CD137(4-1BB)↑ CD152(CTLA-4)↑ CD154(CD40L)↑ CD272(BTLA)↑ CD278(ICOS)↑ CD279(PD-1)↑	CD45+ CD3+ CD4+ CD62L+ CD25- CD44 low/-	分泌因子 IFNγ IL-2 TNFα TNFβ(LTα)	分泌因子 Amphiregulin IL-4 IL-5 IL-13 IL-10	分泌因子 GM-CSF IL-17A IL-17AF IL-17F IL-21 IL-22	分泌因子 IL-21	分泌因子 IL-10 TGFβ
		细胞表面 CD94 CD119(IFNγR1) CD183(CXCR3)○ CD186(CXCR6) CD191(CCR1) CD195(CCR5) CD212(IL-12Rβ1) CD218a（IL-18Rα） CD254(RANKL) CD366(TIM3)	细胞表面 CD184(CXCR4) CD194(CCR4) CD198(CCR8) CD294(CRTH2) CD365(TIM1) IL-25R(IL-17RB) IL-33R(ST2)○	细胞表面 CD194(CCR4) CD196(CCR6)○ CD121a CD360(IL-21R) CD212(IL-12Rβ1) IL-33R	细胞表面 CD185(CXCR5)○ CD278(ICOS)○ CD279(PD-1)○	细胞表面 CD25 CD39 CD73 CD101 CD121a CD121b CD137(4-1BB) CD152(CTLA-4) CD304(Neuropilin-1)○ CD357(GITR) GARP↑ LAP↑ TIGIT
		胞内/转录因子 SAT1 SAT4 T-bet○	胞内/转录因子 BATF GATA-3○ IRF4 STST6	胞内/转录因子 AHR BATF c-Maf IkBζ IRF4 RORα RORγt○ STAT3	胞内/转录因子 BATF Bcl-6 c-Maf IRF4 STAT3	胞内/转录因子 c-Rel Eos Foxp3○ Helios STAT5

 

↑=Upregulated ↓=Downregulated ○=Key marker ●=Subset

 

小鼠脾细胞10色免疫表型分析

抗体组合

 

CD45R (B220) Rat Anti-Mouse mAb, Pacific Orange™	CD8α Rat Anti-Mouse mAb, Alexa Fluor™ 700
CD3ε Hamster Anti-Mouse mAb, PerCP-Cy5.5	CD11c Hamster Anti-Mouse mAb, PE-Cy7
CD25 Rat Anti-Mouse mAb, APC	I-A/I-E (MHCII) Rat Anti-Mouse mAb, Pacific Blue™
CD45.2 Mouse Anti-Mouse mAb, APC-Cy7	CD11b Rat Anti-Mouse mAb, FITC
CD4 Rat Anti-Mouse mAb, Pacific Green™

 

 

 

Human

Pan markers	Central memory	Effector memory	Effector	Naïve
CD2 CD3 CD5 CD7 CD8 CD25↑ CD27 CD28	分泌因子 IFNγint IL-2int TNFαint	分泌因子 Granzyme B IFNγhigh IL-2low Perforin TNFαhigh	分泌因子 CCL3(MIP-1α) CCL4(MIP-1β) CCL5(RANTES) Granzyme A Granzyme k Granzyme B IFNγ IL-2 Perforin TNFα	细胞表面 CD27 CD45RA CD62L CD127(IL7Rα) CD197（CCR7)
	细胞表面 CCR7low CD27 CD28 CD45RO CD62L○ CD62Llow CD127(IL7Rα)high CD197（CCR7）low○	细胞表面 CD44 CD45RO○ CD62Llow CD127(IL7Rα)high CD197（CCR7）low KLRG1○ KRG1high	细胞表面 CD25↑ CD69↑ CD30 CD122↑○ CD137(4-1BB) CD134(OX40) CD223(LAG-3) CD272(BTLA) CD278(ICOS) CD279(PD-1) CD366(TIM3) KLRG1○
	胞内/转录因子 Eomes T-betint	胞内/转录因子 Eomes T-betint	胞内/转录因子 T-betint

 

                              ↑=Upregulated ↓=Downregulated ○=Key marker ●=Subset

 

人全血10色免疫表型分析

鉴别多种T细胞亚群和髓细胞

抗体组合

CD8 Mouse anti Human mAb，Picific Orange	CD14 Mouse anti Human mAb，APC-Cy™7
CD33 Mouse anti Human mAb，FITC	CD19 Mouse anti Human mAb， Pacific Green™
CD11c Mouse anti Human mAb，PE	CD3 Mouse anti Human mAb， Alexa Fluor™700
CD4 Mouse anti Human mAb， Percp-Cy™5.5	HLA－DR Mouse anti Human mAb，PE-Cy™7
CD25 Mouse anti Human mAb，APC	CD62L Mouse anti Human mAb， Pacific Blue

 

染料	Excitation(nm)	Emission(nm)
Pacific Blue	405	440/50
Pacific Green	405	512/25
Picific Orange	405	603/48
FITC	488	530/30
Percp-Cy5.5	488	695/40
PE	561	685/16
PE-Cy7	561	780/60
APC	637	670/14
Alexa Fluor 700	637	720/30
APC-Cy7	637	780/60

 

人全血13色免疫表型分析

B细胞、T细胞亚群、NK细胞和髓系细胞免疫表型分析

抗体组合

CD45 Mouse anti Human mAb，Pacific Orange	CD3 Mouse anti Human mAb， Alexa Fluor 700
CD8 Mouse anti Human mAb，Pacific Blue	HLA－DR Mouse anti Human mAb，PE-Cy7
CD4 Mouse anti Human mAb， PerCP-Cy™5．5	CD62L Mouse anti Human mAb， APC-Alexa Fluor 750
CD25 Mouse anti Human mAb，APC	CD45RA Mouse anti Human mAb，FITC
CD19 Mouse anti Human mAb， Pacific Green	CD33 Mouse anti Human mAb，PE-Cy™5
CD14 Mouse anti Human mAb，Qdot 705	CD56 Mouse anti Human mAb， PE

 

 

 

Mouse

 

Pan markers	Central memory	Effector memory	Effector	Naïve
CD3 CD5 CD8 CD27 CD28	分泌因子 IFNγlow IL-4low	分泌因子 Granzyme B IFNγ IL-2 Perforin TNFα	分泌因子 CCL3(MIP-1α) CCL4(MIP-1β) CCL5(RANTES) Granzyme A Granzyme B IFNγ IL-2 Perforin TNFα	细胞表面 CD62L CD127(IL7Rα) CD197（CCR7) CD183(CXCR3)
	细胞表面 CD44 CD62L○ CD127(IL-7Rα) CD197（CCR7）high○	细胞表面 CD44 CD57 KLRG1○	细胞表面 CD25↑ CD69↑ CD30 CD44 CD122↑ CD137(4-1BB) CD134(OX40) CD223(LAG-3) CD272(BTLA) CD278(ICOS) CD279(PD-1) CD366(TIM3) KLRG1●
	胞内/转录因子 bcl-6 Eomes T-betint	胞内/转录因子 Eomesint T-betint BLIMP1	胞内/转录因子 Eomesint T-betint BLIMP1

 ↑=Upregulated ↓=Downregulated ○=Key marker ●=Subset

 

小鼠脾细胞10色免疫表型分析

抗体组合

 

CD45R (B220) Rat Anti-Mouse mAb, Pacific Orange™	CD8α Rat Anti-Mouse mAb, Alexa Fluor™ 700
CD3ε Hamster Anti-Mouse mAb, PerCP-Cy5.5	CD11c Hamster Anti-Mouse mAb, PE-Cy7
CD25 Rat Anti-Mouse mAb, APC	I-A/I-E (MHCII) Rat Anti-Mouse mAb, Pacific Blue™
CD45.2 Mouse Anti-Mouse mAb, APC-Cy7	CD11b Rat Anti-Mouse mAb, FITC
CD4 Rat Anti-Mouse mAb, Pacific Green™

 

Th17细胞

Th1细胞是什么？

顾名思义，辅助性T细胞（Th）为免疫系统的其他细胞提供辅助功能，特别是抗原呈递细胞（APCs），如巨噬细胞、树突状细胞和B细胞，并对这些细胞的活化和成熟起到重要的作用。CD4+ Th细胞有不同的亚群，包括Th1、Th2、Th17和调节性T细胞，每个亚群都由一组特定的细胞因子和转录因子活化，并以它们分泌的细胞因子和发挥的效应功能为特征。

Th1细胞来源于T细胞的α:β谱系，识别主要组织相容性复合体（MHC）I类或II类分子呈递的抗原。Th1细胞在识别和清除细胞内病原体如病毒和细菌，包括结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌和利什曼原虫方面起着重要作用。这些病原体通常存在于巨噬细胞等细胞内的吞噬小泡中，一般通过阻止溶酶体融合来逃避在细胞内被杀死。Th1细胞有助于活化巨噬细胞对抗这些病原体，并破坏它们的逃避策略。Th2细胞是CD4+ T细胞的另一个主要亚群，相比之下，该亚群帮助识别蠕虫、寄生虫等细胞外病原体，并激活B细胞介导的抗体反应。

Th1细胞发育

胸腺阶段

T细胞发育的第一阶段发生于胸腺（图1），在胸腺中Notch1信号转导以及TCF1、GATA3、Bcl11b等特异性转录因子的表达促进T细胞定型。α:β谱系所有T细胞亚群的发育都可以追溯到一个共同的祖细胞（Thp），该祖细胞经历一个双阴性（DN）（CD8– CD4–）阶段，接着是双阳性（DP）（CD8+ CD4+）阶段，然后胸腺细胞变成单阳性（SP） CD8+或CD4+。

MHC分子对SP细胞的成熟起着重要作用。CD4+ T细胞识别MHC II类分子提呈的抗原肽，这个过程由CD4共受体结合MHC II类链的恒定区所介导的。表达MHC I类或II类基因的转基因小鼠研究强调了MHC共受体相互作用在胸腺细胞发育中的重要性。MHC II类基因缺失导致仅CD8+细胞发育，而MHC I类基因缺失导致仅CD4+细胞发育，破坏T细胞群体中CD4/CD8的平衡。

DP细胞的固有寿命很短，仅3-4天，它只有过其TCR基因重组才能存活。这种拯救胸腺细胞免于凋亡及其随后成熟发展为SP细胞的过程称为阳性选择，在此过程中，识别自身MHC复合体的T细胞被选为进一步发育对象。当T细胞识别自身抗原-MHC复合物且具有高亲和力时，会发生相反的过程，即阴性选择：胸腺内的表达自身MHC复合体的细胞凋亡，从而防止有自身反应的T细胞活化。

图 1.T细胞发育。

 

分化为Th1效应细胞

在胸腺发育阶段末期，未定向分化的Naive CD4+T （Th0）细胞前往二级淋巴器官，寻找由MHC II类分子呈递的抗原。识别抗原后，Naive T细胞经历克隆扩增并分化为不同的效应细胞亚型，而少数发育为记忆性T细胞。分化谱系主要由细胞因子、转录因子、共刺激信号和黏附分子影响。

在Th1分化中起关键作用的两种细胞因子是IFNγ和IL-12。APC分泌的IL-12能活化STAT4转录因子从而促进Th0细胞分化为Th1效应细胞。而STAT4能活化转录因子STAT1和Tbet促进IFNγ产生，这是Th1分化的另一个因素。Tbet被认为是Th1分化的主要调节因子，因为它诱导更多的IFNγ表达，形成增强Th1反应的正反馈环。

图 2.Th1发育和IFNγ介导的正反馈环有助于Th1扩增。

表 1.促进Th1细胞发育的基因表达和细胞因子变化。

	Naive CD4 T细胞	Th1效应T细胞
促进发育的细胞因子	IL2	IL-12 IFNγ
特征性转录因子和信号转导蛋白	Lck ZAP-70 LKLF	Tbet STAT1 STAT4
细胞表面标志物	CD3 CD28 CD4 CD62L CD45RA CD5 CCR7	CD3 CD28 CD4 CD45RO CD44 Fas FasL（类型1） IL-12 R2 CD119 （IFNγR1） CD183 （CXCR3） CD186 （CXCR6） CD191 （CCR1） CD195 （CCR5） CD212 （IL-12Rβ1） CD218a （IL-18Rα）（小鼠，非人类） CD254 （RANKL） CD366 （TIM3）
分泌的细胞因子		IFNγ TNFα GM-CSF IL3 LTα LTβ CXCR3 CCL2 IL2 IL10

 

记忆CD4+ T细胞

抗原识别还会生成记忆性Th1细胞，该细胞表达特征性标志物CD45RO。在随后的抗原刺激中，记忆细胞对于形成强大而快速的免疫反应非常重要。CD4⁺记忆细胞有三种类型：中央记忆性T细胞（TCM）、效应记忆性T细胞（TEM）和组织驻留记忆性T细胞（TRM）。TCM细胞具有高增殖潜能，而TEM细胞增殖潜能低但炎症效应功能强。CD4+记忆性T细胞的分化有不同的假说。其中一个假说猜想虽然记忆T细胞分化有一定的可塑性，但Th1效应细胞可能会生成TEM。记忆性T细胞分化亚群受细胞因子环境和转录因子活性主导。

图 3.影响记忆CD4 T细胞分化的因素。

共刺激分子及其在Th1分化中的作用

共刺激（或共抑制）分子在APC上表达，并与T细胞上的分子相互作用，增强或减弱信号的生成。此外，它们还可以调节信号，使正在启动的转录程序发生变化。因此，这些分子在T细胞分化和不同谱系的命运中起着重要作用。

图 4.共刺激分子及其在Th1分化中的作用。

表 2.对Th1分化和功能具有重要作用的共刺激分子。

分子名称	刺激或是抑制	APC上的相互作用伴侣	注
CD28	共刺激/共抑制	B7	共刺激：高抗原剂量或高亲和力TCR结合有利于Th1谱系发育。 共抑制：长时间CD28结合有利于Th2谱系发育。
ICOS	共刺激/共抑制	ICOSL	对于不同的感染类型有不同的效果。例如，对沙门氏菌感染有协同刺激作用，但对李斯特菌感染有抑制作用。
CD226 （DNAM-1）	共刺激	CD155（PVR），CD112（连接蛋白2）	参与Th1活化和扩增。上调。
Tim3	共抑制	半乳糖凝集素9	导致过敏性哮喘的Th1/Th2失衡。Tim3抑制增加Th1细胞因子。

Th1细胞效应功能

Th1细胞的主要效应功能在于细胞介导免疫和炎症，包括活化其他免疫细胞如巨噬细胞、B细胞和CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的细胞溶解和其他效应功能。Th1介导的其他免疫细胞活化的第一步是Th1细胞表面的CD40配体（CD40L）与巨噬细胞、B细胞和树突状细胞表面表达的CD40发生相互作用。效应Th1细胞还分泌大量的IFNγ，除了进一步扩增Th1细胞群，还通过诱导200多个靶基因活化巨噬细胞的溶解细胞活性。巨噬细胞中增加的细胞毒性活性是杀死细胞内病原体（如病毒，细胞内细菌和原生动物）的关键。Th1依赖性免疫反应的一个经典案例是分枝杆菌感染期间。分枝杆菌逃避巨噬细胞内的溶酶体融合；然而，MHC II类在受感染巨噬细胞表面上提呈出这些病原体的肽段，导致Th1反应活化，从而触发巨噬细胞的溶解细胞功能。

除了清除细胞内感染，Th1反应还在活化CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞以靶定和杀伤肿瘤方面起着至关重要的作用，此外还可增强CTL存活和记忆。CD40还促进B细胞中的类别转换，生成IgG2a抗体。

图5.Th1效应器功能。

表 3.Th1细胞分泌的细胞因子及其功能。

Th1细胞表达的细胞因子和标志物	功能
IFNγ	刺激Th1细胞扩增；活化受感染的巨噬细胞和树突状细胞的溶解细胞活性
TNF α	与LTα一起作用于内皮细胞，诱导巨噬细胞从局部血管进入到感染部位
GM CSF	与IL3偕同活化骨髓源性巨噬细胞分化
IL-3	与GM CSF偕同能以活化骨髓源性巨噬细胞分化
CD40L	结合巨噬细胞、B细胞和树突细胞上表达的CD40，以活化这些细胞上的效应细胞功能。参与B细胞中抗体的类别转换，生成更多的IgG2a，IGG2a通过活化补体途径促进调理作用。
FASL	激活含有FAS的靶标中的凋亡受体信号
LTα，LTβ	活化嗜中性粒细胞杀伤功能以消除病原体；也在炎症中发挥作用
CXCR3	促进Th1和CD8 T细胞向感染和炎症的外周部位迁移；还能使T细胞与APC相互作用并增强Th1“扩增正反馈”。
CCL2	充当在感染部位集聚巨噬细胞的化学驱化剂
IL2	促进CD8+ CTL扩增和细胞溶解活性
IL10	调节Th1活化

 

Th1细胞研究工具

Th1细胞的分离

可以通过两种不同的方式来获取Th1细胞群体：

• 通过磁珠分离或流式细胞术（FACS）分选出部分T细胞（例如，Naive CD4⁺T细胞），然后使这些细胞进行体外活化并分化成特定的Th1亚群。

• 直接从外周血单核细胞中分离出Th1亚群。

T细胞的分离通常从Ficoll*密度梯度离心开始，分离出白膜层，里面包含T细胞和B细胞以及外周血单核细胞（PBMC）。可以通过阳性或阴性选择从外周血单核细胞（PBMC）分离出T细胞群体。在阳选中，使用T细胞特异性抗体富集T细胞群体。在阴选中，用其他群体（例如B细胞）的抗体把这些群体特异性去除，从而达到富集T细胞的目的。在阳性选择中，首先用针对T细胞谱系标志物（例如CD3或CD4）的生物素化抗体标志T细胞或T细胞亚群，然后加入Invitrogen Invitrogen Dynabeads链霉亲和素包被的磁珠。关于Ficoll密度梯度细胞分离的详细解释和描述，以及基于磁珠分选的T细胞阳选方案，可在T细胞刺激和增殖在线学习课程中找到。

或者，可用流式细胞术（FACS）从样品分离Naive CD4⁺T细胞。对于流式细胞分析，通常使用细胞表面蛋白和细胞内蛋白（例如细胞因子和转录因子）的荧光标志物组合。

一旦分离出CD4 ⁺群体，就可以通过使用抗CD3和抗CD28抗体交联共刺激TCR和CD28受体，实现T细胞活化和刺激。目前市面上有商业化的抗CD3和抗CD28抗体共价偶联磁珠。例如, 使用偶联CD28抗体的 Invitrogen Dynabeads刺激T细胞表面CD28共刺激受体来诱导T细胞活化和扩增。Th1的体外分化方案是使用IL-12和IFNγ处理Naive CD4⁺T细胞。我们建议阅读Flaherty S，Reynolds JM（2015年），Mouse naive CD4⁺ T cell isolation and in vitro differentiation into T cell subsets作为分离Naive CD4 T细胞的设门和标志物的参考方案。

* GE Healthcare公司拥有Ficoll的注册商标

图6.使用抗CD3和CD28的抗体对T细胞进行体外活化。

图7.通过流式细胞仪使用针对表征细胞因子的抗体鉴定Th1亚型。

用于Th1细胞分析和鉴定的工具

细胞因子谱分析通常用于对Th细胞亚型进行分类，也可以量化分泌的细胞因子。细胞因子酶联免疫吸附试剂（ELISA）可用于监测T细胞依赖性细胞因子的分泌，这些细胞因子是响应群体水平的活化和谱系特异性分化的。市面上已经有用于检测和定量数百种单个细胞因子的酶联免疫吸附试剂（ELISA）试剂盒。这些试剂盒通常是预包被抗体的96孔板，包含检测抗体以及标准品、缓冲液和辅助试剂。检测敏感度可达到皮克（pg）级水平

虽然ELISA可以用于检测单个细胞因子的分泌，但Luminex多重分析技术的进步使得可以在单个样品或反应孔中高通量检测多种细胞因子。挑选抗体库里的抗体与不同强度荧光的微球结和，可以实现同时检测多种细胞因子。结合Luminex检测仪器，完成夹心检测定量。Invitrogen Th1/Th2 Cytokine 11-Plex Human ProcartaPlex Panel 使用Luminex平台检测11种细胞因子。

除了ELISA的方法之外，研究Th1和其他免疫群体的另一种常见且功能强大的工具是流式细胞术。尽管酶联免疫吸附试验（ELISA）可检测分泌的细胞因子的数量，但流式细胞术可用于检测表面或细胞内的标志物，以及细胞因子的表达来对细胞进行分析。此外，流式细胞术可用于计算其他群体与Th1群体的比例。发表在Cytometry Part A（威利的在线图书馆）杂志上的优化多色免疫荧光方案（OMIP）描述了通过流式细胞术以及特异性抗体和荧光染料的试剂盒对细胞类型进行广泛表征分析。OMIP-030（通过表面标志物对人T细胞亚群进行表征分析）和OMIP-008（检测人T细胞的Th1和Th2细胞因子多功能性）是研究Th1亚群非常有用的优化多色免疫荧光方案（OMIP）。基于流式细胞术，也可以使用带有&刺激剂的Invitrogen eBioscience Essential Human Th1/Th17 Phenotyping Panel 对Th1细胞进行鉴定和测试。

什么是Th2细胞？

顾名思义，辅助性T细胞（Th）为免疫系统的其他细胞提供辅助功能，特别是抗原提呈细胞（APC），如巨噬细胞、树突状细胞和B细胞，并对这些细胞的活化和成熟起到重要的作用。CD4⁺ Th细胞有不同的亚群，包括Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, Tfh 和 Treg细胞，每个亚群都由一组特定的细胞因子和转录因子活化，分泌细胞因子并发挥效应功能。

Th2细胞介导针对细胞外寄生虫、细菌、过敏原和毒素的体液或抗体介导的免疫反应的活化和维持。Th2细胞通过生成各种细胞因子如IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-13和IL-17E （IL-25）来介导这些功能。这些细胞因子负责促进抗体合成、活化嗜酸性粒细胞和抑制多种巨噬细胞功能，从而提供独立于吞噬细胞的保护反应。这些细胞因子也会抵消Th1反应，使Th2接受IL-4的刺激活化。在功能上，由于细胞因子受体在多种细胞类型中广泛表达，因此Th2细胞因子对体内的许多细胞类型都有影响。Th2细胞刺激并募集免疫细胞的特定亚群，例如嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，使其到达感染部位或对导致组织嗜酸性粒细胞增多和肥大细胞增生的过敏原或毒素作出反应。其诱导粘液生成、杯状细胞化生和气道高反应性。Th2细胞也调控B细胞IgE类别转换。由于Th2细胞对抗体生成和过敏反应的影响，Th2细胞的过度活化似乎是过敏（1型，速发型超敏反应）、自身免疫反应（如慢性移植物抗宿主病、进行性系统性硬化症和系统性红斑狼疮）恶化的原因。此外，Th2细胞也被认为是导致哮喘和其他过敏性炎症疾病恶化的原因。有趣的是，Th2细胞还生成具有抗肿瘤作用的生长因子双调蛋白和IL-24。

Th2细胞的分化

Naive CD4⁺ T细胞由T细胞受体（TCR）、共刺激分子分化抗原簇CD28同时参与而被活化，同时由表达主要组织相容性复合体（MHC）II类的抗原呈递细胞（APC）对naive CD4+ T细胞进行活化，如巨噬细胞、树突状细胞和B细胞[1]。活化信号是通过TCR与MHC II类分子表面上的同源抗原肽的识别和结合，并通过多重共刺激信号来传导的。一旦完全活化，淋巴组织中的naive CD4 ⁺ T细胞就会迅速增殖，经历克隆扩增并分化为辅助性T细胞，例如Th1，Th2或Th17细胞[1]。周围的细胞因子环境将naive T细胞分化为特定的细胞谱系，其中Th2细胞是由白介素（IL）-4和IL-2特异性活化的。

用于Th2细胞分化的信号通路

IL-4刺激促进信号转导子和转录活化子（STAT）6磷酸化以及GATA结合蛋白3（GATA3）的上调，GATA结合蛋白3是Th2细胞发育的关键转录因子[2]。GATA3与IL-2诱导的STAT5信号转导相互作用，能上调IL-4（经典Th2细胞因子）的表达。紧接着是IL-4驱动的正反馈机制，即持续的IL-4-STAT6-GATA3和IL-5-STAT5信号转导不断的让Th2扩增。GATA3的IL-4依赖性STAT6活化是Th2细胞分化的经典途径；然而，有许多非经典途径被认为对Th2分化很重要，包括多种转录因子（例如c-Maf，NF-κB，IRF4，AP1）和细胞因子（胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP），IL- 5，IL-25和IL-33）。

Th2和固有淋巴样细胞（ILC）

分化的效应Th细胞迁移到周围的炎症部位，在那里其重新遇到同源抗原并分泌效应细胞因子，从而促进抗原特异性免疫反应。仅在Th2细胞到达发炎的组织部位时才分泌IL-5、IL-9和IL-13（图1）。炎症部位的上皮细胞和固有细胞也在形成Th2适应性免疫反应中发挥作用。固有淋巴样细胞（ILC）、巨噬细胞和树突状细胞分泌促炎细胞因子，包括IL-1、IL-18、IL-25、IL-33、GM-CSF、M-CSF和TSLP，其通过不同途径发出信号以促进Th2分化。炎症微环境中的细胞因子驱动不同的Th2效应因子活化。因此，出现几种表型和功能上不同的Th2记忆细胞亚群，根据细胞因子的作用而发挥不同的功能。例如，能高水平分泌IL-5的Th2细胞已被证明与过敏性哮喘的发病相关，而除了IL-4和IL-13之外，分泌IL-5、IL-17和IFN-γ的细胞也可参与其中，且已被定义为非经典记忆性Th2细胞，可促进慢性过敏性炎症性疾病并抑制淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）持续感染。记忆性Th2细胞也表达相同水平的IL17RB、TSLP受体（TSLPR），趋化性受体同源分子（CRTh2）和CCR8 。

根据趋化因子（C-X-C基序）受体3（CXCR3）和CD62L的表达水平，记忆性Th2细胞可至少分为四个不同的亚群。这四个亚群都能响应抗原再刺激，生成大量的IL-4和IL-13。然而，只有CXCR3^Low CD62L^Low亚群生成IL-5并被认为是致病性的，被称为记忆型Tpath细胞。IL-33刺激诱导记忆性Th2细胞和2型固有淋巴样细胞（ILC2）生成IL-5和IL-13，从而促进2型免疫反应。与IL-33相似，IL-2和IL-25的组合也能促进Th2记忆细胞和ILC中IL-5的生成。ILC是来源于共同淋巴祖细胞的免疫细胞，并根据其细胞因子和转录因子谱进行分类，其中ILC2的部分功能是调节Th2。虽然IL-33可以通过增强肺和肠组织中的Th2细胞因子反应来诱导强的Th2免疫和嗜酸性粒细胞炎症，但IL-33对Th2效应群体几乎没有影响，而是通过记忆型Tpath细胞介导炎症。例如，接触过敏原可能会通过刺激上皮和内皮细胞生成IL-33而在气道中引发Th2反应，从而促进Th2记忆细胞生成IL-5并加剧嗜酸性粒细胞的炎症。

表 1.Th2细胞亚群和关键细胞因子谱。

记忆性Th2细胞亚群	分泌型细胞因子
CXCR3Low CD62LLow	IL-5、IL-4、IL-13
CXCR3Hi CD62LHi	IL-4、IL-13、脱中胚蛋白
CXCR3Low CD62LHi	IL-4、IL-13、脱中胚蛋白
CXCR3Hi CD62LLow	IL-4、IL-13、脱中胚蛋白

图 1.固有淋巴样细胞（ILC）调节Th2适应性免疫反应。ILC是源自共同淋巴祖细胞（CLP）的免疫细胞。根据生成的细胞因子和调节其发育和功能的转录因子对ILC进行分组。其可以快速分泌免疫调节细胞因子，以实现对感染的早期免疫反应。

疾病中的Th2细胞

调节Th2记忆细胞维持的确切机制仍不清楚。已经表明，促进肺过敏反应的抗原特异性记忆性Th2细胞存在于肺组织中，Th2记忆反应依赖于在称为诱导型支气管相关淋巴组织（iBALT）的局部结构中发现的淋巴管内皮细胞（LEC）生成的IL-7和IL-33。生成IL-4、IL-5和IL-13的Th2细胞与很多疾病相关，包括炎症疾病，包括哮喘、慢性鼻-鼻窦炎、特应性皮炎和嗜酸性胃肠道疾病（如溃疡性结肠）炎。促进小鼠慢性气道炎症的主要细胞类型已被证明为CD44^Hi CD62L^Low CXCR3^Low CCR4^Hi CCR8^Hi IL7Rα^Hi ST2^Hi 记忆型 Tpath2细胞，而CCR8^Hi Tpath2细胞和CRTH2^Hi CD161^Hi PGDS^Hi Tpath2细胞已分别被证明为可促进慢性特应性皮炎和嗜酸性粒细胞性胃肠道疾病 。Th2细胞因子通过促进嗜酸性粒细胞浸润、杯状细胞化生而粘液生成增多和组织纤维化来促进人哮喘和小鼠过敏性气道炎症模型。抗IL-5和IL-13的单克隆抗体已成功用作治疗哮喘，在治疗上有发展的潜力。Th2细胞分泌的IL-4、IL-5和IL-13有助于B细胞增殖和从免疫球蛋白（Ig）G1到IgE的同种型转换，IgE是参与寄生蠕虫感染和某些与Th2细胞相关的过敏性疾病（如哮喘）的关键抗体。Th2细胞也被证明能诱导选择性活化（M2）巨噬细胞，其介导炎症阶段的消退并启动伤口愈合过程中的组织修复。效应Th2细胞介导对寄生虫感染、毒液、某些细菌感染的免疫反应，并通过诱导选择性活化（M2）巨噬细胞来促进伤口愈合[3]。

研究Th2细胞的工具

用于Th2细胞分析和鉴定的工具

细胞因子谱通常用于对Th细胞亚型进行分类，也可以量化分泌的细胞因子。细胞因子酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于监测T细胞依赖性细胞因子的分泌，以响应群体水平的活化和谱系特异性分化。适用于检测和定量数百种单个细胞因子的细胞因子酶联免疫吸附试剂盒（ELISA）已经上市。这些试剂盒通常以预包被了捕获抗体的96孔板出售，包含检测抗体以及标准品、缓冲液和辅助试剂。检测灵敏度可达到皮克（pg）级水平

虽然ELISA可以用于检测单个细胞因子的分泌，但Luminex多重技术的进步使得可以在单个样品或反应孔中高通量检测多种细胞因子。挑选抗体库里的抗体与不同强度荧光的微球结合，可以实现同时检测多种细胞因子。结合Luminex检测系统，使用夹心法完成定量。与Th2生物学相关的组合见下表2。

表 2.用于Th2研究的Invitrogen ProcartaPlex Luminex Panels。

物种	描述	目标分析物	货号
小鼠	Th1/Th2 Cytokine & Chemokine 20-Plex Mouse ProcartaPlex	IFNγ； IL-12p70； IL-13； IL-1β; IL-2； IL-4； IL-5； IL-6；TNFα; GM-CSF； IL-18； GRO-α; IP-10； MCP-1； MCP-3； MIP-1α; MIP-1βa； MIP-2；趋化因子；嗜酸性粒细胞趋化因子	EPX200-26090-901
	Th1/Th2/Th9/Th17/Th22/Treg Cytokine 17-Plex Mouse ProcartaPlex Panel	IFN-γ；IL-12p70；IL-13；IL-1β；IL-2；IL-4；IL-5；IL-6；TNF-α；GM-CSF；IL-18；IL-10；IL-17A；IL-22；IL-23；IL-27；IL-9	EPX170-26087-901
人	Th1/Th2 Cytokine & Chemokine 20-Plex Human ProcartaPlex Panel 1	GM-CSF；IFN-γ；IL-1β；IL-2；IL-4；IL-5；IL-6；IL-12 p70；IL-13；IL-18；TNF-α；嗜酸性粒细胞趋化因子；GRO-α；IL-8；IP-10；MCP-1；MIP-1α；MIP-1β；趋化因子；SDF-1α	EPX200-12173-901
	Th1/Th2/Th9/Th17 Cytokine 18-Plex Human ProcartaPlex Panel	GM-CSF、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12p70、L-13; IL-17A; IL-18; IL-21; IL-22; IL-23; IL-27、TNF alpha	EPX180-12165-901

流式细胞术研究Th2细胞

除了基于ELISA的方法之外，研究Th2和其他免疫群体的另一种常见且功能强大的工具是流式细胞仪。尽管酶联免疫吸附试验（ELISA）可检测定量细胞因子，但流式细胞术可根据其表面或胞内表达的标志物，以及细胞因子表达来对细胞进行分析。Th2细胞由表面和细胞内靶标的联合表达来定义，例如：CD45⁺ CD3⁺ CD4⁺ IL-4⁺ CCR4⁺ CRTH2⁺ (CD8^- CD19^- CCR6^- CXCR5^- CXCR3^- CCR10^-) .此外，流式细胞仪可量化相对于其他群体，Th2群体的数量。

CD4⁺ Th2细胞特异性标志物

物种	标志物	标志物类型
人	双调蛋白 IL-4 IL-5 IL-13	分泌
	CD3 CD4 CD45 CD184 (CXCR4) CD194 (CCR4) CD198 (CCR8) CD294 (CRTH2) CD365 (TIM1) IL-25R（IL-17RB） IL-33R（ST2）	表面
	GATA-3 BATF IRF4 STAT6	胞内转录因子
小鼠	双调蛋白 IL-4 IL-5 IL-10 IL-13	分泌
	CD3 CD4 CD44 CD184 (CXCR4) CD194 (CCR4) CD198 (CCR8) CD294 (CRTH2) CD365 (TIM1) IL-25R（IL-17RB） IL-33R（ST2）	表面
	GATA-3 BATF IRF4 STAT6	胞内转录因子

发表在Cytometry Part A（威利的在线图书馆）杂志上的“优化多色免疫荧光组合”（OMIP）描述了使用特异性抗体和荧光染料的panel通过流式细胞术对细胞进行分型。下面的文章提供了经过测试的panel，并使用一套经过验证的抗体和试剂，可以用于Th2细胞群的多色分型。

表 3.Cytometry Part A ：用于Th2细胞分型和分析的OMIP。

OMIP ID	OMIP名称和链接	免疫上下文（关键词）
OMIP-008	OMIP-008：人T细胞Th1和Th2细胞因子多功能性的检测	肿瘤特异性T细胞细胞因子谱、PMA和离子霉素T细胞活化
OMIP-014	OMIP-014：通过细胞内细胞因子染色验证抗原特异性人T细胞的多功能分型	抗原特异性T细胞反应
OMIP-017	OMIP-017：包括滤泡辅助细胞在内的人CD41辅助性T细胞亚群	来自健康个体的PBMC中CD4 + 辅助性T细胞亚群的相对比例
OMIP-018	OMIP-018：趋化因子受体在人辅助性T细胞上的表达	来自健康个体的PBMC中CD4+ 辅助性T细胞亚群趋化因子受体的表达 *参见下面的设门策略。
OMIP-025	OMIP-025：通过细胞内细胞因子染色评估人T细胞和NK细胞反应，包括记忆和滤泡辅助表型	抗原特异性T细胞反应
OMIP-030	OMIP-030：通过表面标志物分析人T细胞亚群	通过检测表面标志物分析T细胞亚群的相对比例
OMIP-033	OMIP-033：适用于人T细胞和B细胞亚群的综合性单步染色方案	针对脑脊液（CSF）和全血微量细胞数（10–100000个细胞）的优化染色panel
OMIP-042	OMIP-042：21色流式细胞仪对人外周血中主要淋巴细胞和骨髓亚群进行全面免疫表型分析	接受异基因造血干细胞移植治疗的GVHD患者的PBMC的21色免疫表型分析
OMIP‐052	OMIP‐052：用于检测恒河猴Th1、Th2、Th17和Tfh反应的18色panel	非人灵长类动物，胞内细胞因子染色
OMIP‐056	OMIP‐056：通过胞内细胞因子染色评估人传统T细胞、供体非限制性T细胞和自然杀伤细胞（包括记忆表型）	26色染色panel可对冷冻保存的健康PBMC中的抗原特异性T细胞进行分析
OMIP-062	OMIP-062：14色、16种抗体的panel，用于对在小体积全血和儿科气道样品中的人固有淋巴细胞、髓样和T细胞进行免疫表型分析	适用于小体积、细胞数量少的全血优化染色panel

 

什么是滤泡辅助T细胞（Tfh）？

滤泡辅助T细胞（Tfh）是参与体液应答的CD4阳性辅助性T细胞的一个亚群。Tfh细胞存在于次级淋巴组织中，包括扁桃体、脾脏和淋巴结。Tfh细胞的作用是触发生化中心（GC）B细胞分化成分泌抗体的浆细胞和记忆性B细胞。因此，Tfh细胞是增强免疫应答的关键，了解它们的功能有助于对疫苗的开发。

生发中心作为特殊的微环境

生发中心（GC）是次级淋巴器官感染或免疫后形成的显微解剖结构。GC是B细胞增殖、多样化和增加抗原亲和力的场所。GC分为两个部分——暗区（DZ）和明区（LZ），它们有不同的功能和细胞类型（表1），影响着GC B细胞的功能。DZ充满了高度增殖的B细胞，这些B细胞发生高频突变以生成多种抗体。LZ更具有多样性，有滤泡树突状细胞（FDC）、Tfh细胞、巨噬细胞以及naive和GC B细胞。LZ细胞之间协同工作，例如，记忆性B细胞或浆细胞被巨噬细胞能清除，或被引导回DZ再次经历高频突变。

表 1.目前在生发中心发现的细胞列表。

暗区	明区
CXCR4HiCD83Low GC B细胞增值标志物	CD83HiCD86Hi GC B 细胞
CXCL12网状细胞	CD35和CD21滤泡树突状细胞
	CXCR5 Tfh细胞
	Naive IgD+ B细胞
	Foxp3 Tfr细胞
	CD11b F4/80着色小体巨噬细胞
名词缩写表：CD，分化抗原簇；CXCR，趋化因子受体；FDC，滤泡树突状细胞；RC，网状细胞；Tfh，T滤泡辅助细胞；Tfr，滤泡调节性T细胞；Low：低表达水平，Hi：高表达水平。

识别Tfh细胞的标志物

Tfh细胞是cd4阳性细胞，其可表达高水平的趋化因子受体5蛋白和转录因子B细胞淋巴瘤6（BCL6）[6]。其他重要标志物包括趋化因子受体3、PD1和ICOS。Tfh细胞生成IL-21，以促进B细胞分化和亲和力成熟。GC Tfh细胞的标志物在人和小鼠中是保守的（表2）[1]。

表 2.目前人和小鼠Tfh细胞标志物列表。

物种	标志物	标志物类型
人和小鼠	CD3	谱系
	CD4
	CD8
	CD185 (CXCR5)	表面
	CD183 (CXCR3)
	CD278 (ICOS)
	CD279 (PD1)
	BATF	细胞内转录因子
	BCL6
	c-Maf
	IRF4
	STAT3
	IL-21	分泌
名词缩写表：CD，分化抗原簇；BATF，碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样；BCL，B细胞淋巴瘤；ICOS，诱导型t细胞共刺激物；IL，白细胞介素；IRF，干扰素调节因子；PD，程序性细胞死亡蛋白；STAT，信号转导和转录激活因子。

循环Tfh（cTfh）细胞体外模拟Tfh生物学

作为GC Tfh细胞的替代品，循环Tfh (cTfh)细胞正在被研究，以便了解体外疫苗应答[7]。在体外可能无法真正鉴别GC Tfh，因此需要从次级淋巴组织中分离GC区域，从而研究T细胞 - B细胞的相互作用。已经观察到，将cTfh细胞与自体naiveB细胞共培养生成浆细胞[8、9]。cTfh细胞可以用以下标志物来识别：CD4、CXCR5与PD1、CCR7、CXCR3、CCR6和ICOS ；cTfh细胞不表达BCL6。

Tfh分化

辅助性T细胞亚群的分化依赖于分化的CD4+ T细胞和特定细胞因子。1型和2型Th（Th1和Th2）细胞、Th17细胞和效应性T（Treg）细胞的强分化途径已得到确认。Tfh细胞分化需要多种因素共同促成，而非单一事件的结果[1]。人们普遍认为，Tfh的分化需要在IL-6和IL-21同时存在的情况下，用MHC II特异性多肽刺激naive CD4+ T细胞TCR。
 

研究工具

细胞因子在Tfh细胞分化中起着重要作用，尽管有报道称小鼠和人在关键作用的细胞因子存在差异。例如，IL-6与共刺激分子ICOSL共同构成小鼠Tfh细胞分化的有效诱导剂，而IL-6在人Tfh分化中的作用还未明确。相比之下，使用IL-12与转化生长因子-β或激活素A在体外分化得到人Tfh细胞，但这些条件能使小鼠Tfh细胞分化。在所有抑制性细胞因子中，IL-2是Tfh分化最有效的抑制剂。

Tfh细胞分泌的主要细胞因子包括IL-21和IL-4，它们与共刺激分子CD40L共同提供B细胞增殖和分化所需的信号。IL-21的分泌在IL-4之前，只有生化中心的Tfh细胞完全分化完成时才能分泌IL-4。除了这些细胞因子，人Tfh细胞还分泌趋化因子CXCL13，它负责招募CXCR5+B细胞迁移至滤泡。

表3：参与Tfh分化和分泌的关键细胞因子。

	分化	分泌
Tfh细胞	IL--6、IL-12 +转化生长因子-β、IL-12 +激活素A	IL-21、IL-4、CXCL13、IL-10、IL-17A、IL-17F、IFN-g

可以使用酶联免疫吸附测定试剂盒（ELISA）或Invitrogen ProcartaPlex assays多因子检测试剂盒分析分化的细胞因子和趋化因子谱或Tfh细胞分泌的细胞因子和趋化因子。

物种	描述	分析物	货号
多因子检测
人	Immune Monitoring 65-Plex Human Panel	G-CSF (CSF-3), GM-CSF, IFN alpha, IFN gamma, IL-1 alpha, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17A (CTLA-8), IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-31, LIF, M-CSF, MIF, TNF alpha, TNF beta, TSLP, BLC (CXCL13), ENA-78 (CXCL5), Eotaxin (CCL11), Eotaxin-2 (CCL24), Eotaxin-3 (CCL26), Fractalkine (CX3CL1), Gro-alpha (CXCL1), IP-10 (CXCL10), I-TAC (CXCL11), MCP-1 (CCL2), MCP-2 (CCL8), MCP-3 (CCL7), MDC (CCL22), MIG (CXCL9), MIP-1 alpha (CCL3), MIP-1 beta (CCL4), IP-3 alpha (CCL20), SDF-1 alpha (CXCL12), FGF-2, HGF, MMP-1, NGF beta, SCF, VEGF-A, APRIL, BAFF, CD30, CD40L (CD154), IL-2R (CD25), TNF-RII, TRAIL (CD253), TWEAK	EPX650-10065-901
小鼠	Th1/Th2/Th9/Th17/Th22/Treg Cytokine 17-Plex Mouse ProcartaPlex Panel	GM-CSF、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17A （CTLA-8）、IL-18、IL-22、IL-23、IL-27、TNF alpha	EPX170-26087-901
单一分析物检测
人	IL-21人ELISA试剂盒	IL-21	BMS2043
	IL-4人ELISA试剂盒	IL-4	BMS225-2
小鼠	IL-21小鼠ELISA试剂盒	IL-21	BMS6021
	IL-4小鼠ELISA试剂盒	IL-4	BMS613

 

什么是细胞毒性T细胞？

细胞毒性T淋巴细胞（CTL）通常称为CD8+T细胞，是适应性免疫系统的关键组成部分，在免疫防御细胞内病原体如病毒、细菌和肿瘤中发挥重要作用[1]。例如辅助性CD4+T细胞（如Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Tfh和Treg），它们在胸腺中生成并表达αβ-T细胞受体或TCR。然而，与CD4+T细胞不同，它们的表面表达CD8+共受体并且对MHC I类的外源性抗原反应。

Naive/静息CD8+T细胞有惊人的能力，能扩增和分化为细胞毒性效应细胞，监视体机并清除感染。CD8+T细胞的缺失会破坏抗肿瘤免疫，增加对肿瘤生长的敏感性。CD8功能失调也可能引发过度的免疫反应，从而导致免疫介导的损伤或病理。一般情况下，循环和淋巴结驻留CD8+T细胞根据其分化状态细分为naive T细胞、效应性T细胞和记忆性T细胞亚群。

图 1.细胞毒性T细胞（CD8+T细胞）参与破坏靶细胞。

CD8+T细胞的发育

CD8+T-αβ细胞发育始于胸腺的淋巴祖细胞，在胸腺细胞变成单阳性（SP）CD8+或CD4+胸腺细胞（图2）之前，淋巴祖细胞先后经历双阴性（DN）（CD8– CD4–）阶段和双阳性（DP）阶段（CD8+ CD4+）。关于CD8+T细胞如何形成特异性，DP细胞通过与肽:MHC I类复合物的相互作用在胸腺皮质中进行阳性选择，生成CD8+SP细胞。随后这些SP细胞从皮质迁移到髓质，然后将在髓质中进行阴性克隆选择，以去除与自身抗原高亲和力结合的T细胞。最后，成熟单阳性CD8+T-αβ细胞被释放到循环中。

图 2.CD8+T细胞的发育阶段。在淋巴生成期间，T-αβ细胞由CD34+造血干细胞发育而来（这些干细胞在离开骨髓之前表达CD2、CD5和CD7标志物）。在胸腺中，这些细胞表达CD3，之后表达CD4+和CD8+（DP状态）。然后，这些细胞经过阳性和阴性克隆选择成为CD8+T-αβ细胞，被释放到循环中。

CD8+T细胞的活化和分化

Naive CD8+T细胞可识别MHC I类分子（主要组织相容性复合体）上的抗原，当被活化后成为细胞毒性CD8+T细胞（CTL）（图3）。树突状细胞（DC）等抗原呈递细胞（APC）通常在MHC I类分子中呈递内源性抗原肽，它们被TCR和CD8+T细胞上的CD8+共受体识别。DC呈递那些因病毒感染或肿瘤细胞引起改变的多肽，然后通过TCR结合活化抗原特异性的CD8+T细胞。

CD8+T细胞活化还需要额外的共刺激信号（如CD80/86信号），以及DC和活化CD4+T细胞分泌的细胞因子[2]。大多数CD8+T细胞活化都需要CD4+T细胞，以帮助CD8充分活化和上调共刺激信号并达到佳刺激状态。非CD4依赖性激活也可发生在某些感染因子上，如病毒和细菌，它们通过刺激toll样受体或诱导IL-1或I型干扰素的释放来激活DC。活化后，CD8+T细胞经历克隆扩增以形成表型和功能异质性效应细胞（其主要活动是清除受影响的靶细胞）。大多数效应细胞寿命都不长，在清除感染或肿瘤细胞后出现凋亡。小部分（5-10%）以不同的表型作为长寿命记忆性细胞存活下来；组织驻留记忆T细胞(tissue resident memory T cells, Trm)存在于发起原发反应的组织中、中枢记忆T细胞(Tcm)在次级淋巴组织中循环，效应记忆T细胞(Tem)在非淋巴组织中循环。。

图 3.CD8+T细胞活化和分化。抗原呈递细胞激活的CD8+T细胞可导致抗原特异性CD8+T细胞克隆扩增，然后分化为效应细胞或记忆细胞。效应性CD8+T细胞负责清除受感染的宿主细胞。名词缩写表：TRM，组织驻留记忆性T细胞；TCM，中枢记忆性T细胞；TEM，效应记忆性T细胞。

CD8+T细胞介导的细胞毒性

细胞毒性或细胞毒性CD8+T淋巴细胞（CTL）对靶细胞的杀伤可通过多种机制实现，并涉及一系列“精心策划”的事件，通常最终导致靶细胞的凋亡和清除（图4） 许多CTL通过释放细胞毒性颗粒来传递促凋亡分子，从而发起对靶细胞杀伤。TCR与MHC I类结合可促使储存在胞质溶胶中的穿孔素和颗粒酶合成。一旦结合，颗粒酶就被释放，则特异性靶向邻近的细胞使其死亡。穿孔素聚集在靶膜中，使颗粒酶进入靶细胞。颗粒酶是一组能活化半胱天冬酶的丝氨酸蛋白酶，可导致细胞死亡。

细胞间的直接接触非常重要。CD8+T细胞可结合表达于淋巴细胞和受感染靶细胞上的Fas受体和Fas配体（Fas L）从而诱导凋亡。此外，活化CD8+T细胞还可生成多种有助于宿主防御的细胞因子（包括IFNγ、TNFα和淋巴毒素-α）。IFNγ在增加MHC I类分子表达的同时抑制病毒复制，增加对感染细胞的识别。

抗病毒免疫作用：病毒感染后一周内，naive CD8+T细胞分化为效应细胞。病毒抗原被固有免疫细胞上的多种模式识别受体识别，从而导致I型干扰素生成，而I型干扰素又介导效应性CD8+T细胞反应的发展。由巨噬细胞和DC产生的IL-12能诱导T-bet，其介导细胞获得抗病毒细胞毒性功能。TNFα、IL-15和 IL-18等其他细胞因子可进一步增强CD8+T细胞反应。

抗肿瘤免疫作用：CD8+T细胞被视为抗肿瘤免疫的主要驱动因素[3]。CD8+肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）通过识别肿瘤抗原和直接杀死转化细胞来介导肿瘤排斥反应。肿瘤微环境中的效应性CD8+T细胞可生成IL-2、IL-12和IFNγ，提高CD8+T细胞的细胞毒能力，导致靶向肿瘤细胞杀伤。肿瘤微环境中的细胞毒性CD8+T细胞水平升高与各类癌症的抗肿瘤作用和预后改善有关。

A. CTL介导的直接杀伤——穿孔素和颗粒酶B

B. CTL介导的直接杀伤——死亡受体

C. CTL介导的间接杀伤

CD154在活化的CD4 T细胞上瞬时上调，通过连接CD40在T细胞/抗原提呈细胞相互作用中起着重要的共刺激分子作用。 由于其在激活后几小时内的瞬时表达，CD154可作为活化的抗原特异性CD4 T细胞的标记。在细胞刺激悬液过程中加入CD40阻断抗体，可阻止由于与抗原提呈细胞CD40表达的相互作用导致的CD154表达下调。 结合磁性细胞富集和CD154⁺CD4⁺T细胞的多参数流式细胞术分析，可以直接体外检测和表征罕见的抗原特异性T细胞。

01.分离PBMC并体外诱导CD154表达
分离PBMC
所需试剂	操作流程
Septube-15密度梯度离心管（PBM,#601115） Septube-50密度梯度离心管（PBM,#601150） ImunoSep™ Density Gradient Cell Separation Medium /淋巴细胞分离液/密度梯度分离液(PBM,#LSB1077) ImunoSep™ Cell Separation Buffer/细胞分选液(PBM,#604050)	1.将淋巴细胞分离液通过隔板中心的孔注入 SepTube管。 注入分离液的体积请参考下表。
	Septube™密度梯度离心管	起始样本（mL）	密度梯度分离液（mL）
	15	0.5-5.0	4.5
	50	4.0-17.0	17.0
	2. 抗凝血用等体积 ImunoSep™ Cell Separation Buffer 稀释，混合均匀。如：5 mL 抗凝 血用 5 mL ImunoSep™ Cell Separation Buffer 稀释。  3. 保持 SepTube管垂直，通过血清移液管将稀释的样品沿 管壁加入管中。样品将会和隔板上方的分离液混合，但不会影响分离效果。  注：样品也可以直接倒入 SepTube®管中，但要小心避免样品通过隔 板中央的小孔直接进入隔板下方的分离液中。 4. 在开启离心机制动器的情况下，室温 1200×g 离心 10 分钟。 注：如果样品在体外超过 24h 以上，建议离心 20 分钟以上。离心力（g）和转速（rpm）转换公式： 注：rpm：每分钟转速；RCF：相对离心力；Radius：离心机转子半 径（cm） 5. 离心完成后，可以将最上层不含细胞的ImunoSep™ Cell Separation Buffer稀释液吸出弃掉，或者直接将包含 MNCs 的上层稀释液直接倒入新的无菌离心管中。请勿倒置 SepTube®管超过 2 秒，以免底层红细胞倒出。 注：离心后，SepTube®隔板上表面可能存在少量红细胞，但这些少量的红细胞不会影响下游实验和细胞分离效果。如果 SepTube®隔板上表面发现有较多的红细胞，可能是由于采血时间较长引起的，此时可以继续 1200×g 离心 10 分钟，以减少红细胞的残留。 6. 向分离的 MNCs 中添加 0.5-1 倍体积ImunoSep™ Cell Separation Buffer (2μM EDTA) + 2% FBS，室温 300×g 离心 8 分钟洗涤细胞。 注：为去除分离 MNCs 中的血小板，可以关闭离心机制动器，室温120×g 离心 10 分钟洗涤 MNCs。
体外诱导CD154
所需试剂	操作流程
HapCult™RPMI 1640 培养基(PBM#609043)   100× L-glutamine stock solution (200 mM)(PBM#214010）   HapCult™ Human Platelet Lysate/人血小板裂解物（PBM#902010）   24孔培养板   CD40功能性抗体（#116-0409-81）   抗原特异性T细胞激活试剂PepTivator BKV VP1, 人（#130-097-272）     抗原特异性T细胞激活试剂PepTivator BKV LT – research grade人（# 130-096-504）   BFA（#00-4506-51）   FcR Blocking Reagent, human (# 130-059-901)	试剂准备：   - 准备PBMC培养基500 mL RPMI1640+ 5 mL 100× L-glutamine stock solution (2 mM final concentration)+ 25 mL 人血小板裂解物 (5%终浓度)。  - 1.为了重建冻干肽池，从-20°C取小瓶并预热至室温。 ▲注意：不要通过拆卸橡胶塞打开小瓶。  - 2. 为了溶解6nM浓度的PepTivator，用200μL无菌水填充无菌注射器(0.5mL）。 为了溶解60nM浓度的PepTivator，用2mL的无菌水填充无菌注射器(5mL）。  - 3.用无菌针头缓慢地将水通过橡胶塞的中心注入装有冻干肽池的小瓶中。  - 4.旋涡溶液完全溶解冻干肽池。 冻干肽母液浓度为30nM(约50μg）。  - 5.拆下橡胶塞，用吸管吸出原液。  - 6.为了避免循环反复冻融，从母液中准备工作液。  - 7.将你工作液存放在-80°C。 操作流程   1. 用含L-谷氨酰胺和5%人AB血清的RPMI1640培养基重悬细胞至1×107个细胞/mL。 2. 对于每个未经刺激的对照孔和经抗原刺激的样本孔，将1×107个细胞转移到24孔板的每孔中。 ▲注意：在透气培养板#150-000-362中，可以刺激多达2.5×107PBMCs/孔/mL，而在标准的24孔板中则是1×107PBMCs/孔/mL。 3. 在每个培养孔中加入10μL CD40功能性抗体(1μg/mL；1：100）。 4。根据制造商的推荐，在抗原刺激的培养孔中添加抗原，但在对照孔中不加。 使用PepTivator时：每个培养孔添加20µL重组母液。 5. 在37°C，5%CO2下孵育细胞4小时。 6. 加入BFA溶液，最终浓度为2µg/mL。 7. 在37°C，5%CO2下孵育细胞2小时。

 

皮肤作为人体最大的器官和屏障，在调节宿主面对病原微生物的免疫反应中发挥作用。皮肤组成结构紧凑，表皮（epidermis）由多层上皮细胞构成，内部包含不断增殖的角质细胞和分布其中的免疫细胞群体，如朗格汉斯细胞（Langerhans cells），是皮肤特化的巨噬细胞。表皮向内深入是真皮层，存在由免疫细胞组成的网络结构^【1】。皮肤内几乎所有细胞在接受特定的刺激下，都可以分泌细胞因子和趋化因子，活化固有免疫细胞和适应性免疫细胞，并招募外周血内白细胞驻留于皮肤；同样，外周血循环Treg细胞表面也普遍存在向皮肤归巢的标记物，提示这些Treg理论上可组成性驻留于皮肤组织。

皮肤解剖结构及内部细胞组成分布示意图

（Nature Review, doi.org/10.1038/s41577-019-0162-3 ）

 

皮肤驻留T细胞及表型

皮肤驻留T细胞作为独立T细胞群体引发学者关注始于2000年，发现将银屑病人的健康皮肤移植到免疫缺陷小鼠身上，小鼠也表现出银屑病的表型，提示”病原性T细胞”预先已存在于“健康“的皮肤内^【2】。后来有研究量化皮肤内记忆T细胞的数量是外周血液内数量的4倍，且表型分析发现这些记忆T细胞大多类似Treg细胞，可大量分泌IFNγ，IL-17和IL-13等细胞因子^【3】。

分析由皮肤分离而来的Treg细胞表型和功能，也获得了许多有趣的发现：

• 与固有层内驻留Treg主要为pTreg的特性不同，皮肤内80% Treg主要为表达GATA3和Nrp1-Helios的胸腺来源tTreg细胞^【3】。

• 成人皮肤几乎所有Treg细胞都为CD45RO阳性，几乎不表达CD45RA；但胎儿期皮肤中的表型则刚好相反。

• 成人皮肤中Treg高表达有与记忆T细胞相关的标记物，如CD27和 BCL‑2；与皮肤内的效应记忆T细胞（effector memory T cells）比较发现，记忆Treg细胞表达独特的T细胞受体序列但不表达CC-趋化因子受体CCR7 ,因此在体条件下无法迁移出皮肤。

这些结果都进一步说明，成年皮肤中Treg细胞具有记忆效应细胞的表型，可以识别独特的抗原，且能稳定驻留于皮肤组织内^【4】。

 

皮肤正常功能离不开Treg

组织修复是皮肤的核心功能之一，皮肤驻留Treg通过表达表皮生长因子受体，促进了Treg细胞在损伤部位聚集并调控炎性因子分泌细胞的积累，发挥促进组织损伤后的修复功能^【5】。

皮肤的另一个重要生理功能是维持毛囊发生，这一功能也是通过Treg细胞促进皮肤干细胞的增殖和分化发挥功能的^【6】。事实上，毛囊也恰恰是Treg细胞乐于积累的部位。有趣的现象发生了：同样是Treg细胞，同样是屏障结构，但Treg在皮肤则促进干细胞向皮肤组成细胞的分化，在肠道则促进多能性维持和干细胞的自我更新，再次体现了组织对内驻留Treg细胞的表型塑造。皮肤、皮肤驻留Treg功能正常受多种因素影响：

• 微生物群

微生物种群的存在对新生个体皮肤发育过程中Treg细胞的增殖发挥重要作用，有研究人员比较了分别于去除特定病原体（Specific pathogen-free）即SPF环境和完全无菌(Germ-free)环境下繁育的新生小鼠，完全无菌环境中的新生小鼠皮肤内Treg细胞数量显著缺乏。对比同一个体不同身体部位的皮肤，如躯体和耳部皮肤，其中所含Treg细胞含量也有明显差异。

特殊菌群如痤疮丙酸杆菌（学名Propionibacterium acnes），可干扰皮肤内Treg细胞增殖并诱导吞噬细胞释放多种炎性介质诱导局部产生炎症反应，最终破坏皮脂腺形成痤疮。

• 紫外线的影响
  

皮肤是经常面临紫外线照射的器官，UVB已被证实存对皮肤内免疫抑制的功能^【7】，临床上可见采用紫外照射治疗银屑病、特应性皮炎等多种皮肤病。UVB 照射可显著增加Nrp1⁺ tTreg 细胞的扩增，这是紫外引发免疫耐受的最主要机制。此外，皮肤接受紫外照射有助于膳食中的胆固醇衍生物转化为维生素D3，体外实验发现，CD4⁺ T细胞接受维生素D3作用可转化为Treg细胞；体外对朗格汉斯细胞给予维生素D3，可诱导其分泌大量的TGF-β，有助于Treg形成。

皮肤角质细胞分化并形成角质层，成纤维细胞产生胶原、弹性蛋白和其他多种糖蛋白，赋予皮肤韧度和弹性。皮肤以其结构特性行使屏障使命的同时，给皮肤解离带来了巨大困扰。

人和小鼠皮肤解离开发的试剂盒

 

参考文献

【1】    Ali, N. & Rosenblum, M. D. Regulatory T cells in skin. Immunology 152, 372–381 (2017).

【2】    Boyman, O. et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J. Exp. Med. 199, 731–736 (2004).

【3】    Clark, R. A. et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J. Immunol. 176, 4431–4439 (2006).

【4】    Malhotra, N. et al. RORα-expressing T regulatory cells restrain allergic skin inflammation. Sci. Immunol. 3, eaao6923

【5】    Schenkel, J. M. & Masopust, D. Tissue-resident memory T cells. Immunity 41, 886–897 (2014).

【6】    Vincent, M. S. et al. CD1-dependent dendritic cell instruction. Nat. Immunol. 3, 1163–1168 (2002).

【7】    Nosbaum, A. et al. Cutting edge: regulatory T cells facilitate cutaneous wound healing. J. Immunol. 196, 2010–2014 (2016).

【8】    Schwarz, T. 25 years of UV-induced immunosuppression mediated by T cells-from disregarded T suppressor cells to highly respected regulatory T cells. Photochem. Photobiol. 84, 10–18 (2008).

【9】    Stockenhuber, K. et al. Foxp3+ Treg cells control psoriasiform inflammation by restraining an IFN-I-driven CD8+ T cell response. J. Exp. Med. 215, 1987–1998 (2018).

 

 

 

 

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调节性T细胞（Treg）除了在外周血内存在，对免疫反应发挥抑制性调节作用之外，越来越多的研究表明，在如小肠、皮肤等多种组织内存在Treg (Tissue-resident Treg，组织驻留Treg)。这些特定组织形成独特的“功能微环境”，也为身处该环境的Treg带来了组织标签，如脑驻留Treg表达有神经系统特定基因Htr7，这通常是5-羟色胺受体的编码基因^【1】；组织驻留Treg也会具有不同的表型、代谢需求，如不同于外周血循环Treg对IL-2的需求，组织驻留Treg不依赖于IL-2，但IL-7和IL-33对其体外长期生存和基因、功能稳定发挥重要作用^【2，3】。组织驻留Treg在组织稳态和重塑方面发挥更为突出的作用。

了解组织特异性驻留Treg细胞，对于当前以工程改造免疫细胞用于自身免疫疾病的细胞疗法开发意义深远：充分利用其组织特异性，根据实际需求改造出可靶向特定组织且具有组织修复功能或是高效迁移入淋巴器官恢复免疫耐受功能的工程化Treg。

Treg与脑损伤

脑损伤或神经退行性疾病的发生后小胶质细胞介导神经炎症发生，血脑屏障功能受损，内皮细胞释放大量炎性细胞因子募集外周免疫细胞浸入脑实质引发次级损伤。有大量基于动物模型的文献表明，过继性输入体外扩增的Treg可对脑缺血引起的脑损伤及次级损伤有明显的缓解作用^【4，5】。但脑内是否驻留有Treg，来源于胸腺发育的自然Treg (natural Treg, nTreg)还是诱导性Treg (Induced Treg, iTreg)? 关于小胶质细胞是脑组织内免疫细胞的结论长久以来充满争议，那么其与小胶质细胞又有何关联？这些问题在最近一期Cell得到了答复，该文首次证实了人和小鼠脑内保守性地存在的一群脑特异性CD4 Treg，明确了外周血存在的与脑特异性Treg的表型差异，揭示后者浸入脑组织的机制及其在出生后小鼠脑小胶质细胞发育中的关键作用^【6】

关于小胶质细胞

- 小胶质细胞被认为是驻留于脑组织内的免疫细胞，为脑组织提供固有免疫监测、炎性反应和组织修复的功能；  - 小胶质细胞对神经元成熟的促进贡献体现在“ synaptic pruning”，即将过多未形成突触的突起”修剪“除去；  - 小胶质细胞在胚胎期末数量达到顶峰，出生后逐渐减少但开始成熟，大约出生后8周数量趋于稳定且功能成熟。

CD69是脑驻留CD4 T细胞标记物

正常小鼠脑基底膜内存在脑驻留CD4 T细胞，经过定量大约有2000个CD4 T，其中Treg的比例为7.5%（高于外周血内5%的比例）。脑驻留CD4 T与外周血来源细胞最显著的表型差异在于脑驻留CD4+ T细胞中缺乏Naïve亚群但具备CD69+ CD4亚群的扩增；除CD69，脑驻留Treg比外周来源Treg还高表达了CTLA-4，ICOS等激活标记物。通过共生实验发现，脑驻留CD4+ T细胞从外周血而来，初期均为CD69-后转变为CD69+并且该转变过程为瞬时, 激活的常规CD4+T（Tconv）细胞和Treg较未激活的同类细胞均表现出更高的转化效率；CD69-CD4+ T细胞在脑组织内的存留时间约为2-3周，远远短于CD69+CD4+ T细胞；结合多种方法学验证，认为脑驻留CD4 T细胞的标记物为CD4+CD69+。

脑驻留Treg可抗原依赖性进入并驻留脑组织

在研究外周血CD4 T细胞如何进入脑组织的机制时利用Nur77-GFP转基因小鼠，发现CD4+T细胞进入脑组织必须以激活态作为前体条件，但进入脑组织后的CD4 Tconv不再依赖TCR的功能和抗原的存在；但CD4 Treg则有赖于脑内特异性抗原的持续存在。

小胶质细胞成熟依赖脑驻留CD4+T细胞

MHC-II 敲除小鼠表型与胸腺发育抑制小鼠表型一致，可观察到外周血和脑组织内CD4+T细胞缺乏。通过对比野生型小鼠和MHC-II敲除小鼠小胶质细胞单细胞测序结果发现，MHC-II敲除小鼠脑内小胶质细胞转录表达谱滞留于非成熟阶段。形态学分析，MHC-II敲除小鼠小胶质细胞形态呈树突细胞样。同时，神经元存在大量未成熟的细长突起，这是小胶质细胞功能障碍的显著标志，在多种人神经系统疾病中均可见，如唐氏综合征和雷特综合症。对转基因小鼠的行为学分析印证了小胶质细胞的相关功能：MHC-II敲除小鼠出现焦虑性行为、空间学习记忆和条件性学习能力显著下降的表现。

获取成熟小胶质细胞并开展脑驻留Treg研究，离不开温和可靠的成年鼠脑解离。基于Adult Brain Dissociation kit和gentleMACSTM Octo八通道组织解离器的最优解离方案：

 - 30分钟完成成年小鼠全脑单细胞悬液制备；

 - 无需剥除脑膜和灌注冲洗；

 - 可用于成年脑所有细胞类型的获取；

 - 满足各种下游应用：原代培养、单细胞测序、流式分析

美天旎提供用于Treg核内标记物流式鉴定的多种抗体试剂盒，包含的核转录因子标记缓冲液令核内标记流式分析轻松高效：

Anti-T-bet, human and mouse (REA102)

Anti-Helios, human and mouse (REA829)

Anti-FoxP3, mouse (REA788)

 

参考文献：

【1】Ito M. et al. Nature (2019): 565, 246-250

【2】Gratz, I. K. et al. J. Immunol. (2013): 190, 4483–4487

【3】Vasanthakumar, A. et al. Nat. Immunol. (2015) 16, 276–285

【4】Mao L. et al. Brain (2017) 140, 7:1914-1931

【5】Liesz A. Nat. Med. (2009)15, 192-199

【6】Pasciuto E. et al. Cell, (2020)182:1-16

 

 

 

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肠道因其持续暴露于不同的抗原而形成独特的组织微环境，具备特定的免疫耐受性以维持组织稳态保护组织免受损伤，这便是屏障组织内Treg细胞有别于其在外周血所具备的独特功能，肠道固有层内大量Treg细胞在维持对膳食组分及肠道微生物群落的免疫耐受中发挥重要作用。

体内所有组织都存在Treg细胞，且总含量为CD4⁺T细胞总数的10%左右，Treg在肠道中的含量则远远高于其他组织：小肠固有层内含量为CD4⁺ T细胞的20%；直结肠固有层内含量更高达CD4⁺T细胞总数量的30%^【1-5】。

 

肠道固有层Treg发育

现已知Treg由两大主要发育途径而来：胸腺衍生Treg (tTreg)和外周诱导衍生Treg (pTreg),后者是胸腺内发育的Naïve CD4⁺T细胞在外周遭遇抗原刺激且存在TGF-β， IL-2、视黄酸等因子存在的条件下转换而来的。肠道微环境更倾向pTreg的生成，其主要贡献者是位于肠道固有层内存在的大量CD103⁺树突状细胞，这些树突状细胞通过穿过小肠内皮细胞层（IEC）的突起获取肠腔内抗原并进行抗原呈递；同时CD103⁺树突细胞还具有avβ integrin的活性将TGF-β转化为活性形式，同时也具备利用特定的酶将维生素A转化为视黄酸这三重促进Treg生成的功能，这些功能都加强了肠道对pTreg的诱导生成和归巢能力。

图片来自:Clough JN, et al. Gut 2020;69:942–952.

虽然尚无确切细胞标记物用于tTreg和pTreg的区分，但已有研究报道且被证实核转录因子Helios和表面蛋白Nrp1(neuropilin-1)双阳性表达只出现在tTreg而非pTreg，这是现阶段区分两者的有效方法^【6】。

 

Treg的异质性

目前存在多种解释Treg发挥免疫抑制功能的机理，如肠道固有层内Treg细胞组成性表达CTLA-4，该分子参与负向调节效应T细胞活化时CD28与抗原呈递细胞表面CD80/CD86的共激活；又如具有接近TH1, TH17和TH2转录谱的Treg细胞分别对TH1, TH17和TH2发挥抑制作用，反映了Treg细胞表型与抑制应答细胞类型的对应关系。目前尚无明确证据表明肠道Treg细胞偏爱何种抑制机制，因此，充分研究Treg细胞的异质性意义重大。

已有大量研究提示肠道内Treg具有表型和功能的高度异质性，比如：

• 建立微生物耐受的Treg

肠道微生物群促进了RORγt⁺pTregs的大量扩增，这些pTregs具有稳定的抑制性表型且为建立针对微生物的免疫耐受作用显著；

• 建立膳食蛋白质耐受的Treg

RORγt- pTregs 也同样受膳食抗原的诱导，但主要功能是抑制TH1对食物所含蛋白质产生的免疫反应；

• 肠粘膜修复的Treg

小肠内存在GATA3阳性的tTreg亚群，显示其存在IL-33受体ST2和表皮生长因子配体amphiregulin(AREG)的高表达，而AREG在组织损伤响应引起的损伤修复中已得到证实，因此GATA3⁺tTreg细胞被认为在修复肠粘膜损伤中有重要作用。

美天旎Lamina Propria Dissociation kit, mouse专为小鼠肠道固有层高效解离设计，保证肠道细胞高得率的同时，有效维持固有层内免疫细胞表面抗原，为固有层内Treg、DC等多种免疫细胞的分离、富集及下游单细胞测序分析等应用提供有力工具。 流式细胞分析小鼠结肠固有层内CD4+FoxP3+ Treg细胞。 (A) 流式细胞分析图展示解离后细胞群FoxP3和CD4的表达情况。(B) 对比传统手动组织解离方法和使用Lamina propria dissociation kit, mouse搭配gentleMACS组织解离器预置程序后所得活性CD3+CD4+FoxP3+ Treg 细胞数量(n = 3 per group)。

Treg细胞表面抗原Nrp1对于酶解非常敏感，在普通酶混液作用下出现明显降解。使用Lamina Propria Dissociation kit, mouse无论进行手动解离还是基于gentleMACS的标准自动化解离，解离后细胞Nrp1表达均得到很好的维持。

(A)对比基于Lamina Propria Dissociation Kit（货号#130-097-410）手动和自动化解离小鼠直结肠得到的CD4⁺FoxP3⁺ Treg 细胞，其表面Neuropilin-1(Nrp1)表达水平直方统计图。

(B) 流式细胞分析两种方法得到小鼠直结肠CD4⁺FoxP3⁺ Treg 细胞表面平均荧光强度 (n = 2, per group) 。

美天旎提供多种用于人和小鼠Treg流式分析的试剂盒，其中包含多种细胞表面标记物抗体及胞内标记物抗体；特殊经优化的溶液系统令胞内标记稳定、信号明亮。

 

Treg检测试剂盒，人	130-122-994	胞外标记物：CD45、CD4、CD25、CD127 胞内标记物：Foxp3（含经优化的Foxp3染色缓冲液）
Treg检测试剂盒，小鼠	130-120-674	胞外标记物：CD4、CD25 胞内标记物：Foxp3（含经优化的Foxp3染色缓冲液）

Treg分析举例

数据展示Treg细胞亚型流式分析图。使用CD4⁺CD25⁺CD127^dim/- Regulatory T cell Isolation Kit II, human从人PBMC分离Treg细胞，并采用如下标记策略对Treg 细胞进行标记：CD25-VioBright FITC, CD127-PE-Vio 770, Anti-FoxP3-APC, Anti-Helios-PE, CD45RA-PE-Vio 615, CD45RO-VioBlue和Anti-Ki-67-PE，并获得Treg 亚群（P1, P2 和P3）。

 

参考文献

1. Round, J. L. & Mazmanian, S. K. Inducible Foxp3+ regulatory T.cell development [1-5] a commensal bacterium of the intestinal microbiota. Proc. Nat Acad. Sci. USA 107, 12204–12209 (2010).

2. Atarashi, K. et al. Induction of colonic regulatory T cells by indigenous Clostridium species. Science 331, 337–341 (2011).

3. Geuking, M. B. et al. Intestinal bacterial colonization induces mutualistic regulatory T cell responses. Immunity 34, 794–806 (2011).

4. Weiss, J. M. et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. J. Exp. Med. 209, 1723–42 (2012).

5. Stefka, A. T. et al. Commensal bacteria protect against food allergen sensitization. Proc. Natl Acad. Sci. USA 111, 13145–13150 (2014).

6. Nutsch, K. et al. Rapid and efficient generation of regulatory T cells to commensal antigens in the periphery. Cell Reports 17, 206–220 (2016).

 

 

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免疫耐受通过主导机制(Dominant Mechanism)和退行机制(Recessive Mechanism) 实现即时的机体免疫调制。退行机制是细胞自发性的过程，令能识别并对自身引起免疫响应的细胞去除或使其失去免疫功能(anergy)，亦或增加细胞表面抑制性抗体提高其激活阈等途径；主导机制，这是由特定细胞群体主动对免疫细胞激活、扩增和发挥功能进行积极抑制的过程，因此可对免疫反应的强度和持续性进行调控。

调节性T细胞在免疫调制中通过极强的特异性发挥功能，因此在自身免疫疾病治疗中比传统免疫抑制剂拥有更高的精准性可控性而被看好。今天就Treg细胞功能的检测方法、抗原特异性Treg细胞的意义及其应用于临床转化过程中扩增的技术细节探讨。

Treg免疫抑制功能的检测方法

 

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Treg的功能检测方法分为离体和在体两种，离体实验主要通过量化Treg对效应T细胞(Teff)增殖或混合免疫细胞群体反应(mixed lymphocyte reations)的抑制，该法被广泛采用的原因也是最大优点在于操作简便且数据可靠易重复，但局限性在于不能很好的模拟Treg在体的表型：Treg在体条件有极高的扩增能力，但离体条件下即使面对特异性抗原的激活，依然扩增能力低下。所以在体实验是必须的，通过衡量人源化小鼠弱化GvHD发病程度来完成。

最基本的离体抑制实验是通过等倍比稀释Treg的数量，研究加入CD3/CD28 通用T细胞激活物后，进行细胞计数确定不同Treg数量对常规T细胞Tcon的增殖抑制情况，如下图所示：

图片来自：Lauren. W. In Vitro Treg Suppression Assay. Methods Mol Biol. (2011): 707: 21–37.

由于CD3/CD28的T细胞激活物不能较好地模拟刺激抗原，因此引入抗原呈递细胞(APC)对Tcon激活在模拟生理激活的角度有提升。小鼠实验通常采用辐照过地脾细胞或树突状细胞(Dendritic Cell, DC)联合CD3激活抗体用于Tconv激活和增殖；人Treg细胞抑制实验可采用辐照过的PBMC作为抗原呈递细胞。

需要值得注意的是，人为引入的抗原呈递细胞组分增加了系统的复杂度，这些细胞在刺激Tconv的同时也存在对Treg的调控作用，相关数据解读需更谨慎。

在体抑制实验可以用接受人皮肤移植物的人源化小鼠模型，对比接受或不接受Treg细胞对移植物的排斥反应及小鼠生存期来举例说明。

图片出处：Fardi I. et al. Transplantation. (2010) December 27; 90(12): 1321–1327.

实验流程如上图所示，对BALB/c Rag2−/−;Il2rγ−/− 小鼠（缺乏T、B、NK细胞）进行人来源皮肤移植。移植术后输注另一供体来源的PBMC，其后对小鼠多器官嵌合状态和移植物内免疫细胞（如CD8+）浸润情况进行监测，并对比是否给予扩增后自体Treg的影响。

美天旎Treg Suppression Inspector, human试剂盒（货号#130-092-909）为基于人来源Treg的体外抑制实验提供稳定可靠的Tcon激活，保证了实验结果的稳定。Treg Suppression Inspector是一种专门为Treg体外抑制实验优化的T细胞激活剂，结构上是偶联有CD2, CD3和 CD28功能抗体的anti-Biotin磁珠。CD4+CD25-或CD4+ T细胞被微珠激活后开始增殖，而Treg 细胞则不被激活，二者共培养后效应T细胞增殖能力受 Treg的抑制而降低。 （左）CD4+CD25+ Treg和CD4+CD25- Tresp和Treg Suppression Inspector MACSiBead™ Particles 以不同比例进行共培养。5天后使用CD4-VioBlue和CD25-PE染色标记后进行流式分析。起始Tresp:Treg比例为8:1。（右）显示共培养5天后Tresp 的增殖情况，反映了Treg的抑制功能。

Treg特异性与抗原特异性Treg细胞

 

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用于过继性细胞疗法（Adoptive Cell Transplantation）所需要的细胞数量在10⁶到10⁹ 数量级不等，体外扩增Treg满足治疗所需细胞量是关键。目前绝大多数临床试验都是基于体外多克隆扩增（CD3/CD28激活）得到的Treg细胞，但抗原特异性Treg细胞在组织靶向性、定向迁移、持续存活和局部发挥免疫抑制效应等方面更具优势。抗原特异性Treg带来的最大优点在于，使用的细胞量更少，避免了扩增过程中出现 “不想要”的细胞类型带来的副作用，也避免了广泛免疫抑制效应的发生。

抗原特异性Treg细胞扩增需要使用异体来源B细胞、DC细胞等抗原呈递细胞实现。但体外B细胞无法完成抗原水解呈递过程，而DC-依赖的Treg细胞扩增过程较复杂：多重培养、大量细胞因子的搭配和使用、较长的细胞扩增周期等等；与此同时，DC本身就具有免疫抑制的表型，抑制目的T细胞亚群的扩增。由此，人工抗原呈递细胞(Artificial Antigen Presenting Cell, aAPC)或类似物的使用在转化应用领域优势更为突出。K562 细胞系不表达MHC 分子或共抑制/激活分子，因此有效避免了异体T细胞引起的免疫反应；但表达T细胞-APC互作关键分子ICAM-1和多种细胞因子，这在体外进行抗原特异性Treg细胞意义巨大。

对于抗原特异性激活的Treg细胞，可从CD154表达阳性的细胞群内分选获取。CD154 是CD4⁺ T 细胞被激活后短暂上调的表面标记物，在T细胞/APC通过CD40分子的连接中起到共激活的作用。CD154 被用于抗原特异激活CD4⁺ T细胞的特异性标记物。

美天旎独特的PepTivator抗原肽片段库系列提供覆盖完整抗原序列的肽库，均由长度为15个氨基酸且相互存在11个氨基酸序列重叠的片段组成，达到充分结合MHC激活TCR的作用，且便于抗原结合片段的确定；GMP级别产品满足临床转化需求。多种抗原肽库用于自身免疫疾病研究：CHI3L2, Desmoglein, GAD65, Insulin, MBP(Isoform 1, Isoform 5), MOG, Ovalbumin, PLP和IA-2。同时，CD154 MicroBeads可完成精准高效的富集。

说到排斥反应最显著的是皮肤移植物，不得不说到组织特异性Treg细胞，ta们有哪些特性？

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调节性T细胞（Regulatory T Cells, Tregs）是一类专职抑制免疫活性、维持机体免疫平衡的免疫细胞。虽然含量较低，而且将Treg作为单独一类T细胞开展研究直到90年代才开始，但Treg在免疫调节中的重要性不容忽视。除针对Treg开展的基础研究，基于Treg的细胞治疗方案应用于过度免疫激活引发的组织损伤、自身免疫疾病也正成为免疫细胞治疗的热点分支。

Tregs知识概要

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 - Treg含量低，只占外周血CD4⁺ T细胞总数量的5%；

 - Treg细胞可通过调节表面细胞因子受体和转录因子的表达和改变分泌细胞因子类型等机理，特化为I型辅助样T细胞 (TH1 cell-like), II型辅助样T细胞 (TH2 cell-like)和产生IL-17的辅助样T细胞（IL-17-producing helper T cell），分别对TH1, TH2和TH17细胞群体发挥抑制功能。甚至有研究认为，只有表型接近于这三大类辅助T细胞的，才能被Treg所抑制；

 - Treg具有显著的表型不稳定性，在极剧的炎性环境中可丢失FOXP3表达并失去免疫抑制功能，转变为效应性T（Teff）细胞；

 - Treg细胞的免疫抑制功能主要依靠旁路抑制和感染耐受实现。所谓旁路抑制，就是特异识别某一抗原的Treg细胞将抑制所有其他抗原特异性T细胞；感染耐受指某一群细胞所具有的免疫抑制性可以传递给另一群细胞，这主要是依靠Treg细胞分泌抑制性细胞因子作用于DC，抑制DC的成熟和迁移并制造了一个导致耐受的局部环境，在这个环境中Teff细胞将大量凋亡，naïve T细胞转变为诱导型Treg（iTreg）细胞。

前途可期但困境重重的Treg研究

 

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截至2019年7月，全球注册的基于Treg的细胞治疗项目共51项，充分展示了Treg被广泛看好用于自身免疫疾病、自身炎症反应和移植工程抵抗排斥的前景；但其高失败比率（5项提前终止，4项停滞、2项撤回）也充分提示，Treg的研究特别是细胞制备工艺充满诸多挑战亟待攻克，这都是由Treg的自身特性决定的：

• 多重标记物

Treg细胞最严格的鉴定标记物是核内转录因子FOXP3：FOXP3基因不表达直接导致Treg细胞丧失免疫抑制功能，该基因出现突变可导致严重的自身免疫疾病，最为人知的就是免疫失调性多内分泌腺病性肠病x连锁综合征，所以当前转化研究和临床实验采用最多的Treg鉴定标准为CD4⁺FOXP3⁺细胞。

其他与Treg功能相关的细胞表面标记物如常用的CD25。CD25亦被称为IL-2受体α亚基，高表达CD25但自身不分泌IL-2也是Treg细胞的重要特征，这也部分解释了在极度促炎性的环境中由于缺乏周围细胞分泌的IL-2刺激，Treg细胞将转变为Teff细胞的原因。CD127(又称IL-17受体α亚基)与T细胞的增殖和活化关系密切，更重要的是，CD127的表达与FOXP3、Treg的免疫抑制性功能存在负向关联，因此CD4⁺CD25⁺CD127^low/-常被用于Treg细胞分选的标记物组合。

美天旎为调节性T细胞研究提供高性能磁珠分选产品，基于多种表面标记物组合的分选策略，灵活满足不同种属来源细胞（人，小鼠，非人灵长类）的不同应用需求。

 

货号	名称	起始样本
130-091-301	CD4+ CD25+ Reg. T Cell Iso. Kit, human	人PBMC
130-093-631	CD4+CD25+CD45RA+ Reg TC Iso Kit, human	人PBMC
130-094-775	CD4+CD25+CD127dim/- Reg TC Kit II, human	人PBMC
130-094-551	CD25+CD49d- Reg T Cell Iso Kit, human	人PBMC
130-055-101	CD4 Multisort Kit, human	人外周血、骨髓、细胞培养物或组织单细胞悬液
130-091-041	CD4+ CD25+ Reg. T Cell Iso. Kit, mouse	小鼠脾脏和淋巴结单细胞悬液
130-092-984	CD4+CD25+ Treg Cell Isol. Kit, nhp	恒河猴PBMC

• 扩增困难

与效应T（Teff）细胞类群比较，Treg的增殖能力较差，扩增速度较慢。当分离Treg细胞后需要体外扩增时就需格外注意细胞分选的纯度，因为随着体外培养时间的延长，培养物中混入的Teff细胞将过度增殖导致最终完全湮没Treg细胞。

Treg不同亚型的扩增能力不同，CD45RA⁺ Naïve Treg细胞处于静息状态，给予刺激后迅速进入扩增阶段并能较好维持Treg细胞的谱系；相比之下CD45RA^-CCR7⁺亚群是扩增能力最差的Treg。

多种组织、样本可作为获取人Treg细胞的来源，包括外周血、脐带血和小儿先天性心脏病外科手术时为便捷术中操作而摘除的胸腺。

外周血虽然是最方便易得的Treg来源，但其中的Treg含量较低给分离富集造成困难，但优点在于外周血来源Treg扩增能力较强；

小儿胸腺组织内有大量的Treg细胞，约300ⅹ10⁶个CD4⁺CD25⁺细胞，这相当于一个成年人全部外周血内所有的Treg数量。尽管小儿胸腺来源Treg多为CD45RA⁺，但体外扩增能力较弱。

• 表型不稳定性

Treg细胞具有基因和功能不稳定的特性，特别是在剧烈的炎性环境中易出现FOXP3表达缺失、丧失免疫抑制功能并转变为功能性T细胞(Teff)，进而加剧炎性反应和自身免疫反应。多种增强Treg稳定性的方法已有文献报道，过表达FOXP3, HELIOS或BACH2等核基因，甚至保持STAT5持续激活等方法均为有效。

Treg研究和应用是一个非常宽泛的话题，很多技术细节有待深度探讨：

1. 抗原特异性Treg细胞的重要性、扩增要点及功能验证方法

2. Treg是如何应用于移植工程对抗排斥

3. 浅谈组织特异性Treg（一）脑驻留Treg

4. 调节性T细胞研究和转化的关键-功能性和特异性

 

 

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