1. 样本制备及PCR选择指南

应用	步骤		推荐产品	货号
PCR和RT-PCR的样本制备	基因组DNA纯化		GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit全血基因组DNA小提试剂盒	K0781/K0782
				K0781/K0782
			GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit植物基因组DNA小提试剂盒	K0791/K0792
			GeneJET FFPE DNA Purification Kit FFPE石蜡包埋组织DAN提取试剂盒	K0881/K0882
			GeneJET Viral DNA and RNA Purification Kit病毒DNA和RNA提取试剂盒	K0821
			RNase A, DNase and protease-free	EN0531
			RNase A/T1 Mix	EN0551
			Proteinase K, recombinant, PCR grade	EO0491
	RNA纯化		GeneJET RNA Purification Kit RNA提取试剂盒	K0731/K0732
			GeneJET Whole Blood RNA Purification Mini Kit 全血RNA小提试剂盒	K0761
			GeneJET Stabilized and Fresh Whole Blood RNA Kit 稳定和新鲜全血RNA提取试剂盒	K0871
			GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit植物RNA小提试剂盒	K0801/K0802
	质粒提取		GeneJET Plasmid Miniprep Kit质粒小提试剂盒	K0502/K0503
	去除RNA中的DNA污染		DNase I, RNase-free	EN0521/EN0523/EN0525
	RNA和DNA沉淀		Glycogen, RNA grade	R0551
	RNA和DNA沉淀		Glycogen, molecular biology grade	R0561
第一链cDNA合成			RevertAid First Strand cDNA Synthesis Master Mix cDNA合成Master Mix	M1631/M1632
			RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit/cDNA合成试剂盒	K1621/K1622
			RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit, with DNase I	K16215/K16225
			RevertAid Reverse Transcriptase 反转录酶	EP0441/EP0442
			Maxima H Minus cDNA Synthesis Master Mix cDNA合成Master Mix	M1681/M1682
			Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit cDNA合成试剂盒	K1681/K1682
			Maxima H Minus Reverse Transcriptase	EP0751/EP0752/EP0753
			RiboLock RNase Inhibitor	EO0381/EO0382/EO0384
			TruScript Pro H Minus 反转录预混液含 DNase	FB02011005/FB02011020
			TruScript Core H Minus 反转录预混液含 DNase	FB02013005/FB02013020
			TruScript Pro H Minus 反转录预混液	FB02010005/FB02010020
			TruScript Core H Minus 反转录预混液	FB02012005/FB02012020
双链cDNA合成			Maxima H Minus Double-Stranded cDNA Synthesis Kit	K2561/K2562/K2563
普通PCR			DreamTaq Green PCR Master Mix (2×)	K1081/K1082
			DreamTaq Green DNA Polymerase DNA聚合酶	EP0711/EP0712/EP0713/EP0714
			DreamTaq PCR Master Mix (2×)	K1071/K1072
			DreamTaq DNA Polymerase DNA聚合酶	EP0701/EP0702/EP0703/EP0704
			2X TruTaq Green PCR 预混液, 200 次反应	FB02002020
			TruTaq DNA 聚合酶, 5 U/µL, 500 单位	FB02001050
			TruTaq DNA 聚合酶, 5 U/µL, 200 单位	FB02001020
热启动PCR			DreamTaq Hot Start DNA Polymerase 热启动DNA聚合酶	EP1701/EP1702/EP1703/EP1704
			DreamTaq Hot Start PCR Master Mix (2×)	K9011/K9012
			DreamTaq Hot Start Green DNA Polymerase	EP1711/EP1712/EP1713/EP1714
			DreamTaq Hot Start Green PCR Master Mix (2×)	K9021/K9022
高保真PCR			Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶	F530S/F530L
			Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	F531S/F531L
			Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase	F549S/F549L
			Phusion Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix	F565S/F565L
			Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix	F548S/F548L
			TruFidelis Plus DNA 聚合酶	FB02005050/FB02005010
			TruFidelis Core DNA 聚合酶	FB02008050/FB02008010
			TruFidelis Pro DNA 聚合酶	FB02003050/ FB02003010
			TruFidelis Plus+ DNA 聚合酶	FB02005550/ FB02005510
			TruFidelis Core+ DNA 聚合酶	FB02008550/FB02008510
			TruFidelis Pro+ DNA 聚合酶	FB02003550/FB02003510
			TruFidelis Plus Green PCR 预混液	FB02007050/FB02007010
			TruFidelis Pro PCR 预混液	FB02004050/FB02004010
			TruFidelis Plus PCR 预混液	FB02006050/FB02006010
PCR产物纯化	琼脂糖凝胶回收		GeneJET Gel Extraction Kit	K0691/K0692
	琼脂糖凝胶回收		Agarase	EO0461
	反应液中PCR产物纯化		GeneJET PCR Purification Kit	K0701/K0702
生产单链PCR产物			Lambda Exonuclease	EN0561/EN0562
测序用PCR产物纯化			GeneJET PCR Purification Kit	K0701/K0702
			Exonuclease I	EN0581/EN0582
			Exonuclease I	EN0581/EN0582
PCR克隆		克隆试剂盒	CloneJET PCR Cloning Kit	K1231/K1232
		平端化	T4 DNA Polymerase	EP0061/EP0062
		磷酸化	T4 Polynucletide Kinase	EK0031/EK0032
		磷酸化	T4多聚核苷酸激酶	FB02504250/FB02504050
		连接	T4 DNA Ligase	EL0011/EL0012/EL0013 EL0014/EL0016
			T4 DNA连接酶，5 U/µL, 1,000 单位	FB02503100
			Rapid DNA Ligation Kit	K1422/K1423
PCR或RT-PCR反应体系配制		核苷酸	dNTP Mix, 2 mM each	R0241/R0242
			dNTP Mix, 10 mM each	R0191/R0192/R0193/R0194
			dNTP Mix, 25 mM each	R1121/R1122
			dNTP/dUTP Mix	R0251
			dNTP Set	R0181/R0182/R0186
			Aminoallyl-dUTP	R0091/R1101
			Biotin-11-dUTP	R0081
			Fluorescein-12-dUTP	R0101
		水	Water, Nuclease-free	R0581/R0582
		水	DEPC-treated Water	R0601/R0603
		引物	Oligo(dT)₁₈ Primer	SO131/SO132
		引物	Random Hexamer Primer	SO142
PCR产物分析		琼脂糖	TopVision Agarose	R0491/2
			TopVision Agarose Tablets	R2801/R2802
			TopVision Low Melting Point Agarose	R0801
		电泳缓冲液	10×TBE Buffer	B52
			50×TAE Buffer	B49



		DNA Markers (DNA Ladder)	GeneRuler 10-300bp DNA 分子量标准	SM1211/SM1212/SM1213
			GeneRuler 25-700bp DNA 分子量标准	SM1191/SM1192/SM1193
			GeneRuler 50-1000bp DNA 分子量标准	SM0371/SM0372/SM0373
			GeneRuler 100-1000bp DNA 分子量标准	SM0241/SM0242/SM0243/SM0244
			GeneRuler 100-3000bp DNA 分子量标准	SM0321/SM0322/SM0323/SM0324
			GeneRuler 250-10000 kb DNA 分子量标准	SM0311/SM0312/SM0313/SM0314
			GeneRuler 75-20000 kb DNA 分子量标准	SM1331/SM1332/SM1333/SM1334
			GeneRuler 100-5000 kb DNA 分子量标准	SM1551/SM1552/SM1553
			GeneRuler 100-10000 kb DNA 分子量标准	SM0331/SM0332/SM0333/SM0334
			GeneRuler 10171- 48502 kb DNA 分子量标准	SM1351/SM1352/SM1353
		上样液	BlueJuice™ Gel Loading Buffer (10X)	10816015
			TrackIt™ Cyan/Orange Loading Buffer	10482028
			E-Gel™ Sample Loading Buffer, 1X	10482055
		上样染料	6X DNA 上样染料	R0611
			6X MassRuler DNA 上样染料	R0621
			6X Orange DNA 上样染料	R0631
			6X DNA 上样染料和 SDS 溶液	R1151
			6X TriTrack DNA 上样染料	R1161
PCR耗材		PCR管

2. DNA聚合酶及常规PCR

Taq DNA Polymerase, recombinant (5 U /µL)	Taq DNA Polymerase, recombinant (1 U /µL)	Taq DNA Polymerase, native，without BSA (5 U /µL)	DreamTaq DNA Polymerase	DreamTaq Green DNA Polymerase	TruTaq DNA 聚合酶, 5 U/µL
#EP0401/#EP0402	#EP0404	#EP0282	#EP0701/#EP0702/ #EP0703/#EP0704	#EP0711/#EP0712/ #EP0713/#EP0714	#FB02001050/ #FB02001020
PCR Master Mix (2×)	DreamTaq Green PCR Master Mix(2×)				2X TruTaq Green PCR 预混液
#K1071/K1072	#K1081/#K1082				# FB02002020

Taq DNA Polymerase

Taq DNA Polymerase是嗜热细菌Thermus aquaticus来源的一种高度热稳定的DNA聚合酶。该聚合酶能催化DNA的5'→3'合成，没有可检测到的3'→5'核酸外切酶(校正)活性，并且拥有低的5'→3'核酸外切酶活性。此外，Taq DNA 聚合酶具有脱氧核糖核酸转移酶活性，这种活性通常会导致在PCR产物的3'末端添加额外的腺嘌呤。重组Taq DNA 聚合酶适合扩增长度为5 kb或更短的模板，是标准PCR的一种理想的工具。天然的Taq DNA聚合酶优先扩增与大肠杆菌中发现的那些DNA序列相一致的细菌DNA序列。

特点:

• 热稳定 — 在95℃半衰期超过40分钟

• 产生具有3'-dA 末端的PCR产物

• 提供两种缓冲液 — 含有KCL的10x Taq Buffer以及含有(NH4)2SO4的10×Taq Buffer。后者可在较宽范围的Mg2+浓度下进行PCR并减少非特异性扩增

• 能结合修饰核苷酸(例如：生物素标记的核苷酸、地高辛标记的核苷酸、荧光标记的核苷酸)

应用

• 常规PCR，扩增长达5 kb的DNA片段

• DNA 标记

• 高通量PCR

产品组成

Taq DNA Polymerase (recombinant and native)提供有含有KCl的10xTaq Buffer、含有(NH4)2SO4的10xTaq Buffer以及25 mM MgCl2溶液。

Taq DNA Polymerase, recombinant (5 U /µL)	#EP0401（100 units）
	#EP0402 （100 units）
	#FB02001050(500 units)
	#FB02001020(200 units)
Taq DNA Polymerase, recombinant (1 U /µL)	#EP0404 （500 units）
Taq DNA Polymerase, native，without BSA (5 U /µL)	#EP0282 （500 units）

图3.1 Taq DNA聚合酶在含有(NH4)2SO4和不同MgCl2浓度的10x Taq DNA Buffer进行的PCR

在较宽范围的Mg2+浓度下对来自人基因组DNA长度为950 bp的单拷贝进行了扩增。

M-GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder

PCR Master Mix (2×)	#K1071 （200 reactions ）
	#K1072 （1000 reactions ）

PCR Master Mix是包含Taq DNA聚合酶、dNTPs以及PCR所需的除了DNA模板和引物以外的所有组分的2X浓缩溶液。由于减少了PCR设置所需的移液步骤，因此这种预混合制剂可以节省时间和减少污染。该混合试剂经过优化适用于有效而可重复的PCR。

特点

• 方便，即用型的预混液形式

• 热稳定—在95℃半衰期超过40分钟

• 产生具有3'-dA 末端的PCR产物

• 能结合修饰核苷酸(例如：生物素标记的核苷酸、地高辛标记的核苷酸、荧光标记的核苷酸)

应用

• 常规PCR，扩增长达5 kb的DNA片段

• DNA 标记

• 高通量PCR

产品组成

• PCR Master Mix (2×)中包含：

— Taq DNA polymerase (0.05 U/µL)

— Reaction buffer

— 4 mM MgCl2

— 0.4 mM of each dNTP

• Nuclease-free water

Dream Taq DNA Polymerase

Dream Taq DNA Polymerase是一种优化的适用于所有的标准PCR应用的增强型Taq DNA聚合酶。与传统的Taq DNA聚合酶相比，该聚合酶保证了更高的灵敏度、更长的PCR产物以及更高的产量。DreamTaq DNA Polymerase与传统的Taq DNA聚合酶使用相同的反应设置和循环条件。该聚合酶配套提供经过优化的DreamTaq Buffer，该缓冲液含有20 mM的MgCl₂。

特点

• 只需极少优化的高效扩增

• 高产量的PCR产物

• 与常规的Taq DNA聚合酶相比具有更高的灵敏度

• 以基因组DNA为模板可扩增长达6 kb的目的产物；以病毒DNA为模板可扩增长达20 kb的目的产物

• 能结合修饰核苷酸，但并不会结合dUTP

应用

• 常规PCR

• 高通量PCR

• 基因分型

产品组成

DreamTaq DNA Polymerase包含：

• DreamTaq DNA Polymerase (5 U/µL)

• 10×DreamTaq Buffer (includes 20 mM MgCl2)

DreamTaq DNA Polymerase	#EP0701（200 units ）
	#EP0702（500 units）
	#EP0703 （5X500 units ）
	#EP0704 （20X500 units ）

图3.2 DreamTaq DNA Polymerase与其它厂家Taq DNA聚合酶的灵敏度和产量比较

根据厂家的建议使用渐减量的人基因组DNA模板对来自人α-L-Fucosidase基因一个长度为545 bp的片段进行了扩增。M-FastRuler Low Range DNA Ladder，即用型；D-DreamTaq DNA Polymerase；T-Taq DNA聚合酶；1-3–来自不同厂家的Taq DNA 聚合酶

Dream Taq PCR Master Mix (2×)

DreamTaq PCR Master Mix (2×)是一种含有DreamTaq DNA Polymerase、经过优化的Dream Taq Buffer、MgCl2和dNTPs的即用型溶液。由于在PCR反应体系配制中减少了移液步骤，因此这种预混合的制剂节省了时间，并减少了污染。该通用混合试剂保留了DreamTaq DNA Polymerase的所有特征。它能够以基因组DNA为模板稳固扩增长达6 kb的片段和以病毒DNA为模板稳固扩增长达20 kb的片段。

特点

• 方便，即用型预混液形式

• 只需极少优化的高效扩增

• 与常规的Taq DNA聚合酶相比具有更高的灵敏度和产量

• 以基因组DNA为模板可扩增长达6 kb的目的产物；以病毒DNA为模板可扩增长达20 kb的目的产物

• 能结合修饰核苷酸，但并不会结合dUTP

应用

• 常规PCR扩增

• 高通量PCR

• 基因分型

产品组成

DreamTaq PCR Master Mix (2×)包含：

• DreamTaq PCR Master Mix (2×)，其含有DreamTaq DNA Polymerase, 2×DreamTaq buffer, dNTPs, 4 mM MgCl2

• Nuclease-free water

DreamTaq PCR Master Mix (2×)	#K1071(200 x 50 μL rxns)
	#K1072 (1000 x 50 μL rxns)

DreamTaq Green DNA Polymerase

Dream Taq Green DNA Polymerase是DreamTaq Green DNA Polymerase和10XDreamTaq Green Buffer的组合。DreamTaq DNA Polymerase是一种经过优化用于高通量PCR应用的增强聚合酶。与传统的Taq DNA聚合酶相比，该聚合酶能够保证更高的灵敏度、更长的PCR产物和更高的产量。DreamTaq产生具有3'-dA突出端PCR产物，不会结合dUTP。10×DreamTaq Green Buffer含有一种密度试剂和两种示踪染料，用于PCR产物直接凝胶上样。这种绿色的缓冲液并不会干扰PCR性能，并且与下游的应用如荧光DNA测序、连接和酶切等相兼容。对于需要通过吸光度或荧光激发来进行PCR产物分析的应用，建议使用无色的10×DreamTaq缓冲液(#B65)或者在分析之前对PCR产物进行纯化。

特点

• 使用绿色缓冲液，PCR产物可以直接上样

• 高产量和高灵敏度

• 以基因组DNA为模板可扩增长达6 kb的目的产物；以病毒DNA为模板可扩增长达20 kb的目的产物

应用

• 常规PCR

• 高通量PCR

• 基因分型

产品组成

DreamTaq Green DNA Polymerase包含：

• DreamTaq DNA Polymerase (5 U/µL)

• 10X DreamTaq Green Buffer (includes 20 mM MgCl2)

DreamTaq Green DNA Polymerase

DreamTaq Green DNA Polymerase	#EP0711(200 units)
	#EP0712(500 units)
	#EP0713 (5X500 units)
	#EP0714 (20X500 units)

图 3.3. 使用DreamTaq Green DNA Polymerase 可以获得更长的PCR片段和更高的产量使用能够将PCR混合物直接凝胶上样的几种不同酶对各种不同DNA目标物进行扩增。根据厂家的推荐在50 μL 反应液体积中进行了PCR。取10 μL PCR混合物凝胶上样。

M - GeneRuler Express DNA Ladder

1 - 来自小鼠基因组DNA长度为424 bp的424 bp lcs基因片段

2 - 来自人基因组DNA长度为956 bp的 7号染色体STS (G31656)

3 - 来自人基因组DNA长度为2537 bp的 tPA基因片段

4 - 来自人基因组DNA长度为5003 bp的beta-球蛋白基因片段

DreamTaq Green PCR Master Mix(2×)

DreamTaq Green PCR Master Mix (2×)是一种含有DreamTaq DNA Polymerase、经过优化的DreamTaq Green Buffer、MgCl2和dNTPs的即用型溶液。该通用混合试剂保留了DreamTaq DNA Polymerase的所有特征。

特点

• 方便，即用型绿色预混液形式，PCR产物可以直接上样电泳

• 与常规的Taq DNA聚合酶相比具有更高的产量和更高的灵敏度

• 以基因组DNA为模板可扩增长达6 kb的目的产物；以病毒DNA为模板可扩增长达20 kb的目的产物

• 能结合修饰核苷酸，但并不会结合dUTP

应用

• 常规PCR扩增

• 高通量PCR

• 基因分型

产品组成

DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)包含：

• DreamTaq Green PCR Master Mix (2×)，其中含有DreamTaq DNA Polymerase, 2×DreamTaq Green buffer, dNTPs, 4 mM MgCl2

• Nuclease-free water

DreamTaq Green PCR Master Mix (2×)	#K1081 (200 x 50 μL rxns)
DreamTaq Green PCR Master Mix (2×)	#K1082 (1000 x 50 μL rxns)
2X TruTaq Green PCR 预混液	# FB02002020(200 reactions)

3. 热启动PCR以及热启动DNA聚合酶

什么是热启动PCR？为什么要进行热启动PCR？

热启动PCR（hot start PCR）是指使DNA 聚合酶只有在样品温度至少超过70℃时才发挥作用的PCR，可提高反应的特异性。Taq DNA 聚合酶通常在比适宜温度低得多的条件下仍有较强的活性。PCR 反应的最初加热过程中，样品温度上升到70℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在Taq DNA 聚合酶的作用下延伸。结果会导致非靶序列的扩增，影响反应的特异性。热启动可减少非靶序列的扩增，提高反应的特异性。在引物设计时如果某位点因为遗传元件的定位而受限，如site-directed 突变、表达克隆或用于DNA 工程的遗传元件的构建和操作等情况，热启动PCR 尤为有效。

热启动PCR常用于增强PCR扩增的特异性。该方法主要利用抗体、亲合配体、适配体或化学修饰物等修饰热启动DNA聚合酶，来抑制室温下的DNA聚合酶的活性。这种修饰使得在PCR体系配制阶段引物与模板、引物与引物之前的结合能力降低，从而避免了非特异性扩增。由于DNA聚合酶在室温下的活性被抑制，所以，热启动技术为在室温下配制多个PCR反应体系提供了极大的便利，且不会影响特异性和扩增能力。

当反应体系配制好后，在反应初始加热阶段或“热启动”阶段，酶修饰物在高温下（通常高于90 ℃）被释放，使得DNA聚合酶被激活。具体激活时间和温度取决于DNA聚合酶以及热启动修饰物的性质。对某些DNA聚合酶而言，有时激活和起始变性步骤可以合并为一步。

DreamTaq Hot Start DNA Polymerase/ 热启动DNA聚合酶

DreamTaq Hot Start Green DNA Polymerase

Phire Hot Start II DNA Polymerase

Phire Green Hot Start II DNA Polymerase

· DreamTaq Hot Start DNA Polymerase是增强型的热启动DNA聚合酶。相比常规热启动Taq DNA聚合酶，具有更高的PCR特异性、灵敏度和产量。

· DreamTaq Hot Start DNA Polymerase通过抗体修饰抑制DNA聚合酶在室温下的活性，以阻止PCR开始前的非特异性扩增。

· 使用DreamTaq Hot Start DNA Polymerase，可在室温下配制反应体系，扩增方案和循环条件等同于常规Taq DNA聚合酶。

· DreamTaq Hot Start Green DNA Polymerase是增强型的热启动DNA聚合酶。

· 该酶随附提供经优化的10×DreamTaq Green buffer，其含有密度试剂盒示踪染料，可实现电泳后直接上样进行凝胶电泳，无需加入loading buffer。

·Phire Hot Start II DNA Polymerase是一种可用于常规和高通量PCR的新型DNA聚合酶。

· 其独有的双链DNA结合蛋白结构域使之与普通Taq酶相比，延伸时间更短，扩增片段更长，产量更高，保真性提高了2倍。

· 而基于Affibody技术的热启动修饰使该聚合酶可在标准的热循环条件下实现零时间激活。

· Phire Green Hot Start II DNA Polymerase将Phire Hot Start II DNA Polymerase和5×Phire Green Buffer结合在一起。

· 缓冲液中含有一种密度试剂和两种示踪染料，可实现PCR扩增后直接上样进行凝胶电泳。绿色染料不会影响酶性能，与下游应用兼容，如测序、连接、酶切连接等。

特点

· 可扩增低至3 pg的人基因组DNA

· 可扩增长达6 kb基因组DNA和20 kb lambda DNA

· 扩增产物含有3'-dA突出端

· 可结合dUTP和修饰核苷酸

· 绿色缓冲液，PCR扩增产物可以直接上样电泳

· 可扩增低至3 pg的人基因组DNA

· 可扩增长达6 kb基因组DNA和20 kb lambda DNA

· 扩增产物含有3'-dA突出端

· 可结合dUTP和修饰核苷酸

· 快速热启动：无需额外热激活步骤

· 快速：10-15 s/kb，比常规热启动Taq酶快四倍

· 强劲：对抑制剂的高耐受力可最大限度降低对反应体系的优化

· 产量高：高效扩增，可获得大量目的产物

· 更长的PCR产物：与其它常规热启动Taq 酶相比，可扩增更长的DNA片段

· 绿色缓冲液，PCR产物可以直接上样电泳

· 快速热启动：无需额外热激活步骤

· 快速：10-15 s/kb，比常规热启动Taq酶快四倍

· 强劲：对抑制剂的高耐受力可最大限度降低对反应体系的优化

· 产量高：高效扩增，可获得大量目的产物

· 更长的PCR产物：与其它常规热启动Taq酶相比，可扩增更长的DNA片段

应用

• 常规PCR

• 高通量PCR

• 基因分型

• 常规PCR

• 菌落PCR

• RT-PCR

• 基因分型

• 获取PCR产物用于TA克隆

• 快速PCR

• 热启动PCR

• 常规PCR

• 高通量PCR

• 基因分型

• 快速PCR

• 热启动PCR

• 常规PCR

• 高通量PCR

• 基因分型

产品组成

DreamTaq Hot Start DNA Polymerase包含：

• DreamTaq Hot Start DNA Polymerase (5 U/µL)

• 10× DreamTaq Buffer (includes 20 mM MgCl₂)

DreamTaq Hot Start Green DNA Polymerase包含：

• DreamTaq Hot Start DNA Polymerase (5 U/µL)

• 10X DreamTaq Green Buffer (includes 20 mM MgCl₂)

Phire Hot Start II DNA Polymerase包含：

• 1 x 200 µL Phire Hot Start II DNA Polymerase

• 2 x 1.5 mL 5X Phire Reaction Buffer (pro-vides 1.5 mM MgCl₂)

• 1 x 500 µL DMSO

Phire Green Hot Start II DNA Polymerase包含：

• Phire Hot Start II DNA Polymerase

• 5X Phire Green Reaction Buffer (provides 1.5 mM MgCl₂)

• DMSO

DreamTaq Hot Start DNA Polymerase 热启动DNA聚合酶

DreamTaq Hot Start Green DNA Polymerase

Phire Hot Start II DNA Polymerase

#F122S 200 reactions

#F122L 1000 reactions

Phire Green Hot Start II DNA Polymerase

#F124S 200 reactions

#F124L 1000 reactions

DreamTaq Hot Start PCR Master Mix

DreamTaq Hot Start Green PCR Master Mix

Phire Hot Start II PCR Master Mix

Phire Green Hot Start II PCR Master Mix

· DreamTaq Hot Start PCR Master Mix为即用型的2×预混液，包含DreamTaq Hot Start DNA Polymerase、DreamTaq buffer、magnesium和dNTPs。

· 预混液形式可减少移液次数，实现更简单的反应体系配制。

· 只需加入引物、模板和水。

· DreamTaq Hot Start Green PCR Master Mix为即用型的2×预混液，包含DreamTaq Hot Start DNA Polymerase、DreamTaq Green buffer、magnesium和dNTPs。

· 该绿色预混液包含密度试剂和两种示踪染料，可实现PCR扩增后直接进行凝胶上样电泳，无需加入loading buffer。

· Phire Hot Start II PCR Master Mix为即用型的2×预混液形式，减少移液步骤。

· 该预混液中含有Phire Hot Start II DNA Polymerase、dNTP和经优化的反应缓冲液(含MgCl2)，只需加入模板和引物即可开始PCR扩增。

· Phire Green Hot Start II PCR Master Mix为即用型的2X预混液形式，减少移液步骤。

· 该预混液中含有Phire Hot Start II DNA Polymerase、dNTP和经优化的反应缓冲液(含MgCl2)，只需加入模板和引物即可开始PCR扩增。

· 同时该预混液中含有一种密度试剂和两种示踪染料，可实现PCR扩增后直接上样电泳。

特点

• 方便的2×预混液形式，减少移液次数

• 可扩增低至3 pg的人基因组DNA

• 可扩增长达6 kb基因组DNA和20 kb lambda DNA

• 扩增产物含有3'-dA突出端

• 可结合dUTP和修饰核苷酸

• 方便的2×预混液形式，减少移液次数

• 绿色预混液可实现PCR产物直接进行电泳

• 可扩增低至3 pg的人基因组DNA

• 可扩增长达6 kb基因组DNA和20 kb lambda DNA

• 扩增产物含有3'-dA突出端

• 可结合dUTP和修饰核苷酸

• 方便的预混液形式

• 快速热启动：无需额外热激活步骤

• 快速：10-15 s/kb，比常规热启动Taq酶快四倍

• 强劲：对抑制剂的高耐受力可最大限度降低对反应体系的优化

• 产量高：高效扩增，可获得大量目的产物

• 更长的PCR产物：与其它常规热启动Taq 酶相比，可扩增更长的DNA片段

• 方便的预混液形式，绿色缓冲液可实现PCR产物直接上样电泳

• 快速热启动：无需额外热激活步骤

• 快速：10-15 s/kb，比常规热启动Taq酶快四倍

• 强劲：对抑制剂的高耐受力可最大限度降低对反应体系的优化

• 产量高：高效扩增，可获得大量目的产物

• 更长的PCR产物：与其它常规热启动Taq酶相比，可扩增更长的DNA片段

应用

• 常规PCR

• 菌落PCR

• RT-PCR

• 基因分型

• 获取PCR产物用于TA克隆

• 常规PCR

• 菌落PCR

• RT-PCR

• 基因分型

• 获取PCR产物用于TA克隆

• 快速PCR

• 热启动PCR

• 常规PCR

• 高通量PCR

• 基因分型

• 快速PCR

• 热启动PCR

• 常规PCR

• 高通量PCR

• 基因分型

产品组成

DreamTaq Hot Start PCR Master Mix (2×) 包含：

• DreamTaq Hot Start PCR Master Mix (2×)

• Nuclease-free water

DreamTaq Hot Start Green PCR Master Mix (2×) 包含：

• DreamTaq Hot Start Green PCR Master Mix (2×)

• Nuclease-free water

Phire Hot Start II PCR Master Mix包含：

• 2×Phire Hot Start II PCR Master Mix

• DMSO

• Water, nuclease free

Phire Green Hot Start II PCR Master Mix包含：

• 2×Phire Green Hot Start II PCR Master Mix

• DMSO

• Water, nuclease free

DreamTaq Hot Start PCR Master Mix 热启动PCR预混液

#K9011 200 rxns

#K9012 1000 rxns

DreamTaq Hot Start Green PCR Master Mix

#K9021 200 rxns

#K9022 1000 rxns

Phire Hot Start II PCR Master Mix

#F125S 200 reactions

#F125L 1000 reactions

Phire Green Hot Start II PCR Master Mix

#F126S 200 reactions

#F126L 1000 reactions

图1. 高灵敏度。与其它供应商的热启动DNA 聚合酶相比，DreamTaq热启动DNA聚合酶扩增所需模板量更低。每组PCR反应包含3 pg、30 pg或3 ng人基因组DNA。M：GeneRuler Express DNA Ladder。1. DreamTaq热启动DNA聚合酶；2. TaKaRa Taq DNA聚合酶热启动版本；3. Kapa Biosystems KAPA2G Robust HotStart PCR试剂盒；4. Bioline MyTaq HS DNA聚合酶；5. NEB OneTaq热启动DNA聚合酶；6. Promega GoTaq G2热启动聚合酶。

图2. 稳定且可靠的扩增。DreamTaq热启动DNA聚合酶可高特异性地扩增人基因组DNA，扩增片段可达9 kb。对于lambda DNA模板甚至可扩增长达20 kb的片段。M：GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder。

图 3. 更短时间内获得超高产量将来自五个厂家的的热启动DNA聚合酶用于扩增1.5 kb的人类cathepsin K基因。Phire Hot Start II DNA Polymerase在短短的29分钟内扩增了大量的特异性PCR产物。相比之下，来自四个其他重要供应商(A-D)的热启动Taq DNA聚合酶的PCR时间明显更长，而且产量偏低。

4. 高保真PCR

Taq酶具有5'-3'DNA聚合酶活性和5'→3'的外切酶活性，缺少3'→5'的外切酶活性，但没有从3'→5'方向外切酶的活性，扩增得到的PCR产物的3'末端附有一个“A”碱基，可直接用于TA克隆，但是由于不具有3'→5'外切酶活性，因而在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能。DNA聚合酶的校正能力决定了保真度，会影响DNA序列复制的准确性。高保真DNA聚合酶——Phusion高保真DNA 聚合酶使得PCR反应既具有5'→3'方向合成DNA的功能，又具有3'→5'方向外切酶的活性和纠错功能。

当扩增>10 kb的目的片段时，应根据以下5个关键点对PCR方案进行优化：

1. 确保使用高质量、高纯度的DNA样本。

2. 如果DNA聚合酶的热稳定性较低，则需要使用更多量的酶，以弥补因延长循环时间导致的活性损失。

3. 降低退火和延伸步骤的温度，有助于引物结合。

4. 适当延长PCR步骤的持续时间，有助于模板DNA的完全解离及引物的结合。

5. 适当延长PCR延伸时间，可确保目标区域的全长复制。

Phusion High-Fidelity DNA Polymerase

Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase

Phusion Green Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase

Phusion U Hot Start DNA Polymerase

Phusion U Green Hot Start DNA Polymerase

Phusion DNA聚合酶的错配率比Taq酶低52倍，比Pfu低6倍，从而使之成为克隆或其它需要高保真性实验的理想选择。

该酶的独特结构使其即便在有PCR抑制剂存在的情况下，也能快速有效的得到目的产物。

Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase在Phusion高保真DNA聚合酶的基础上进行了可逆而独特的Affibody修饰。

Affibody抑制了DNA聚合酶在室温下的活性，从而防止非特异性产物的扩增。

同时，Affibody还可以抑制聚合酶的3'→5'核酸外切酶活性，从而有效防止了引物和模板的降解。

而在扩增反应时，Affibody被释放，使得聚合酶激活。Phusion Hot Start II DNA 聚合酶在PCR过程中不需要单独的热激活步骤，因为该聚合酶在PCR升温过程中即可被完全激活。

Phusion Green Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase将Phusion Hot Start II DNA Polymerase和5X Phusion Green Buffer结合在一起。

缓冲液中含有一种密度试剂和两种示踪染料，不会影响Phusion Hot Start II DNA Polymerase的性能。

使用绿色缓冲液，PCR扩增后可以直接上样进行凝胶电泳，无需添加loading buffer。

Phusion U DNA polymerase是使用蛋白融合技术改造的新型高保真酶。通过Phusion蛋白上dUTP结合域的独有突变，Phusion U克服了不同高保真酶不能结合dUTP的限制。

该酶可整合dUTP，可对含尿嘧啶模板进行扩增。

同时Phusion U保留了其它Phusion DNA Polymerase的特性(高准确性、快速、长片段扩增能力以及基于Affibody的热启动功能)，因此Phusion U Hot Start DNA Polymerase是一些实验应用的首选，比如对亚硫酸氢盐转化的DNA、损伤DNA进行扩增，以及用于参与污染控制(结合UDG酶)。

Phusion U Green DNA polymerase将Phusion U Hot Start DNA Polymerase和5×Phusion Green Buffer结合在一起。

绿色缓冲液中包含一种密度试剂和两种示踪染料，可实现PCR扩增后直接上样进行电泳。

绿色染料不会干扰Phusion U DNA Polymerase的性能，并且兼容下游实验应用，如DNA测序、酶切和连接。

特点：

• 高保真度(52×Taq)

• 快速PCR扩增，延伸速度为15-30 s/kb

• 强劲扩增能力，减少反应优化

• 少量的酶即可以进行高效扩增

• 使用独特的热启动技术，实现零时间激活

• 可在室温下进行配制反应体系

• 减少非特异性扩增

• 防止引物降解

• 高保真度(52×Taq)

• 快速PCR扩增，延伸速度为15-30 s/kb

• 更少的酶，更高的产量

• 绿色缓冲液，PCR产物可以直接上样电泳

• 使用独特的热启动技术，实现零时间激活

• 可在室温下进行配制反应体系

• 减少非特异性扩增

• 防止引物降解

• 高保真度(52×Taq)

• 快速PCR扩增，延伸速度为15-30 s/kb

• 更少的酶，更高的产量

• 高准确性：保真度为25×Taq

• 耐受尿嘧啶：可整合dUTP，可对含尿嘧啶模板进行扩增

• 高特异性：Affibody热启动技术，减少特异性扩增和引物降解

• 快速：扩增速度为15-30 s/kb

• 绿色缓冲液，PCR产物可以直接上样电泳

• 高准确性：保真度为25×Taq

• 耐受尿嘧啶：可整合dUTP，可对含尿嘧啶模板进行扩增

• 高特异性：Affibody热启动技术，减少特异性扩增和引物降解

• 快速：扩增速度为15-30 s/kb

应用：

• 高保真PCR

• 分子克隆

• 获取测序模板

• 困难模板(如高GC含量)扩增

• 长片段扩增(长达20 kb)

• 突变

• 高通量PCR

• 高保真PCR

• 分子克隆

• 获取测序模板

• 困难模板(如高GC含量)扩增

• 长片段扩增(长达20 kb)

• 多重PCR

• 高通量PCR

• 突变

• 高保真PCR

• 分子克隆

• 获取测序模板

• 困难模板(如高GC含量)扩增

• 长片段扩增(长达20 kb)

• 多重PCR

• 高通量PCR

• 突变

• 亚硫酸氢盐转化DNA的扩增

• 损伤DNA或衰老DNA的扩增

• 残余污染控制

• Uracil-excision based (USER) cloning

• 亚硫酸氢盐转化DNA的扩增

• 损伤DNA或衰老DNA的扩增

• 残余污染控制

• Uracil-excision based (USER) cloning

产品组成：

Phusion High-Fidelity DNA Polymerase包含：

• Phusion DNA Polymerase (2 U/µL)

• 5×Phusion HF Buffer

• 5×Phusion GC Buffer

• DMSO

• 50 mM MgCl₂ solution

Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase包含：

• Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Poly-merase (2 U/µL)

• 5×Phusion HF Buffer

• 5×Phusion GC Buffer

• DMSO

• 50 mM MgCl₂ solution

Phusion Green Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase包含：

• Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Poly-merase (2 U/µL)

• 5×Phusion Green HF Buffer

• 5×Phusion Green GC Buffer

• DMSO

• 50 mM MgCl₂ solution

Phusion U DNA polymerase包含：

• Phusion U Hot Start DNA Polymerase, 2 U/µL

• 5×Phusion HF Buffer

• 5×Phusion GC Buffer

• DMSO

Phusion U Green DNA polymerase包含：

• Phusion U Hot Start DNA Polymerase, 2 U/µL

• 5×Phusion Green HF Buffer

• 5×Phusion Green GC Buffer

• DMSO

Phusion High-Fidelity DNA Polymerase

#F530S 100 units

#F530L 500 units

#F-530XL 2000 units

Phusion High-Fidelity DNA Polymerase & dNTP Mix (10 mM each)

#F530N 2000 units

Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase

#F549S 100 units

#F549L 500 units

#F549XL 2000 units

Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase & dNTP Mix (10 mM each)

#F549N 2000 units

Phusion Green Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase

#F537S 100 units

#F537L 500 units

Phusion U Hot Start DNA Polymerase

#F555S 100 units

#F555L 500 units

Phusion U Green Hot Start DNA Polymerase

#F556S 100 reactions

#F556L 500 reactions

Phusion High-Fidelity PCR Master Mix

Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix

Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix

Phusion U Hot Start PCR Master Mix

Phusion High-Fidelity PCR Master Mix为方便的2×预混液，包含Phusion DNA Polymerase、dNTP、经优化的缓冲液(含MgCl2)。可提供两种形式的预混液，一种含HF Buffer (F531S和F531L)，一种含GC Buffer (F532S和F532L)。在HF Buffer中，Phusion DNA Polymerase的错误率为4.4×10-7，低于GC Buffer (9.5×10-7)。但GC Buffer更适用于扩增一些困难样本，如高GC含量模板或具有复杂二级结构的模板。

Phusion Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix为方便的2×预混液，包含Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase、dNTP、经优化的缓冲液(含MgCl2)，只需加入模板和引物即可开始PCR扩增。

Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix为方便的2X预混液，包含Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase、dNTP、经优化的缓冲液(含MgCl2)，只需加入模板和引物即可开始PCR扩增。同时该预混液还包含一种密度试剂和两种示踪染料，PCR扩增后可以直接上样进行凝胶电泳，无需添加loading buffer。

Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix经设计用于节约反应时间。2×预混液可确保在短时间PCR方案下，保证扩增高保真性和扩增产量。同时预混液形式只需加入模板和引物即可开始扩增。该产品内含Phusion Flash II DNA Polymerase，它是在Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase基础上修饰得到的一款校正DNA聚合酶。

Phusion U Hot Start PCR Master Mix为方便的2×预混液形式。预混液中含有Phusion U Hot Start DNA Polymerase、dNTPs、经优化的反应缓冲液(含MgCl2)，只需加入模板和引物即可开始电泳。

特点：

• 方便的预混液形式

• 快速PCR扩增，延伸速度为15-30 s/kb

• 强劲扩增能力，减少反应优化

• 方便的预混液形式

• 使用独特的热启动技术，实现零时间激活

• 可在室温下进行配制反应体系

• 减少非特异性扩增

• 防止引物降解

• 高保真度(52×Taq)

• 快速PCR扩增，延伸速度为15-30 s/kb

• 更少的酶，更高的产量

• 方便的预混液形式

• PCR产物可以直接上样电泳

• 使用独特的热启动技术，实现零时间激活

• 可在室温下进行配制反应体系

• 减少非特异性扩增

• 防止引物降解

• 高保真度(52×Taq)

• 快速PCR扩增，延伸速度为15-30 s/kb

• 更少的酶，更高的产量

• 快速：15 s/kb或更快的延伸速度

• 热启动修饰可实现“零时间激活”

• 准确性高，保真性是Taq酶的25倍

• 更短的时间，更高的产量

• 方便的2×预混液形式

• 高准确性—保真度为25×Taq

• 耐受尿嘧啶—可整合dUTP，可对含尿嘧啶模板进行扩增

• 高特异性—Affibody热启动技术，减少特异性扩增和引物降解

• 快速—扩增速度为15-30 s/kb

应用：

• 高保真PCR

• 困难模板(如高GC含量)扩增

• 分子克隆

• 获取测序模板

• 长片段扩增(长达20 kb)

• 突变

• 高通量PCR

• 高保真PCR

• 分子克隆

• 获取测序模板

• 困难模板(如高GC含量)扩增

• 长片段扩增(长达20 kb)

• 多重PCR

• 高通量PCR

• 突变

• 高保真PCR

• 分子克隆

• 获取测序模板

• 困难模板(如高GC含量)扩增

• 长片段扩增(长达20 kb)

• 多重PCR

• 高通量PCR

• 突变

• 快速PCR

• 高保真PCR

• 分子克隆

• 获取测序模板

• 困难模板(如高GC含量)扩增

• 长片段扩增(长达20 kb)

• 多重PCR

• 突变

• 亚硫酸氢盐转化DNA的扩增

• 损伤DNA或衰老DNA的扩增

• 残余污染控制

• Uracil-excision based (USER) cloning

产品组成：

Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer包含：

• Phusion Master Mix with HF Buffer (2×) (provides 1.5 mM MgCl2 in final reaction)

• 100% DMSO

Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer包含：

• Phusion Master Mix with GC Buffer (2×) (provides 1.5 mM MgCl2 in final reaction)

• 100% DMSO

Phusion Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix包含：

• 2×Phusion Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix (provides 1.5 mM MgCl2 in the final 1×concentration)

• Water, nuclease-free

• DMSO

Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix包含：

• 2×Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix (provides 1.5 mM MgCl2 in the final 1×concentration)

• Water, nuclease-free

• DMSO

Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix包含：

• Phusion Flash Master Mix (含有Phusion Flash II DNA Polymerase、dNTPs、MgCl2及优化过的缓冲液)

Phusion U Hot Start PCR Master Mix中含有：

• Phusion U Hot Start DNA Polymerase

• 2×reaction buffer

• 3 mM MgCl2

• 400 µM dATP, dTTP, dCTP和dGTP

Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer

#F531S 100 reactions

#F531L 500 reactions

Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer

#F532S 100 reactions

#F532L 500 reactions

Phusion Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix

#F565S 100 reactions

#F565L 500 reactions

Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix

#F566S 100 reactions

#F566L 500 reactions

Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix

#F548S 100 x 20 μl rxns

#F548L 500 x 20 μl rxns

Phusion U Hot Start PCR Master Mix

#F533S 100 reactions

#F533L 500 reactions

图1. 更少的酶，获得更高的产量使用三种不同DNA聚合酶对人类β-球蛋白基因的3.8 kb片段进行了扩增。Phusion DNA聚合酶能够在仅仅1分钟的退火加延伸步骤内，对3.8 kb的目的片段进行扩增，速度明显优于另两种酶。仅仅一个单位的Phusion DNA聚合酶要比2.5或5个单位的Pfu DNA聚合酶得到更多的产物。

图2. Phusion Hot Start II DNA Polymerase 的高特异性和高产量。使用其它供应商的5种具有校正功能的热启动DNA聚合酶对人类基因组DNA 1.7-2.3kb片段进行扩增。Phusion Hot Start II DNA Polymerase所得产物特异性好、产量高，其它的酶无产物或产物量少，同时还有非特异性扩增。

5. 直接PCR

Phire Plant Direct PCR Master Mix

Phire Plant Direct PCR Master Mix经开发用于直接从植物样本中进行DNA扩增，PCR之前无需进行核酸提取。该试剂盒基于Phire Hot Start II DNA Polymerase。该酶经特殊分子改造将酶和DNA结合域结合在一起，使其扩增性能优异，可耐受植物组织中存在的许多PCR抑制剂，如复合多糖、多酚等。Phire Plant Direct PCR Master Mix已经过多种测试，包括多种植物种类的叶片和种子，以及真菌、细菌和酵母。试剂盒内包含一整套完整的试剂和实验方法，是对植物DNA进行扩增的理想选择。

特点

• 直接进行PCR扩增—将样本直接加入到PCR反应体系，无需花费时间和经费在DNA提取上

• 提供稀释&储存实验方案—对于少量样本可进行多次PCR反应和验证测试

• 特殊优化的Phire Hot Start II DNA polymerase—实现快速PCR扩增

• 预混液形式，且加入了上样染液—减少交叉污染的可能，减少动手操作时间，以及可以实现PCR产物直接上样进行电泳

应用

• 基因分型

• 转基因检测

• 基因敲除分析

• 测序

产品组成

Phire Plant Direct PCR Master Mix组分包括：

• Phire Plant Direct PCR Master Mix (2×)

• Dilution Buffer

• Control Primer Mix (25 µM each)

• Water, nuclease- free

• O'GeneRuler Express DNA Ladder (sufficient for 100 applications)

已检测材料

• 叶子：拟南芥、玉米、水稻、棉花、烟草、葡萄树

• 储存在组织存储卡上的组织：玉米、烟草

• 种子：苹果、胡萝卜、南瓜

• 真菌和苔藓：地钱、蘑菇属

• 细菌：革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌

• 酵母：酿酒酵母、裂殖酵母

Phire Plant Direct PCR Master Mix

#F160S 250 reactions

#F160L 1250 reactions

图3.9 从不同植物的叶片和种子直接扩增0.5 kb的DNA片段。将直径为0.5 mm的叶片小圆片 (L) 或小块压碎的种子 (S) 直接加入50 μL的Phire植物直接PCR预混液中。根据供应商提供的说明，同时使用供应商K的试剂盒扩增相同的样本。M：O´GeneRuler Express DNA Ladder+：使用纯化的DNA作为模板的正对照 –：不含模板的负对照

图3.10 从干月桂树叶中扩增不同长度的(0.5 kb, 1.5 kb 和 5.0 kb)的DNA片段。将直径为0.5 mm的小圆片叶片样品直接加入Phire 植物直接PCR预混液中。M：O´GeneRuler Express DNA Ladder

Phire Tissue Direct PCR Master Mix

Phire Tissue Direct PCR Master Mix经开发用于从多种动物组织中直接进行DNA扩增，包括小鼠、人类、鱼类、鸟类和昆虫。预混液里所含的Phire Hot Start II DNA Polymerase经特殊优化可在动物源抑制剂(如胶原蛋白、黑色素、真黑色素或肌红蛋白等)存在条件下进行PCR扩增。试剂盒内同时包含DNA Release Additive，其用于增强困难样本DNA的释放。

特点

• 直接进行PCR扩增—将样本直接加入到PCR反应体系，无需花费时间和经费在DNA提取上

• 提供稀释&储存实验方案—对于少量样本可进行多次PCR反应和验证测试

• 特殊优化的Phire Hot Start II DNA polymerase—实现快速PCR扩增

• 预混液形式，且加入了上样染液—减少交叉污染的可能，减少动手操作时间，以及可以实现PCR产物直接上样进行电泳

应用

• 基因分型

• 转基因检测

• 基因敲除分析

• 测序

产品组成

Phire Tissue Direct PCR Master Mix组分包括：

• Phire Tissue Direct PCR Master Mix (2×)

• Dilution Buffer

• DNARelease Additive

• Control Primer Mix (25 µM each)

• Water, nuclease- free

• O'GeneRuler Express DNA Ladder (sufficient for 100 applications)

已检测材料

• 小鼠组织：耳朵、尾巴、毛发、肝、脾、脑

• 培养的小鼠细胞：成纤维细胞

• 果蝇：翅膀、全虫

• 斑马鱼：鳍

• 秀丽隐杆线虫：全虫

• 狗：毛发

• 人体标本：口腔拭子、指甲、唾液、牙齿、皮肤活检、毛发、FFPE组织

Phire Tissue Direct PCR Master Mix

#F170S 250 reactions

#F170L 1250 reactions

	图3.11 使用Phire组织直接PCR预混液对不同的人和动物组织样本进行DNA片段扩增。小鼠 (1) 尾巴、(2)耳朵； (3) 毛发；鸟 (4) 肌肉；(5) 羽毛；人 (6) 毛发、(7) 牙齿、(8) 指甲和 (9) 唾液；(10) 斑马鱼肌肉；以及(11) 果蝇。M：O´GeneRuler Express DNA Ladder +：阳性对照反应 –：无模板对照
	图3.12 使用Phire组织直接PCR预混液，在1重至5重反应中，从小鼠耳朵扩增不同长度的片段 (185至650 bp) 。M：O´GeneRuler Express DNA Ladder

Phusion Blood Direct PCR Master Mix

Phusion Blood Direct PCR Master Mix经设计用于直接从全血中直接进行DNA扩增，无需PCR扩增前单独的DNA提取步骤。经修饰的Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase可耐受血液中主要的PCR抑制剂，即使PCR反应中血液浓度高达40%，也仍能保持高活性。Phusion DNA聚合酶的准确校正功能使Phusion Blood Direct PCR Master Mix成为一些高要求实验引用的理想选择，如分子克隆。同时Phusion Blood Direct PCR Master Mix也可实现对不同保存液(如肝素、EDTA、柠檬酸盐等)、不同储存条件、不同物种的血液样本进行高效分析。

特点

• 直接进行PCR扩增—将样本直接加入到PCR反应体系，无需花费时间和经费在DNA提取上

• 提供稀释&储存实验方案—对于少量样本可进行多次PCR反应和验证测试

• 特殊优化的Phusion DNA polymerase—实现快速PCR扩增

• 预混液形式，且加入了上样染液—减少交叉污染的可能，减少动手操作时间，以及可以实现PCR产物直接上样进行电泳

应用

• 基因分型

• 转基因检测

• 基因敲除分析

• 测序

产品组成

Phusion Blood Direct PCR Master Mix组分包括：

• Phusion Blood Direct PCR Master Mix (2×)

• Universal Control Primer Mix

• 50 mM EDTA

• 50 mM MgCl2

• DMSO

• Water, nuclease-free

• O'GeneRuler Express DNA Ladder (sufficient for 100 applications)

已检测材料

• 全血：小鼠、猪、猫、狗、牛、鸟、人

• 使用肝素、柠檬酸盐、EDTA保存的血液

• Whatman 903 和FTA卡上保存的血液

Phusion Blood Direct PCR Master Mix

#F175S 250 reactions

#F175L 1250 reactions

6. 逆转录酶

RevertAid Reverse Transcriptase

RevertAid Reverse Transcriptase是重组型M-MuLV反转录酶，其结构和催化性质区别于M-MuLV。此酶具有RNA和DNA聚合酶活性，其RNase H活性明显低于AMV反转录酶。

特点

• 可以高效合成长达13 kb的全长第一链cDNA

• 最佳活性温度为42℃

• 温度高达50℃时仍有活性

• 合成时可掺入带有修饰的核苷酸(例如 Cy3-、Cy5-、罗丹明-、氨基烯丙基-、荧光素-标记的核苷酸)

应用

• 合成第一链cDNA，用于RT-PCR和实时RT-qPCR

• 合成cDNA，用于克隆和表达研究

• 制备带标记的cDNA探针，用于芯片研究

• DNA 标记

• 引物延伸法分析RNA

产品组成

RevertAid Reverse Transcriptase组分包括：

• RevertAid Reverse Transcriptase, 200 U/μL

• 5×Reaction Buffer(250 mM Tris-HCl (25℃，pH 8.3)、250 mM KCl、20 mM MgCl2、50 mM DTT）

RevertAid Reverse Transcriptase

#EP0441 10,000 units

#EP0442 5 x 10,000 units

RevertAid H Minus Reverse Transcriptase

RevertAid H Minus Reverse Transcriptase是重组型M-MuLV反转录酶，具有RNA和DNA聚合酶活性，但由于在RNase H结构域的一个点突变，其没有RNase H活性。在cDNA合成过程中，RevertAid H Minus Reverse Transcriptase不会降解RNA-DNA复合物中的RNA，因此可获得高产量的全长cDNA。同时RevertAid H Minus Reverse Transcriptase可在较宽温度范围内(42 - 50°C)保持高活性。

特点

• 可以高效合成长达13 kb的全长第一链cDNA

• 最佳反应温度范围42-45°C

• 温度高达50℃时仍有活性

• 合成时可掺入带有修饰的核苷酸(例如 Cy3-、Cy5-、罗丹明-、氨基烯丙基-、荧光素-标记的核苷酸)

应用

• 合成第一链cDNA，用于RT-PCR和实时RT-qPCR

• 可在较高温度下进行反转录，以减少二级结构的影响

• 合成cDNA，用于克隆和表达研究

• 制备带标记的cDNA探针，用于芯片研究

• DNA 标记

• 引物延伸法分析RNA

产品组成

RevertAid H Minus Reverse Transcriptase组分包括：

• RevertAid H Minus Reverse Transcriptase, 200 U/μL

• 5×Reaction Buffer(250 mM Tris-HCl (25℃，pH 8.3)、250 mM KCl、20 mM MgCl2、50 mM DTT

RevertAid H Minus Reverse Transcriptase

#EP0451 10,000 units

#EP0452 5 x 10,000 units

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit是一套用于以RNA为模板高效合成第一链cDNA的完整系统，可合成长达13 kb的cDNA。试剂盒配套提供RiboLock RNase Inhibitor，可有效防止RNA模板的降解。试剂盒配套提供oligo(dT)18引物和随机六聚体引物。oligo(dT)18引物可以选择性地与mRNA中的poly(A)尾结合。随机六聚体引物无需poly(A)尾，因此可转录mRNA 5'-端区域，也可以无poly(A)尾的RNA(如microRNA)为模板合成cDNA。该试剂盒也可使用基因特异性引物。

特点

• 可以高效合成长达13 kb的全长第一链cDNA

• 最佳活性温度为42 °C

• 完整试剂盒，包含RT反应所需所有组分

应用

• 合成第一链cDNA，用于RT-PCR和实时RT-qPCR

• 全长cDNA文库构建

• 反义RNA合成

产品组成

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit组分包括：

• RevertAid Reverse Transcriptase

• RiboLock RNase Inhibitor

• 5×Reaction Buffer

• dNTP Mix

• Oligo(dT)18 Primer

• Random Hexamer Primer

• Control GAPDH RNA

• 10 μM Forward GAPDH Primer

• 10 μM Reverse GAPDH Primer

• Nuclease-free water

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit

#K1621 20× 20 µL reactions

#K1622 100× 20 µL reactions

PCR扩增小鼠dystrophin的cDNA： PCR 产物长度：

1, 2 – 5929-6465 bp 537 bp

3, 4 – 3737-4876 bp 1140 bp

5, 6 – 316-2339 bp 2024 bp

7, 8 – 10627-13620 bp 2994 bp

M1 – ZipRuler Express DNA Ladder 2 (#SM1373)

M2 – ZipRuler Express DNA Ladder 1 (#SM1373)

图3.15. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成全长cDNA。1 μg小鼠心脏总RNA作为模板，用oligo(dT)18引物进行反转录反应。由此合成的cDNA，再作为Taq DNA Polymerase后续PCR扩增的模板。末端2024 bp片段的成功扩增，表明长度为13.8 kb的全长RNA片段得到成功的反转录。

RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit

RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis是一套用于以RNA为模板合成第一链cDNA的完整系统。该试剂盒包括RevertAid H Minus Reverse Transcriptase，该酶由于点突变而完全消除了RNase H活性。因此该酶不能降解第一链cDNA合成时RNA-DNA复合体中的RNA，因此可获得高产量的全长cDNA。

特点

• 高产量合成全长第一链cDNA产量，最长可合成13 kb的cDNA

• 更高的反应温度范围：42-55°C

• 配套提供重组的RiboLock RNase Inhibitor

• 完整试剂盒- 试剂盒提供oligo(dT)18引物和随机六聚体引物

应用

• 合成第一链cDNA，用于RT-PCR和实时RT-qPCR

• 全长cDNA文库构建

• 反义RNA合成

产品组成

RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit组分包括：

• RevertAid H Minus Reverse Transcriptase

• RiboLock RNase Inhibitor

• 5×Reaction Buffer

• dNTP Mix

• Oligo(dT)18 Primer

• Random Hexamer Primer

• Control RNA

• Control Primers

• Nuclease-free water

RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit

#K1631 20× 20 µL reactions

#K1632 100× 20 µL reactions

RevertAid First Strand Synthesis cDNA Master Mix

RevertAid cDNA Synthesis Master Mix是从mRNA或总RNA中高效合成第一链cDNA的完整系统。预混液中含有RevertAid Reverse Transcriptase，相比AMV反转录酶，其具有较低的RNase H活性。RevertAid Master Mix为方便的两管式预混液，提供cDNA反应所需的所有组分。该预混液经特殊优化，适合用于两步法RT-qPCR。相比试剂盒形式，两管式预混液使得反应时间缩短，且只需极少的移液步骤。

特点

• 快速—反应时间缩短 (一般30–60 min)

• 方便—简单的实验流程，少量的加样步骤

• 可靠—不管对于低丰度或高丰度的模板，均可进行高效反转录

• 灵活—经优化的两步法实验方案，对于同一个反转录反应，可进行多轮PCR反应

应用

• 合成第一链cDNA，用于RT-PCR和实时RT-qPCR

• 全长cDNA文库构建

• 反义RNA合成

产品组成

RevertAid cDNA Synthesis Master Mix组分包括：

• 20×Enzyme mix (MuLV and RNase inhibitor protein)

• 2×RT Buffer Mix (includes dNTPs, random octamers, and Oligo dT-16)

RevertAid First Stand cDNA Synthesis Master Mix

#M1631 50× 20 µL reactions

#M1632 100× 20 µL reactions

Maxima Reverse Transcriptase

Maxima Reverse Transcriptase是通过对M-MuLV进行体外改造而得到的酶，具有依赖RNA和DNA的聚合酶活性, 同时具有RNase H活性。与野生型M-MuLV相比，该酶具有高热稳定性、高反应稳定性、以及高合成速率。Maxima Reverse Transcriptase可以在更高的温度下(50-60℃) 进行反转录反应，其反应起始模板量线性范围很广(1 pg - 5 μg)，使其非常适合两步法RT-qPCR。由于该酶具有较高的热稳定性，在整个反转录反应过程中均能保持完整的酶活，因此可以获得较高的cDNA产率，并且能够合成长达20 kb的RNA转录产物。反应温度可以升高到65℃，对于具有复杂二级结构的RNA可以进行高效的转录，而对于使用基因特异性引物进行的反转录反应，也可以提高反应的特异性。

特点

• 高产量合成全长cDNA，长度可达20 kb

• 反应温度可高达65°C

• 高热稳定性—在50°C下60分钟仍能保持90%活性

• 高灵敏度—对于宽范围的RNA起始量(1 pg - 5 µg)可进行高重复性的cDNA合成

• 快速—在15-30分钟内即可完成cDNA合成

应用

• 两步法RT-PCR

• 两步法RT-qPCR

• 第一链cDNA合成

• 全长cDNA文库构建

• DNA标记

• 引物延伸

产品组成

Maxima Reverse Transcriptase组分包括：

• Maxima Reverse Transcriptase, 200 U/µL

• 5×RT Buffer (250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25°C), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2, 50 mM DTT)

Maxima Reverse Transcriptase

#EP0741 2,000 units

#EP0742 10,000 units

#EP0743 4 x 10,000 units

图3.16 （左图）50℃时 Maxima Reverse Transcriptase具有高度热稳定性反转录酶在1×反应混合物中进行孵育。在指定的时间点(5-240分钟)，通过标准活性分析方法测定酶活。

图3.17 （右图）50℃时具有很高的cDNA合成速率使用1 μg长度为7kb的RNA作为模板，在50℃分别进行了5、15、30和60分钟的cDNA合成反应。反应产物用1%的琼脂糖凝胶检测。只有Maxima RT能在5分钟内完成7kb cDNA的合成。

Maxima H Minus Reverse Transcriptase

Maxima H Minus Reverse Transcriptase是通过对M-MuLV进行体外改造而得到的酶，具有依赖RNA和DNA的聚合酶活性，但由于突变缺失RNase H活性。与野生型M-MuLV相比，该酶显著提高了热稳定性，持续合成能力高50×，同时合成速率大幅加快。RNase H活性的缺失使得该酶可以合成长达20 kb的cDNA。由于该酶具有高热稳定性，在整个反转录中均能保持完整的酶活，因此可以获得较高的cDNA产率。反应温度可高达65°C，因此对于具有复杂二级结构的RNA也可进行高效反转录。高持续合成能力使得该酶可耐受常见反应抑制剂，如盐酸胍、福尔马林和乙醇。

特点

• 高产量合成全长cDNA，长度可达20 kb

• 反应温度可高达65°C

• 高热稳定性—在50°C下60分钟仍能保持90%活性

• 高灵敏度—对于宽范围的RNA起始量(1 pg - 5 µg)可进行高重复性的cDNA合成

• 快速—在15-30分钟内即可完成cDNA合成

• 耐受常见反应抑制剂

应用

• 两步法RT-PCR

• 两步法RT-qPCR

• 第一链cDNA合成

• 全长cDNA文库构建

• DNA标记

产品组成

Maxima H Minus Reverse Transcriptase组分包括：

• Maxima Reverse Transcriptase, 200 U/µL

• 5×RT Buffer (250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25°C), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2, 50 mM DTT）

Maxima H Minus Reverse Transcriptase

#EP0751 2,000 units

#EP0752 10,000 units

#EP0753 4 x 10,000 units

	图3.18 Maxima H Minus Reverse Transcriptase可在一个很宽的温度范围内合成高产量的cDNA。使用1 μg Invitrogen Millennium RNA Markers(带polyA尾) 和oligo(dT)18引物在不同温度下合成放射性标记的cDNA，反应产物在碱性琼脂糖凝胶中分析。
	图3.19 Maxima H Minus Reverse Transcriptase在两步法RT-PCR中扩增长达20 kb的目的片段。以来自人类(1和2泳道)和小鼠(3和4泳道)细胞的1 µg总RNA为模板在最佳反应条件下使用Maxima H Minus反转录酶和其它供应商的RT酶进行反转录反应。合成的cDNA用作PCR反应的模板。M: GeneRuler 1 kb Plus DNA分子量标准。

Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR

Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR是用于两步法RT-qPCR中cDNA合成的方便系统。试剂盒包含Maxima Reverse Transcriptase，其为由M-MuLV通过体外改造而来的高性能反转录酶。相比野生型M-MuLV，该酶具有增强的热稳定性、扩增能力、cDNA合成速率。Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR可针对宽范围的总RNA量(1 pg - 5 µg)，在更高的温度范围内(42-65°C)进行可重复的cDNA合成。合成反应可在15-30分钟内完成。Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR的组分已经预先混合，可节约时间并降低移液引起的误差。Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR , with dsDNase中包含新型双链特异性DNase(dsDNase)，可在2分钟内从RNA中快速去除基因组DNA污染，而不会影响RNA的质量和数量。针对双链DNA的高特异性使得单链DNA(如cDNA和引物)不会被去除，处理后的RNA样本可直接进行反转录。

特点

• 高产量合成全长cDNA，长度可达20 kb

• 在宽温度范围内(42-65°C)均能进行高效的cDNA合成

• 快速—在15-30分钟内即可完成cDNA合成

• 高灵敏度和高特异性

应用

• 两步法RT-PCR

• 两步法RT-qPCR

产品组成

Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR组分包括：

• Maxima Enzyme Mix (Maxima Reverse Transcriptase and RiboLock RNase Inhibitor)

• 5×Reaction Mix (reaction buffer, dNTPs, oligo(dT)18 and random hexamer primers)

• nuclease-free water

Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR , with dsDNase组分包括：

• Maxima Enzyme Mix (Maxima Reverse Transcriptase and RiboLock RNase Inhibitor)

• 5×Reaction Mix (reaction buffer, dNTPs, oligo(dT)18 and random hexamer primers)

• dsDNase

• 10×dsDNase Buffer

• nuclease-free water

Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR

#K1641 50 reactions

#K1642 200 reactions

Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR, with dsDNase

#K1671 50 reactions

#K1672 200 reactions

图3.20 高灵敏度的两步法RT-qPCR。A–扩增曲线。 B–标准曲线。以不同起始量的Jurkat细胞总RNA (5 μg、2.5 μg、1 μg、100 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg)为模板扩增人PPP1CA基因。第一链cDNA用Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR(#K1641)制备。得到的cDNA用Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix(2x)进行扩增(使用PPP1CA基因特异TaqMan探针，ABI 7500 qPCR 仪)。成功检测出1pg的总RNA。反应效率为105%，斜率3.29，R2=0.999。

Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit

Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit是高效合成cDNA的完整系统。试剂盒所使用的Maxima H Minus Reverse Transcriptase是由M-MuLV通过体外改造而来的高性能反转录酶。相比M-MuLV衍生酶，该酶具有最高的热稳定性，且无RNase H活性。Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit可实现在较高温度下(高达65°C)合成长达20 kb的长链cDNA，长链cDNA合成能力优于同类反转录试剂。增强的cDNA合成速率使得可在30 min内完成cDNA合成。Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit with dsDNase将基因组DNA去除和cDNA合成结合成一管式反应，极大简化了实验流程。该试剂盒包含新型双链特异性DNase(dsDNase)，可在2分钟内从RNA中快速去除基因组DNA污染，而不会影响RNA的质量和数量。针对双链DNA的高特异性使得单链DNA(如cDNA和引物)不会被去除，处理后的RNA样本可直接进行反转录。

特点

• 高产量合成全长cDNA，长度可达20 kb

• 在宽温度范围内(42-65°C)均能进行高效的cDNA合成

• 快速—30分钟内即可完成cDNA合成

• 灵活的引物选择，可使用oligo(dT)18、随机引物或基因特异性引物。

应用

• RT-PCR中第一链cDNA合成

• cDNA文库构建

• 获取杂交探针

• 反义RNA合成

产品组成

Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit组分包括：

• Maxima H Minus Enzyme Mix (includes Maxima H Minus Reverse Transcriptase and RiboLock RNase Inhibitor)

• 5×RT Buffer (250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25°C), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2, 50 mM DTT)

• 10 mM dNTP Mix

• Oligo(dT)18 primer, 100 µM

• Random hexamer primer, 100 µM

• Water, nuclease-free Maxima H Minus First Strand cDNA

Synthesis Kit with dsDNase组分包括：

• Maxima H Minus Enzyme Mix (includes Maxima H Minus Reverse Transcriptase and RiboLock RNase Inhibitor)

• 5×RT Buffer (250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25°C), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2, 50 mM DTT)

• 10 mM dNTP Mix

• Oligo(dT)18 primer, 100 µM

• Random hexamer primer, 100 µM

• dsDNase

• 10×dsDNase Buffer

• Water, nuclease-free

Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit

#K1651 20 reactions

#K1652 100 reactions

Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit, with dsDNase

#K1681 20 reactions

#K1682 100 reactions

Maxima H Minus cDNA Synthesis Master Mix

Maxima H Minus cDNA Synthesis Master Mix为方便的一管式预混液，包含cDNA合成所需所有组分。其经过特殊优化，适合用于两步法RT-qPCR。预混液中包含Maxima H Minus Reverse Transcriptase和RiboLock RNase Inhibitor。Maxima H Minus Reverse Transcriptase是由M-MuLV通过体外改造而来的高性能反转录酶。相比M-MuLV衍生酶，该酶具有最高的热稳定性，且无RNase H活性。重组RiboLock RNase Inhibitor可在高达55°C下高效保护RNA免于RNases A、B和C的降解。预混液中同时还包含反应缓冲液、dNTPs、oligo (dT)18引物和随机引物。另外单独提供一管No-RT对照预混液。Maxima H Minus cDNA Synthesis Master Mix可在更高温度范围内(50–65°C)进行可重复的cDNA合成。合成反应可在15-30 min内完成。随附提供的双链DNase(dsDNase)可在2分钟内从RNA中快速去除基因组DNA污染，而不会影响RNA的质量和数量。

特点

• 一管式预混液可减少移液步骤，增强RT-qPCR结果的一致性

• 对于宽范围的RNA起始量可进行高效反转录

• 高热稳定性，使得可在更高宽温度范围内(50-65°C)进行cDNA合成

应用

• 两步法RT-qPCR

产品组成

Maxima H Minus cDNA Synthesis Master Mix组分包括：

• Maxima H Minus cDNA Synthesis Master Mix

• Maxima H Minus cDNA Synthesis Master Mix No RT Control

• Nuclease-free water Maxima H Minus cDNA Synthesis Master Mix, with dsDNase组分包括：

• Maxima H Minus cDNA Synthesis Master Mix

• Maxima H Minus cDNA Synthesis Master Mix No RT Control

• dsDNase

• 10×dsDNase buffer

• Nuclease-free water

Maxima H Minus cDNA Synthesis Master Mix

#M1661 50 reactions

#M1662 200 reactions

Maxima H Minus cDNA Synthesis Master Mix, with dsDNase

#M1681 50 reactions

#M1682 200 reactions

图3.21 Maxima H Minus cDNA合成预混液可以在较宽的RNA起始范围内，提供较其他商品化的预混液更佳的反转录效率。使用10倍连续稀释的Hela总RNA(1 g至0.1 g)对18S rRNA进行RT-qPCR。使用Maxima H Minus cDNA合成预混液和其他4种商品化预混液生成第一链cDNA。使用Luminaris Probe qPCR预混液和少量ROX染料，在Applied BiosystemsT ViiA 7实时荧光定量PCR系统上扩增cDNA。扩增曲线显示了log(∆Rm)随PCR循环数的变化。

Maxima H Minus Double-Stranded cDNA Synthesis Kit

Maxima H Minus Double-Stranded cDNA Synthesis Kit是从总RNA或mRNA中高效合成双链cDNA的完整系统。第一链cDNA和第二链cDNA在同一反应管里完成，无需中间的有机试剂提取或乙醇沉淀步骤。方便的一管式形式可加速合成过程，同时使cDNA recovery最大化。试剂盒包含预混组分，可减少过程中的移液步骤。

特点

• 高效合成全长双链cDNA

• 快速—2小时内完成整个过程

• 方便—预混组分

• 完整—包含引物、对照、残余RNA去除试剂等

应用

• 全长双链平端cDNA合成，用于克隆

• 双链cDNA文库构建

产品组成

Maxima H Minus Double-Stranded cDNA Synthesis Kit组分包括：

• First Strand Enzyme Mix

• 4×First Strand Reaction Mix

• Second Strand Enzyme Mix

• 5×Second Strand Reaction Mix

• 0.5 M EDTA, pH 8.0

• RNase I, 10 u/µL

• Control RNA, 0.5 µg/µL

• Oligo(dT)18 Primer, 100 µM, 0.5 µg/µL

• Random Hexamer Primer, 100 µM, 0.2 µg/µL

• Water, nuclease-free

Maxima H Minus Double-Stranded cDNA Synthesis Kit

#K2561 10 reactions

#K2562 50 reactions

#K2563 200 reactions

7. 操作方法和使用推荐

2.1 PCR扩增

2.1.1 PCR污染预防

在PCR实验中，模板DNA经过多次复制产生至少上千万个副本。因此，操作时必须格外小心，以防止实验室环境中其它模板和扩增子带来的污染。降低污染风险的常用操作建议如下：

• 在不同的区域中进行DNA样品制备、PCR反应体系配制、热循环扩增和产物分析。

• 在配备有紫外灯的通风橱中配制PCR混合物。

• 进行DNA纯化和反应设置时佩戴干净的手套。

• 使用PCR专用容器。使用正压式移液器或带有气溶胶过滤装置的枪头来制备DNA样品和配制PCR反应。

• 使用经过认证的试剂，包括高质量的水 (如Water, nuclease-free, #R0581)。

• 设置无模板对照(NTC)反应，确保无污染存在。

防止残留污染最常用且有效的方法之一是在PCR反应中使用尿嘧啶-DNA糖基酶 (UDG或UNG)。将PCR反应中的一部分或所有的dTTP用dUTP替代，所有PCR的扩增产物均会含有dUTP。在每次PCR之前，用UDG进行短时间的孵育，可以降解以前的PCR反应残留下来的污染性的扩增子。添加dUTP并不会影响PCR产物溴化乙锭染色的强度或电泳迁移率，因此可以使用常规的琼脂糖凝胶电泳对反应结果进行分析。Taq DNA聚合酶可在合成DNA时将dUTP掺入PCR产物中，但是其它聚合酶或酶混合试剂(如DreamTaq DNA Polymerase (#EP0701)，Phusion High Fidelity DNA Polymerase (#F530L)不能掺入dUTP或者掺入效率极低。

2.1.2 引物设计

PCR引物设计的原则：

• PCR引物长度通常为15-30个核苷酸。

• 引物中最佳GC含量为40-60%。如果C和G核苷酸在引物中均匀分布则更为理想。

• 为了降低引物非特异性结合的风险，避免在引物的3'-末端含有多于三个G或C核苷酸。

• 避免引物内部或引物之间的互补、引物内部的直接重复，从而防止发夹结构的形成和引物二聚体的产生。

• 检查引物和模板DNA之间可能的互补位点。

• 当设计简并引物时，在3'-末端保留至少三个保守核苷酸。

• 常规PCR中，两个引物熔解温度(Tm)之间的差值不应超过5℃。引物熔解温度的估算：含有少于25个核苷酸的引物，可以使用下述公式大致计算其熔解温度(Tm)：Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T)，G, C, A, T =引物中相应核苷酸的数量。

• 引物长度超过25个核苷酸，建议使用专门的在线软件进行计算，这样可将相邻碱基的相互作用和盐浓度等因素的影响也计算在内。

• 对于引物熔解温度的计算，只考虑与模板同源的核苷酸。

• Phusion DNA Polymerase的最佳退火温度可能与使用Taq聚合酶时明显不同。请务必通过www.thermofisher.com/tmcalculator上的熔解温度计算器和说明来确定引物的熔解温度值和最佳退火温度。使用PCR产物进行克隆时需要考虑的因素：当在引物中引入限制性内切酶位点以进行后续的PCR产物酶切和克隆时，限制性内切酶需要额外的碱基来实现有效的剪切。

2.1.3 Thermo Scientific DNA 聚合酶和克隆

Phusion DNA聚合酶极低的错误率使其成为分子克隆的理想选择。我们强烈推荐在所有的分子克隆中均使用Phusion DNA聚合酶进行扩增。在下面的内容中您可以找到使用Phusion扩增的PCR产物进行克隆的相关信息。如果您正在使用由其它DNA 聚合酶扩增得到的PCR产物进行克隆，则需要考虑到不同DNA聚合酶将引入不同类型的末端，从而会影响后续的克隆操作步骤。下列信息供您参考。

	PCR产物末端	用于克隆的适合度
Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase	平末端	***
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	平末端	***
Phusion Flash High-Fidelity DNA Polymerase	平末端	***
Phire Hot Start II DNA Polymerase	平末端	*
DreamTaq Hot Start DNA Polymerase	A尾	*
DreamTaq DNA Polymerase	A尾	*
Taq DNA Polymerase	A尾	*

Phusion DNA Polymerase产生平末端DNA产物。当用Phusion DNA Polymerase扩增的片段进行克隆时，推荐使用平末端克隆。如果需要进行TA克隆，可以通过使用不同的聚合酶 (如Taq DNA Polymerase)在PCR产物的平末端添加3'-dA突出末端。

实验方案：添加3'-dA突出末端 (TA克隆)

1) 对PCR产物进行纯化(如使用PCR纯化试剂盒或酚抽提及DNA沉淀)。在添加突出末端以前，PCR产物的纯化非常重要，用以确保PCR产物中所有的Phusion DNA Polymerase均被除去。由于Phusion DNA Polymerase的校正能力非常强，任何残留的Phusion DNA Polymerase都将降解3'–dA突出末端，再次产生平末端。

2) 使用Taq DNA聚合酶添加A尾。反应组分：经过纯化的PCR产物、0.2 mM dATP、1x Taq Buffer和 1 U Taq DNA Polymerase。72℃下孵育20分钟。

3) 进入TA克隆阶段。为了获得最佳连接效率，建议使用新鲜的PCR产物，因为在储存期间，3'-dA突出末端会逐渐丢失。

2.2 RT-PCR

2.2.1 RNase污染预防指南

在开始RT-PCR定量检测之前，请阅读关于PCR的实验方案和操作建议。RNA的纯度和完整性是合成全长cDNA的关键。RNA的质量受RNase A的影响，RNase A是一般实验室环境中存在的非常稳定的污染物。因此，从事RNA研究时，需要时刻考虑到RNase污染的问题。所有应用于反转录反应的产品(包括酶、缓冲液、水、核苷酸和寡核苷酸)经严格测试均不含RNase污染。为防止污染这些高质量的组分，实验室环境和所有自制溶液也必须无RNase污染。

避免RNase污染的常规操作建议：

• 用DEPC处理所有在cDNA合成中将要使用的试管和枪头，或使用经过认证的无RNase的实验室器具。

• 使用RNA工作专用的移液器。

• 操作RNA和所有试剂时需佩戴手套，因为皮肤是RNase的主要来源。经常更换手套。

• 使用鉴定合格的试剂，包括高质量的水(如DEPC-treated water)。

• 使用RNase抑制剂来稳定RNA，例如RiboLock RNase Inhibitor (#EO0381)。

• 进行cDNA合成前，要求对RNA的完整性进行鉴定。

• 例如，如果在总RNA的变性琼脂糖凝胶电泳中，人的18S rRNA(分子量约1.9 kb)和28S rRNA(分子量约为5 kb)都形成了非常窄的条带，则认为该样品中的mRNA是完整无缺的。

2.2.2 RT反应混合物的组分

模板RNA

标准方法分离的细胞总RNA，可与Thermo Scientific反转录酶或第一链cDNA合成试剂盒一起成功使用。纯化的RNA要求无盐、金属离子、乙醇和酚残留，以避免在反转录反应期间产生抑制作用。另外，RT-PCR的模板RNA必须无DNA污染，以避免PCR或qPCR出现假阳性结果。推荐使用DNase I RNasefree(#EN0521)除去制备的RNA中痕量的DNA残留。设置RT-PCR对照反应，对照组中模板是未经反转录的RNA。

从制备的RNA中除去基因组DNA：

1. 在RNase-free的试管中加入以下组分：

RNA	1-2 μg
10x reaction buffer with MgCl₂	1 μL
DNase I, RNase-free (#EN0521)	1-2 μL (1-2 U)
DEPC-treated Water	to 9 μL
总体积	10 μL

2. 37℃孵育30分钟。

3. 加入1 μL 50 mM EDTA后，65℃孵育10分钟。无螯合剂存在时加热将促使RNA水解。或者使用酚/氯仿抽提RNA。

4. 所制备的RNA可用作反转录的模板。

备注：

• 每μg RNA，不要使用超过1U的DNase。

• 如果有大量RNA，可以将反应体系放大。

• 推荐的RNA最终浓度为0.1-0.2 μg/μL。

• RiboLock RNase Inhibitor (#EO0381)也可以加入到反应体系中，抑制可能存在于起始RNA溶液中的RNase A。推荐使用浓度为1 U/μL。

引物

oligo(dT)18、随机引物或基因特异性引物均可用于第一链cDNA的合成。Oligo(dT)18引物从真核mRNA 3'-末端的Poly(A)尾开始合成cDNA。而随机引物，如六聚体引物，可以从所有类型RNA(rRNA和mRNA)开始进行cDNA合成。因此，使用随机引物合成的cDNA比使用Oligo(dT)18引物合成的cDNA更加复杂，可能降低接下来PCR反应的灵敏度和/或特异性。然而，随机引物可以优先应用于以下几种情况：使用无poly(A)尾的真核生物mRNA进行cDNA合成，或使用富含poly(A)的RNA模板进行cDNA合成，以及进行长片段mRNA 5'-区域的RT-PCR。基因特异性引物为cDNA合成提供了最高的特异性，引物由用户自己制备。

反转录酶

所有的反转录酶均适用于全长第一链cDNA合成，但反转录酶在反应温度、可转录的RNA量、灵敏度和RNase H活性方面有所不同。

2.2.3 第一链cDNA的合成

下面列出了使用RevertAid H Minus Reverse Transcriptase进行第一链cDNA合成的实验方案。

预混液

为了准备多个平行实验并最大程度减少加样误差和污染，先将除了RNA模板和引物之外的所有反应组分预先混合制备成RT预混液。制备好足量的预混液 (足够用于所需反应并多配制一份以补偿加样误差)。将模板RNA加入到各个试管中，并置于冰上。将所制备的预混液等分加入含有RNA的试管中。各组分自冷藏取出后，融化混匀并短暂离心，冰浴放置。

1. 按以下顺序在无菌、nuclease-free的试管(冰浴放置)中加入以下组分：

模板RNA	总RNA或poly(A) RNA或特异性RNA	0.1 ng - 5 μg; 0.2 10-500 ng 0.01 pg - 0.5 μg
引物	Oligo(dT)18引物(#SO131)或随机六聚体引物 (#SO142)或基因特异性引物	0.5 μg (100 pmol); 0.2 μg (100 pmol); 15-20 pmol
DEPC-treated Water (#R0601)		to 12.5 μL
总体积		12.5 μL

2. 可选：如果RNA模板GC含量高，或含有二级结构，则需要轻轻混匀，短暂离心，65℃孵育5分钟后在冰上急冷，短暂离心后冰浴放置。

3. 按指定顺序添加下述组分，或制备预混液：

5×反应缓冲液	4 μL
RiboLock RNase Inhibitor (#EO0381)	0.5 μL (20 U)
dNTP Mix, 10 mM each (#R0191)	2 μL (1 mM终浓度)
RevertAid H Minus Reverse Transcriptase (#EP0451)	1 μL (200 U)
总体积	20 μL

4. 轻轻混匀并短暂离心。

5. 如果引物为 oligo(dT)18 或基因特异性引物，反应条件为42℃孵育60分钟。如果使用随机六聚体引物，则在25℃孵育10分钟后，再在42℃孵育60分钟。对于GC含量高的RNA的转录实验，可将反应温度升高到45℃。

6. 反应液70℃加热5分钟以终止反应。

备注

• 反转录产物可直接用于PCR中，或在-20℃下储存。

• 在50 μL PCR反应体系中，使用2 μL 反转录反应混合物。

8. 疑难解答指南

表3.1. PCR 和RT-PCR疑难解答指南

问题

可能原因及推荐的解决方案

1. 产量低或无PCR/RT-PCR产物

1.1. 模板质量差或数量少

模板完整性差

DNA模板：用琼脂糖凝胶电泳分析模板的完整性。使用温和的DNA分离方法以尽量减少DNA的断裂和缺口。分离得到的DNA重悬在pH 8.0的TE缓冲液或Water, nuclease-free(#R0581)中。

RNA模板：RNA的纯度和完整性将影响全长cDNA的合成以及高质量的RT-PCR产物的制备。在进行cDNA合成之前，对RNA的完整性进行评估。例如，总RNA在变性琼脂糖凝胶电泳过程中，人18S rRNA (分子量约为1.9 kb)和28S rRNA (分子量约为5kb)都形成了非常窄的条带，则认为该样品中的mRNA是完整的。请遵照常规建议防止RNase污染。

模板纯度差

DNA模板：大多数商业化DNA纯化方法制备的模板通常适合PCR。我们提供多种DNA纯化试剂盒，如Genomic DNA Purification Kit (#K0512)和GeneJET Plasmid Miniprep Kit (#K0502)。自制试剂纯化的DNA样本中，可能含有痕量酚、EDTA以及蛋白酶K,这些成分可能会抑制热稳定DNA聚合酶的活性。此外，较高的离子浓度(如K⁺、Mg²⁺等)可能使DNA聚合酶的扩增处于次优化状态。在这些情况下，应使用GeneJET PCR Purification Kit (#KO701)对模板重新进行纯化，或重新沉淀后使用70%乙醇洗涤处理。DNA的纯度可通过分光光度法(如NanoDrop分光光度计)分析A260/A280比率来测定，最佳比值为1.8-2.1。

RNA模板：某些RNA纯化试剂可能会痕量残留并抑制逆转录酶的活性，如SDS、EDTA、胍盐、磷酸盐、焦磷酸盐、多胺、亚精胺等。建议采用乙醇沉淀RNA，并用75%的乙醇洗涤沉淀。可以使用分光光度法 (如NanoDrop分光光度计)分析A260/A280比率来测定RNA的纯度，最佳比值为1.8-2.0。此比率受pH值影响，因此在10 mM Tris-Cl (pH 7.5)中对RNA样品的吸光度进行测定，要优于在不含缓冲成分的水中测定。

模板数量低

DNA模板：确认使用的模板量与相应聚合酶说明书中推荐的量相符。使用灵敏度比Taq DNA聚合酶更高的酶或master mix，如DreamTaq DNA Polymerase(#EP0701)、 Phire Hot Start II DNA Polymerase (#F122L)或Phusion High Fidelity DNA Polymerase (#F530L)。

RNA模板：将模板用量增加至推荐的水平。经DNase I处理后，在EDTA存在的情况下，加热使酶失活来终止反应。注意：二价阳离子存在情况下，加热会导致RNA的降解。

1.2. 引物设计不完善

DNA模板：使用引物设计软件或按照PCR引物设计原则设计引物。确保引物自身及引物对之间无互补序列。引物复合物的延伸将会消耗反应组分，并降低PCR的产率。确认引物与正确的DNA模板链互补。

RNA模板：在逆转录反应中，根据RNA模板类型，使用正确的引物。对于细菌RNA或不含poly(A)尾的RNA，不应使用oligo(dT)₁₈引物，推荐使用随机六聚体引物。如果使用序列特异性引物，确保该序列特异性引物与模板RNA的3'-末端互补。

1.3. 热循环条件未优化

针对特定的DNA聚合酶，按照其PCR实验说明书进行实验，因为不同的聚合酶需要不同的热循环条件。

退火

根据聚合酶说明书选择合适的退火温度。请注意，不同聚合酶具有不同的退火温度，如Phusion和Taq DNA Polymerase的退火温度就显著不同。可以以1-2℃为单位对退火温度进行逐步优化。如果设备允许，可使用梯度循环仪优化特殊引物对的退火温度(±10℃)。如果使用了对引物－模板二聚复合物的退火温度有影响的添加剂，如甘油、DMSO、甲酰胺、三甲基甘氨酸和TMANO (trimetylamine-N-oxide)，则退火温度也要进行相应调整。

延伸

推荐的反应温度为72℃。请参照您使用的聚合酶的说明书来确定最佳反应温度。

循环数

循环数的变化取决于PCR混合物中DNA模板量以及PCR产物的预期产量。通常，25-35个循环足够制备足量的PCR产物。请注意：直接PCR试剂盒推荐使用40个循环。反应中模板DNA少于10个拷贝数时，则需将循环数增加至40个。

1.4. 反应条件未优化

DNA聚合酶用量不够

根据您的聚合酶的说明书来确定最佳的DNA聚合酶用量。

引物用量不够

通常，成功的PCR的引物浓度范围是0.1-1 μM，其优化条件取决于特异性的引物/模板对。0.4 μM 的引物浓度可作为优化的起始浓度。对于长片段PCR和简并引物PCR，推荐使用至少0.5 μM的引物浓度。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可对引物的降解进行检测。在缺少dNTPs的情况下，PCR引物可能会由于Phusion High Fidelity DNA Polymerase的3'→5'核酸外切酶活性而降解。因此，在反应设置期间必须将PCR混合物放置在冰上，且聚合酶应是最后添加到反应混合物中的试剂。也可使用热启动的Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase (#F549L)，因为该聚合酶的3'→5'核酸外切酶活性在室温下被抑制，有助于反应设置。

Mg²⁺浓度低

通常，在我们的PCR缓冲液中已经对Mg²⁺浓度进行了预先优化。因此，多数情况下不需要对Mg²⁺浓度进行优化。Mg²⁺的浓度可在使用说明中查到。当Mg²⁺浓度过低时，PCR产率可能会降低。由于Mg²⁺会与dNTPs、引物以及DNA模板结合，为了获得最佳的PCR产率，可能需要对Mg²⁺浓度进行优化。推荐在1-4 mM浓度范围内对Mg²⁺浓度进行优化。如果模板DNA含有EDTA或其它金属螯合剂，则须相应增加PCR混合物中的Mg²⁺浓度(1分子EDTA将会结合1分子的Mg²⁺)。在某些PCR应用中，需要更高的dNTP浓度。dNTPs也会与Mg²⁺形成复合物，因此需要相应增加Mg²⁺浓度。

反应混合试剂中存在dUTP或修饰核苷酸

具有校正活性的聚合酶 (如 Phusion High Fidelity DNA Polymerase)不能掺入dUTP。这种聚合酶不能读取模板链中的dUTP或dITP衍生物，因此，不推荐使用类似物或含有这类核苷酸的引物。如果条件允许，使用不具有校正活性的聚合酶，如Taq DNA聚合酶将dUTP掺入到PCR产物中。

Master Mix混合不均匀

如果使用即用型PCR master mix，在配制PCR反应体系前，确认试剂融化完全，并翻转试管以保证混合均匀彻底。

1.5. 复杂的模板

GC含量高的模板

DNA模板：如果模板GC含量高和/或形成了复杂的二级结构，对于常规PCR，我们推荐使用DreamTaq PCR Master Mix (K#1072)；对于高保真PCR，推荐使用带有GC Buffer (#F519L)的Phusion DNA Polymerase(#F530L)。也可以通过添加10-15%的甘油、10%的DMSO或5%的甲酰胺来增强DNA变性效果。当高浓度使用这些添加剂中的任何一种时，必须降低退火温度。部分添加剂，如DMSO、甲酰胺等，可能会抑制聚合酶活性，为了在这些添加剂存在的情况下获得最佳结果，可能需要对酶的用量进行滴定。

RNA模板：如果RNA模板GC含量较高或具有二级结构，使用热稳定性高的逆转录酶，如RevertAid Reverse Transcriptase (#EP0441)或 Maxima Reverse Transcriptase (#EP0741)，并升高逆转录反应的温度。

长片段模板

对于长度超过5 kb的模板，使用合适的PCR酶。例如，对于常规PCR，使用DreamTaq PCR Master Mix (K#1072)；对于需要高保真度的PCR，使用Phusion DNA Polymerase (如#F530L)。确保模板DNA的完整性未被破坏，并使用推荐的变性温度。

2. 非特异性PCR产物

2.1. 引物设计不完善

使用引物设计软件或按照PCR引物设计原则。确认引物与正确的DNA模板链互补。

确保引物与模板待扩增区域的目标序列特异性互补，而不与模板DNA中其它区域互补。否则，引物将会在退火阶段与模板形成非特异性结合并产生非特异性的扩增产物。确保引物自身及引物之间不互补，否则，引物复合物的延伸将会产生非特异性扩增。避免引物中含有直接的重复序列，限制比目标扩增子更大的PCR产物出现。

2.2. 室温配制反应混合物

室温下配制PCR反应混合物时，DNA聚合酶将会具有少量但是明显的活性。起始阶段的非特异性结合可能会导致在PCR扩增过程中产生非预期的扩增产物。为了避免这种情况的出现，当使用非热启动DNA聚合酶时，必须在冰上配制PCR反应体系。另外，也可使用热启动PCR聚合酶，其在室温下无活性，需在PCR循环时高温处理后才能被激活。在热启动PCR反应中，最大程度地减少了非特异性扩增，并提高了目标产品的产量。使用热启动酶时，可在室温配制PCR反应混合物。

2.3. 反应条件未优化

Mg²⁺浓度过高

Mg²⁺浓度过高会导致非特异性PCR产物。推荐优化浓度范围为1-4 mM。请按照您使用的聚合酶说明书中提供的方法进行实验设计。

模板用量过多

模板用量的增加会提高产生非特异性PCR产物的风险。通常，当模板来源为复杂程度较低的质粒或BAC DNA时，可降低模板DNA用量。请按照您使用的聚合酶说明书中提供的方法进行实验设计。

2.4. 热循环条件未优化

请按照您使用的聚合酶说明书提供的实验方法进行实验设计。如果条件允许，使用梯度循环仪优化特异引物对的退火温度(±10℃)。如果反应体系中加入了能够改变引物-模板二聚复合物的退火温度的添加剂，如甘油、DMSO、甲酰胺、三甲胺乙内酯和TMANO(trimetylamine-N-oxide)时，须对退火温度进行调整。

3. PCR产物序列错误

3.1. PCR产物内的序列错误

克隆后测序检测到的DNA序列错误可能是由于克隆过程导致的，请参阅www.thermofisher.com网站上关于分子克隆的疑难解答指南。

使用低保真的热稳定性DNA聚合酶

当PCR产物将应用于克隆或定点突变等下游实验时，推荐使用高保真的热稳定DNA聚合酶，如Phusion High FidelityDNA Polymerase (如#F530L)。

反应条件未优化

• Mg²⁺浓度过高：如果Mg²⁺浓度太高，PCR的保真度将会降低。推荐的Mg²⁺浓度优化范围为1-4 mM。

• 模板浓度未优化：请按照您使用的DNA聚合酶说明书进行模板浓度优化。

• dNTP浓度未平衡：在反应混合物中，确保所有核苷酸 (dATP、 dCTP、dGTP和 dTTP)具有相同的浓度是非常重要的。如果核苷酸浓度不平衡，PCR的差错率会显著增加。Thermo Scientific 提供的dNTP Mix中各种核苷酸的浓度相同，分别有2 mM (#R0241)、10 mM (#R0191)或 25 mM (#R1121)三种选择。四种dNTPs的浓度完全平衡可确保扩增的保真性和增加PCR的产量。

PCR产物过度暴露在紫外光下

琼脂糖分析和凝胶回收PCR产物时，需使用长波长(360 nm)的UV灯箱。当使用短波长(254-312nm)UV灯箱时，需将UV光照时间缩短至几秒钟。UV照射期间，将凝胶置于玻璃板或塑料板上。此外，可使用在自然光线下可见的染料观测标准琼脂糖凝胶中的PCR 产物1, 2。

测序错误

为了验证测序结果的可靠性，对DNA进行双向测序。

3.2. PCR产物末端的序列错误

PCR产物末端的DNA序列错误只能通过克隆PCR产物后才能鉴定，因此也请参阅www.thermofisher.com网站上关于分子克隆的疑难解答指南。

引物设计错误

避免引物中含有直接重复，否则可能会导致PCR产物末端出现多次重复。

引物质量差

由于寡核苷酸以3'→5'方向合成，所以靠近5'末端可能会出现序列错误。建议从可靠的供应商处重新订购引物。在需要进行全长扩增的实验中，例如定点突变实验，可使用PAGE或HPLC纯化级别的引物。

克隆期间PCR产物末端改变

• 核酸酶污染：在核酸提取过程中或酶切、连接混合物中存在的DNA核酸酶可能会改变PCR产物的末端。

• 酶切反应体系中存在DNA聚合酶：PCR产物酶切前，采用如GeneJET PCR Purification Kit (#KO701)过柱或酚/氯仿提取后乙醇沉淀的方法除去有活性的嗜热性DNA聚合酶。DNA聚合酶可能会改变PCR片段酶切产物的末端。

• UV照射破坏PCR产物：琼脂糖分析和凝胶回收PCR产物时，需使用长波长(360 nm)的UV灯箱。当使用短波长(254-312 nm)UV灯箱时，需将UV光照时间缩短至几秒钟。UV照射期间，将凝胶置于玻璃板或塑料板上。此外，可使用在自然光线下可见的染料观测标准琼脂糖凝胶中的PCR 产物1, 2。

测序错误

为了验证测序结果的可靠性，对DNA进行双向测序。确保测序引物的结合位点距离克隆载体的插入位点至少有20个核苷酸。

4. 阴性对照

中出现PCR/

RT-PCR产物

4.1. 交叉污染

工作环境中的DNA或RNA导致PCR反应体系污染。

4.2. 残留污染

PCR反应被之前的扩增产物污染。如果多次扩增相同的目标序列，建议使用残留污染控制技术。常用避免残留污染的方法是在PCR中掺入dUTP。每次PCR之前，使用UDG处理模板，该酶可降解含有dUTP的污染物。请注意，具有校正功能的聚合酶不能在聚合反应过程中掺入dTUP。

4.3. 引物设计不完善

DNA模板：避免引物内存在直接重复序列、自身互补序列，以及引物之间存在互补序列，因为引物聚合会产生非预期的扩增产物。

RNA模板：为了避免基因组DNA的扩增，设计引物最好是定位在外显子/内含子的边界上。使用DNase I, RNase-free (#ENO521)除去RNA模板中的基因组DNA 。

4.4. RNA模板含有基因组DNA污染

阴性对照中出现PCR扩增产物表明样本中含有基因组DNA污染。在逆转录前需使用DNase I处理样本。

5. PCR克隆

效率低

5.1. 聚合酶选择不正确

如需扩增适合于直接平末端克隆的PCR产物，请使用具有校正活性的DNA聚合酶，如Phusion High Fidelity DNA Polymerase (如#F530L)。如需进行TA克隆，则可通过使用不具有校正活性的聚合酶，如 DreamTaq DNA Polymerase (#EP0701)、DreamTaq Hot Start DNA Polymerase (EP1701)、Taq DNA Polymerase(#EP0401)在PCR产物的平末端上添加3'-dA。

• CloneJET PCR Cloning Kit (#K1231)可实现任何DNA聚合酶扩增产物的高效克隆。

5.2. PCR产物酶切效率低

引物设计不完善

如需在PCR引物中引入限制性内切酶位点以实现后续PCR产物的酶切及克隆，要求添加额外的保护碱基，因为其对于常规限制性酶的有效剪切至关重要。

引物质量差

由于寡核苷酸按3'→5'方向合成，所以在靠近5'-末端处可能会出现序列错误。建议从可靠的供应商处重新订购引物。

酶切反应混合物中存在DNA聚合酶

为了更好的进行克隆反应，PCR产物酶切前，建议使用如GeneJET PCR Purification Kit (#K0701)过柱方法或采用酚/氯仿提取后乙醇沉淀的方法来除去具有活性的嗜热性DNA聚合酶。DNA聚合酶可能会改变PCR片段酶切产物的末端，降低连接效率。

限制酶对PCR反应混合物组分敏感

使用常规限制酶或新型FastDigest限制酶对PCR产物进行有效酶切时，请参照www.thermofisher.com网站上的使用说明。

5.3. 用于TA克隆的PCR产物dA-加尾效率低

最终的延伸步骤时间过短

PCR循环中，最终延伸步骤可以延长至20-30分钟，以确保PCR产物高效dA-加尾，可使重组克隆数量增加3-4倍。

引物设计不完善

Taq DNA聚合酶的末端转移酶(3'-末端延伸)活性具有模板特异性，与模板3'末端核苷酸有关。因此，PCR产物的TA克隆效率需重点考虑引物的5'-末端核苷酸。引物5'-末端的核苷酸的dA-加尾效率从高到低依次为：G > C >T >A⁴。

5.4核酸酶污染

在提取期间或酶切及连接反应中存在的DNA核酸酶可能会改变PCR产物的末端。

9. qPCR 引物集锦

基因	引物序列	基因	引物序列
eNOS (human)	F5'-3': TCCCCCAGAACTCTTCCTT R5'-3': CTCATTCTCCAGGTGCTTCA
GAPDH	F5'-3': ATGGGGAAGGTGAAGGTCG R5'-3': TAAAAGCAGCCCTGGTGACC
vWF(human)	F5'-3': CAAGGAAGAAAATAACACAGGTGAA R5'-3': TCATTGACCTTGCAGAAGTGAGTAT
VEGFR2 (human)	F5'-3': GACTTCCTGACCTTGGAGCATCT R5'-3': GATTTTAACCACGTTCTTCTCCGA

10. 限制性内切酶反应条件

Thermo Scientific Enzyme	Recommended buffer for	Enzyme activity in 5-buffer system buffers, %						Tango buffer for double digestion	Units for overnight incubation,u/μg DNA	Thermal inactivation in 20 min
Thermo Scientific Enzyme	Recommended buffer for	B(blue)1X	G(green)1X	O(orange)1X	R(red)1X	Tango(yellow)1X / 2X		Tango buffer for double digestion	Units for overnight incubation,u/μg DNA	Thermal inactivation in 20 min
AanI (PsiI)	Tango	50-100	50-100	0-20	0-20	100	20-50	1X or 2X	0.5	65°C
AarI	AarI +oligo	NR (+oligo)	NR (+oligo)	0-20 (+oligo)	0-20 (+oligo)	NR (+oligo)	50-100 (+oligo)	2X (+oligo)	0.9	65°C
AatII	Tango	50-100	20-50	0-20	0-20	100	20-50	1X or 2X	0.3	65°C
Acc65I (Asp718I)	O	0-20	20-50	100	20-50	20-50	50-100	1X or 2X	0.3	65°C
AdeI (DraIII)	G	0-20	100	20-50	100	100*	20-50	1X* or 2X	0.5	No
AjiI (BmgBI)	AjiI	NR	NR	20-50*	NR	NR	20-50*	2X*	0.5	65°C
AjuI	R +SAM	0-20 (+SAM)	50-100 (+SAM)	20-50 (+SAM)	100 (+SAM)	50-100 (+SAM)	50-100 (+SAM)	1X or 2X (+SAM)	0.5	65°C
AloI	R	0-20	0-20	0-20	100	20-50	100	1X or 2X	0.1	65°C
AluI	Tango	50-100	0-20	0-20	0-20	100	20-50	1X or 2X	0.1	65°C
Alw21I (BsiHKAI)	O	0-20	20-50	100	50-100	20-50	50-100	1X or 2X	0.1	65°C
Alw26I	Tango	50-100	100	0-20	0-20	100	100	1X or 2X	0.2	65°C
Alw44I	Tango	50-100	100	0-20	50-100	100	50-100	1X or 2X	0.1	65°C
ApaI	B	100	20-50	0-20	0-20	20-50	0-20	1X	0.2	65°C
BamHI	BamHI	20-50*	100	20-50	50-100*	100*	50-100	1X* or 2X	0.5	80°C (10u)
BauI (BssSI)	Tango	0-20	50-100	0-20	50-100	100	50-100	1X or 2X	0.2	65°C
BclI	G	20-50	100	20-50	20-50	100*	100	1X* or 2X	0.1	80°C (10u)
BcnI (NciI)	Tango	20-50	50-100	50-100	50-100	100	50-100	1X or 2X	0.2	65°C
BcuI (SpeI)	Tango	50-100	50-100	0-20	20-50	100	0-20	1X	0.5	No
BfmI (SfcI)	Tango	0-20	50-100	0-20	0-20	100	20-50	1X or 2X	0.9	65°C
BfuI (BciVI)	BfuI	NR	NR	0-20	0-20	NR	50-100*	2X*	0.9	80°C
BglI	O	0-20	50-100	100	100	0-20	100	2X	0.1	65°C
BglII	O	0-20	20-50	100	50-100	0-20	100	2X	0.1	No
Bme1390I (ScrFI)	O	20-50	50-100	100	50-100	50-100	50-100	1X or 2X	0.2	80°C
BoxI (PshAI)	Tango	0-20	0-20	0-20	20-50	100	20-50	1X or 2X	0.5	80°C
BpiI (BbsI)	G	20-50	100	50-100	50-100	50-100	50-100	1X or 2X	0.3	65°C
BplI	Tango	0-20 (+SAM)	20-50 (+SAM)	0-20 (+SAM)	0-20 (+SAM)	100 (+SAM)	20-50 (+SAM)	1X (+SAM)	0.3	65°C
Bpu10I	Bpu10I	0-20	20-50*	50-100*	100*	50-100*	100*	1X* or 2X*	0.2	80°C
Bpu1102I (BlpI)	Tango	50-100	50-100	20-50	20-50	100	20-50	1X or 2X	0.1	80°C
BseDI (BsaJI)	Tango	50-100	20-50	0-20	0-20	100	50-100	1X or 2X	0.2	80°C
BseGI (BtsCI)	Tango	20-50	50-100	20-50	20-50	100	20-50	1X or 2X	0.2	80°C
BseJI (BsaBI)	O	NR	100*	100	NR	NR	100*	2X*	0.1	No
BseLI (BslI)	Tango	20-50	100	0-20	20-50	100	50-100	1X or 2X	0.1	No
BseMI (BsrDI)	R	0-20	20-50	0-20	100	50-100	50-100	1X or 2X	0.3	80°C
BseMII (BspCNI)	Tango	50-100 (+SAM)	50-100 (+SAM)	50-100 (+SAM)	50-100 (+SAM)	100 (+SAM)	50-100 (+SAM)	1X or 2X (+SAM)	0.5	80°C
BseNI (BsrI)	B	100	20-50	0-20	0-20	50-100	20-50	1X or 2X	0.1	80°C
BseSI (Bme1580I)	G	20-50	100	0-20	20-50	50-100	0-20	1X	0.1	80°C (10u)
BseXI (BbvI)	BseXI	NR	NR	NR	NR	NR	NR	NR	0.3	80°C
Bsh1236I (BstUI)	R	0-20	0-20	50-100	100	20-50	50-100	1X or 2X	0.1	65°C
Bsh1285I (BsiEI)	G	20-50	100	20-50	0-20	0-20	20-50	2X	0.2	65°C
BshNI (BanI)	O	0-20	20-50	100	50-100	0-20	100	2X	0.3	65°C
BshTI (AgeI)	O	0-20	20-50	100	50-100	20-50	20-50	1X or 2X	0.1	65°C
Bsp119I (BstBI)	Tango	20-50	0-20	0-20	0-20	100	100	1X or 2X	0.1	80°C
Bsp120I (PspOMI)	B	100	20-50	0-20	20-50	50-100	0-20	1X	0.1	80°C
Bsp1407I (BsrGI)	Tango	0-20	20-50	0-20	20-50	100	50-100	1X or 2X	0.1	65°C
Bsp143I (Sau3AI)	Bsp143I	20-50	20-50	0-20	0-20	50-100	20-50	1X or 2X	0.1	65°C
Bsp68I (NruI)	O	0-20	20-50	100	50-100	20-50	50-100	1X or 2X	0.1	65°C
BspLI (NlaIV)	Tango	50-100	50-100	0-20	20-50	100	20-50	1X or 2X	0.3	65°C
BspOI (BmtI)	O	0-20	0-20	100	100	0-20	20-50	2X	0.2	80°C
BspPI (AlwI)	Tango	20-50	20-50	0-20	0-20	100	0-20	1X	0.5	80°C
BspTI (AflII)	O	0-20	0-20	100	20-50	0-20	50-100	2X	0.1	65°C
Bst1107I (BstZ17I)	O	20-50	50-100	100	100	20-50	100	1X or 2X	0.1	65°C
BstXI	O	20-50	100	100	50-100	50-100	100	1X or 2X	0.1	65°C
Bsu15I (ClaI)	Tango	20-50	20-50	20-50	20-50	100	20-50	1X or 2X	0.1	65°C
BsuRI (HaeIII)	R	0-20	0-20	0-20	100	50-100	100	1X or 2X	0.1	80°C
BveI (BspMI)	O +oligo	0-20 (+oligo)	20-50 (+oligo)	100 (+oligo)	20-50 (+oligo)	50-100 (+oligo)	100 (+oligo)	1X or 2X (+oligo)	0.2	65°C
CaiI (AlwNI)	Tango	20-50	20-50	20-50	50-100	100	50-100	1X or 2X	0.2	65°C
Cfr10I (BsrFI)	Cfr10I	0-20	20-50	20-50	50-100	20-50	50-100	1X or 2X	0.1	No
Cfr13I (Sau96I)	Tango	50-100	50-100	20-50	20-50	100	20-50	1X or 2X	0.3	65°C
Cfr42I (SacII)	B	100	50-100	0-20	0-20	50-100	0-20	1X	0.1	65°C
Cfr9I (XmaI)	Cfr9I	0-20	0-20	0-20	0-20	20-50	0-20	1X	0.2	65°C
CpoI (RsrII)	Tango	20-50	50-100	50-100	20-50	100	50-100	1X or 2X	0.5	65°C
CseI (HgaI)	R	NR	50-100*	50-100	100	100*	50-100	1X* or 2X	0.5	80°C (10u)
Csp6I (CviQI)	B	100	50-100	0-20	0-20	50-100	0-20	1X	0.1	65°C
DpnI	Tango	100	100	50-100	50-100	100	50-100	1X or 2X	0.1	80°C
DraI	Tango	50-100	50-100	20-50	20-50	100	50-100	1X or 2X	0.1	65°C
Eam1104I (EarI)	Tango	50-100	50-100	0-20	0-20	100	0-20	1X	0.5	65°C
Eam1105I (AhdI)	Eam1105I	20-50	50-100	0-20	0-20	50-100	20-50	1X or 2X	0.1	65°C
Ecl136II (EcoICRI)	Ecl136II	50-100	20-50	0-20	0-20	50-100	0-20	1X	0.2	65°C
Eco105I (SnaBI)	Tango	100*	50-100	0-20	0-20	100	0-20	1X	0.5	65°C
Eco130I (StyI)	O	0-20	20-50	100	50-100	50-100	100	1X or 2X	0.2	65°C
Eco147I (StuI)	B	100	50-100	20-50	20-50	50-100	0-20	1X	0.1	80°C
Eco24I (BanII)	Tango	50-100	50-100	20-50	20-50	100	0-20	1X	0.2	65°C
Eco31I (BsaI)	G	50-100	100	0-20	0-20	50-100	20-50	1X or 2X	0.3	65°C
Eco32I (EcoRV)	R	0-20	50-100	50-100	100	20-50	100	1X or 2X	0.1	65°C
Eco47I (AvaII)	R	0-20	50-100	50-100	100	50-100	50-100	1X or 2X	0.3	65°C
Eco47III (AfeI)	O	0-20	20-50	100	100	50-100	100	1X or 2X	0.1	80°C
Eco52I (EagI)	Eco52I	0-20	0-20	0-20	20-50	0-20	20-50	2X	0.2	65°C
Eco57I (AcuI)	G +SAM	100 (+SAM)	100 (+SAM)	20-50 (+SAM)	20-50 (+SAM)	50-100 (+SAM)	50-100 (+SAM)	1X or 2X (+SAM)	0.9	65°C
Eco72I (PmlI)	Tango	NR	NR	0-20	0-20	100	20-50	1X or 2X	0.5	65°C
Eco81I (Bsu36I)	Tango	50-100	100	0-20	0-20	100	0-20	1X	0.1	80°C
Eco88I (AvaI)	Tango	100	50-100	0-20	0-20	100	20-50	1X or 2X	0.2	65°C
Eco91I (BstEII)	O	20-50	20-50	100	50-100	NR	100	2X	0.1	65°C
EcoO109I (DraII)	Tango	50-100	20-50	20-50	20-50	100	100	1X or 2X	0.2	65°C
EcoRI	EcoRI	0-20	NR	100	100*	NR	100	2X	0.2	65°C
EcoRII	O	20-50	50-100	100	50-100	20-50	50-100	1X or 2X	0.1	80°C
EheI (SfoI)	Tango	20-50	50-100	0-20	0-20	100	20-50	1X or 2X	0.9	65°C
Esp3I (BsmBI)	Tango	100 (+DTT)	20-50 (+DTT)	0-20 (+DTT)	0-20 (+DTT)	100 (+DDT)	0-20 (+DTT)	1X (+DDT)	0.2	65°C
FaqI (BsmFI)	Tango	20-50 (+SAM)	20-50 (+SAM)	0-20 (+SAM)	0-20 (+SAM)	100 (+SAM)	50-100 (+SAM)	1X (+SAM)	0.9	80°C
FspAI	O	0-20	0-20	100	50-100	0-20	50-100	2X	0.2	65°C
FspBI (BfaI)	Tango	50-100	20-50	0-20	0-20	100	0-20	1X	0.3	65°C
GsuI (BpmI)	B	100	50-100	0-20	20-50	100	50-100	1X or 2X	0.9	65°C
HhaI	Tango	50-100	50-100	20-50	20-50	100	20-50	1X or 2X	0.1	80°C
Hin1I (BsaHI)	G	20-50	100	20-50	20-50	20-50	20-50	1X or 2X	0.1	65°C
Hin1II (NlaIII)	G	50-100	100	20-50	50-100	50-100	50-100	1X or 2X	0.3	65°C
Hin6I (HinP1I)	Tango	50-100	50-100	20-50	20-50	100	50-100	1X or 2X	0.1	65°C
HincII (HindII)	Tango	50-100	50-100	20-50	50-100	100	50-100	1X or 2X	0.1	65°C
HindIII	R	0-20	20-50	0-20	100	50-100	50-100	1X or 2X	0.1	80°C
HinfI	R	0-20	20-50	50-100	100	50-100	50-100	1X or 2X	0.1	65°C
HpaII	Tango	50-100	50-100	0-20	20-50	100	20-50	1X or 2X	0.1	65°C
HphI	B	100	0-20	0-20	0-20	20-50	0-20	1X	0.1	65°C
Hpy8I (MjaIV)	Tango	50-100	50-100	0-20	20-50	100	50-100	1X or 2X	0.1	80°C
HpyF10VI (MwoI)	Tango	0-20	0-20	0-20	0-20	100	50-100	1X or 2X	0.1	80°C
HpyF3I (DdeI)	Tango	20-50	20-50	20-50	20-50	100	50-100	1X or 2X	0.2	65°C
I-SceI	Tango	50-100	50-100	50-100	50-100	100	50-100	1X or 2X	0.9	65°C
Kpn2I (BspEI)	Tango	50-100	50-100	0-20	20-50	100	50-100	1X or 2X	0.1	80°C
KpnI	KpnI	20-50	0-20	0-20	0-20	20-50	0-20	1X	0.2	80°C
KspAI (HpaI)	B	100	50-100*	20-50	20-50	100*	50-100	1X* or 2X*	0.5	65°C
LguI (SapI)	Tango	20-50	50-100	20-50	20-50	100	20-50	1X or 2X	0.5	65°C
Lsp1109I (BbvI)	Lsp1109I	0-20	20-50*	50-100*	100	20-50*	20-50*	1X* or 2X	0.5	65°C
LweI (SfaNI)	Tango	0-20	0-20	0-20	20-50	100	20-50	1X or 2X	0.2	65°C
MauBI	Tango	0-20	0-20	0-20	0-20	100	0-20	1X	0.1	65°C
MbiI (BsrBI)	Tango	20-50	100	0-20	20-50	100	20-50	1X or 2X	0.2	65°C
MboI	R	50-100	50-100	50-100	100	50-100	100	1X or 2X	0.1	65°C
MboII	B	100	50-100	20-50	0-20	50-100	20-50	1X or 2X	0.9	65°C
MlsI (MscI)	R	0-20	20-50	0-20	100	20-50	50-100	1X or 2X	0.5	65°C
MluI	R	0-20	20-50	50-100	100	20-50	50-100	1X or 2X	0.1	65°C
MnlI	G	50-100	100	20-50	20-50	20-50	20-50	1X or 2X	0.5	65°C
Mph1103I (NsiI)	R	0-20	50-100	20-50	100	50-100	50-100	1X or 2X	0.3	65°C
MreI (Sse232I)	G	0-20	100	0-20	0-20	50-100	0-20	1X	0.5	80°C
MspI (HpaII)	Tango	50-100	50-100	0-20	0-20	100	50-100	1X or 2X	0.3	65°C
MssI (PmeI)	B	100	0-20	0-20	0-20	20-50	0-20	1X	0.5	65°C
MunI (MfeI)	G	100	100	0-20	0-20	100	0-20	1X	0.1	65°C
Mva1269I (BsmI)	R	0-20	20-50	50-100	100	0-20	50-100	2X	0.1	65°C
MvaI (BstNI)	R	20-50	20-50	50-100	100	20-50*	100	1X* or 2X	0.1	80°C (10u)
Nb.Bpu10I	R	0-20	20-50	20-50	100	20-50	50-100	1X or 2X	0.3	80°C
Nb.Mva1269I	O	0-20	20-50	100	100	20-50	50-100	1X or 2X	0.3	80°C
NcoI	Tango	20-50	20-50	20-50	50-100	100	100	1X or 2X	0.1	65°C
NdeI	O	0-20	0-20	100	50-100	0-20	50-100	2X	0.3	65°C
NheI	Tango	100	20-50	0-20	0-20	100	0-20	1X	0.2	65°C
NmuCI (Tsp45I)	R	0-20	20-50	50-100	100	20-50	50-100	1X or 2X	0.1	65°C
NotI	O	0-20	20-50	100	20-50	0-20	20-50	2X	0.1	65°C
NsbI (FspI)	Tango	20-50	50-100	0-20	20-50	100	20-50	1X or 2X	0.1	65°C
Nt.Bpu10I	R	0-20	0-20	100	100	0-20	50-100	2X	0.3	80°C
OliI (AleI)	R	0-20	0-20	0-20	100	0-20	50-100	2X	0.2	65°C
PacI	PacI	20-50	20-50	0-20	0-20	0-20	0-20	NR	0.3	65°C
PaeI (SphI)	B	100	50-100	0-20	0-20	50-100	0-20	1X	0.1	65°C
PagI (BspHI)	O	0-20	50-100	100	NR	NR	NR	NR	0.2	80°C
PasI	PasI	NR	NR	NR	NR	NR	NR	NR	0.2	80°C
PauI (BssHII)	R	0-20	0-20	100	100	0-20	100	2X	0.2	80°C
PdiI (NaeI)	Tango	50-100	20-50	0-20	0-20	100	50-100	1X or 2X	0.5	65°C
PdmI (XmnI)	Tango	20-50	50-100	0-20	0-20	100	0-20	1X	0.5	65°C
PfeI (TfiI)	O	0-20	20-50	100	50-100	20-50	50-100	1X or 2X	0.1	65°C
Pfl23II (BsiWI)	Tango	20-50	50-100	20-50	20-50	100	0-20	1X	0.3	65°C
PfoI	Tango	0-20	20-50	50-100	0-20	100	50-100	1X or 2X	0.1	65°C
Ppu21I (BsaAI)	Ppu21I	50-100*	100*	20-50	NR	NR	NR	NR	0.5	65°C
PscI (PciI)	Tango	20-50	20-50	0-20	0-20	100	0-20	1X	0.2	65°C
Psp1406I (AclI)	Tango	100	50-100	0-20	20-50	100	0-20	1X	0.5	65°C
Psp5II (PpuMI)	G	0-20	100	20-50	20-50	50-100	100	1X or 2X	0.2	80°C
PstI	O	50-100	50-100	100	100	50-100	50-100	1X or 2X	0.2	80°C (10u)
PsuI (BstYI)	B	100	20-50	0-20	0-20	50-100	0-20	1X	0.5	80°C
PsyI (Tth111I)	B	100	50-100	0-20	0-20	50-100	0-20	1X	0.1	80°C
PvuI	R	0-20	20-50	50-100	100	50-100	100	1X or 2X	0.2	80°C (10u)
PvuII	G	50-100*	100	20-50	50-100	20-50*	20-50*	1X* or 2X*	0.2	80°C
RsaI	Tango	50-100	20-50	0-20	0-20	100	0-20	1X	0.2	65°C
RseI (MslI)	R	0-20	50-100	50-100	100	20-50	100	1X or 2X	0.5	65°C
SacI	SacI	50-100	20-50	0-20	0-20	50-100	20-50	1X or 2X	0.2	65°C
SalI	O	0-20	0-20	100	20-50	0-20	50-100	2X	0.1	65°C
SatI (Fnu4HI)	G	20-50	100	20-50	20-50	50-100	20-50	1X or 2X	0.1	65°C
ScaI	ScaI	0-20	0-20	0-20	0-20	0-20	0-20	NR	0.3	80°C (10u)
SchI (MlyI)	Tango	20-50	50-100	0-20	0-20	100	0-20	1X	0.2	65°C
SdaI (SbfI)	SdaI	NR	NR	0-20	0-20	NR	20-50	2X	0.3	65°C
SduI (Bsp1286I)	SduI	NR	50-100*	0-20	0-20	NR	NR	NR	0.3	65°C
SfaAI (AsiSI)	Tango	50-100	0-20	0-20	0-20	100	0-20	1X	0.2	80°C
SfiI	G	50-100	100	20-50	0-20	100	0-20	1X	0.2	80°C
SgeI	SgeI	0-20	0-20	0-20	NR	NR	NR	NR	0	65°C
SgrDI	R	0-20	0-20	0-20	100	NR	100	2X	0.3	65°C
SgsI (AscI)	Tango	0-20	0-20	0-20	50-100	100	50-100	1X or 2X	0.1	65°C
SmaI	Tango	50-100	0-20	0-20	0-20	100	0-20	1X	0.2	65°C
SmiI (SwaI)	O	0-20	0-20	100	20-50	0-20	20-50	2X	0.1	65°C
SmoI (SmlI)	Tango	50-100	20-50	0-20	20-50	100	20-50	1X or 2X	0.2	80°C
SsiI (AciI)	O	NR	20-50	100	50-100	NR	100	2X	0.5	65°C
SspDI (KasI)	Tango	20-50	0-20	NR	0-20	100	20-50	1X or 2X	1	80°C
SspI	G	20-50	100	0-20	50-100	100	20-50	1X or 2X	0.1	65°C
TaaI (HpyCH4III)	Tango	0-20	0-20	0-20	50-100	100	100	1X or 2X	0.2	No
TaiI (MaeII)	R	50-100	50-100	20-50	100	100	50-100	1X or 2X	0.3	No
TaqI	TaqI	0-20	20-50	20-50	20-50	20-50	20-50	1X or 2X	0.3	No
TasI (Tsp509I)	B	100	50-100	20-50	0-20	20-50	0-20	1X	0.3	No
TatI	Tango	NR	50-100*	0-20	20-50	100*	0-20	1X*	0.2	No
TauI	B	100	50-100	0-20	0-20	20-50	0-20	1X	0.9	No
Tru1I (MseI)	R	50-100	50-100	20-50	100	50-100	100	1X or 2X	0.2	No
TscAI (TspRI)	Tango	50-100	50-100	20-50	20-50	100	20-50	1X or 2X	0.2	No
Van91I (PflMI)	R	0-20	50-100	50-100	100	20-50	50-100	1X or 2X	0.1	65°C
VspI (AseI)	O	0-20	50-100	100	20-50	100	100	1X or 2X	0.1	65°C
XagI (EcoNI)	R	0-20	20-50	50-100	100	20-50	50-100	1X or 2X	0.1	65°C
XapI (ApoI)	Tango	50-100	100	0-20	0-20	100	20-50	1X or 2X	0.1	65°C
XbaI	Tango	50-100	50-100	20-50	0-20	100	50-100	1X or 2X	0.1	65°C
XceI (NspI)	Tango	50-100	0-20	0-20	0-20	100	0-20	1X	0.2	65°C
XhoI	R	0-20	50-100	50-100	100	20-50	100	1X or 2X	0.1	80°C
XmaJI (AvrII)	Tango	20-50	50-100	50-100	50-100	100	50-100	1X or 2X	0.2	80°C
XmiI (AccI)	B	100	0-20	0-20	0-20	50-100	20-50	1X or 2X	0.1	65°C

11. FastDigest 快速内切酶反应条件

Thermo Scientific FastDigest enzyme	Reaction temperature	Digestion time with 1 µL of FastDigest enzyme, min				bp from end of DNA required for complete digestion	Thermal inactivation	Incubation time (in hours) without star activity
Thermo Scientific FastDigest enzyme	Reaction temperature	Lambda, 1 µg/20 µL	Plasmid DNA, 1 µg/20 µL	PCR product, ~0.2 µg/30 µL	Genomic DNA, 1 µg/10 µL	bp from end of DNA required for complete digestion	Thermal inactivation	Incubation time (in hours) without star activity
FastDigest (pUC19 DNA/SmaI)AatII（FD0994）	37°C	15	20	15	15	5	80°C, 5 min	16
FastDigest AanI(FD2064)	37°C	5	5	5	5	5	65°C, 5 min	16
FastDigest AasI	37°C	5	5	5	5	1	80°C, 10 min	1
FastDigest Acc65I	37°C	5	5	5	5	3	65°C, 5 min	16
FastDigest AdeI	37°C	5	5	5	5	2	80°C, 5 min	1
FastDigest AjuI(phiX174 DNA)	37°C	5	5	10	5	nd	65°C, 5 min	16
FastDigest AluI	37°C	15	15	15	15	4	65°C, 5 min	16
FastDigest Alw21I	37°C	5	5	5	5	1	80°C, 20 min	16
FastDigest Alw26I	37°C	5	5	5	5	1	65°C, 5 min	16
FastDigest Alw44I	37°C	5	60	10	5	4	80°C, 5 min	16
FastDigest ApaI	37°C	5	5	20	10	2	65°C, 5 min	16
FastDigest BamHI	37°C	5	5	5	5	2	80°C, 5 min	1
FastDigest BclI	37°C	5	5	15	5	3	80°C, 20 min	16
FastDigest BcnI	37°C	5	5	5	5	3	80°C, 20 min	16
FastDigest BcuI(pUC19-SpeI DNA/Psp1406I, 5 min)	37°C	no sites	5	5	5	1	No (chloroform extraction)	16
FastDigest BfmI	37°C	5	5	5	5	2	65°C, 20 min	16
FastDigest BfoI	37°C	5	5	5	5	2	65°C, 10 min	16
FastDigest BglI	37°C	5	5	5	5	3	65°C, 5 min	2
FastDigest BglII	37°C	5	20	30	20	3	No (chloroform extraction)	16
FastDigest Bme1390I	37°C	5	5	5	5	4	No (chloroform extraction)	16
FastDigest BmsI	37°C	5	5	5	5	1	65°C, 5 min	16
FastDigest BoxI	37°C	5	5	5	5	3	80°C, 20 min	16
FastDigest BpiI	37°C	5	5	5	5	1	65°C, 10 min	16
FastDigest BplI(lambda DNA/XhoI)	37°C	15	20	30	30	nd	65°C, 5 min	16
FastDigest Bpu10I(M13mp18 DNA)	37°C	15	15	30	15	3	80°C, 5 min	1
FastDigest Bpu1102I	37°C	5	5	5	5	2	80°C, 5 min	16
FastDigest BseDI	37°C	5	5	5	5	3	80°C, 5 min	16
FastDigest BseGI	37°C	5	5	5	5	2	80°C, 5 min	16
FastDigest BseJI	65°C	5	5	5	5	2	No (chloroform extraction)	1
FastDigest BseLI	37°C	5	5	5	5	2	No (chloroform extraction)	16
FastDigest BseMI	37°C	15	15	15	15	3	80°C, 5 min	16
FastDigest BseMII	55°C	15	30	15	15	2	80°C, 5 min	16
FastDigest BseNI	65°C	5	5	5	5	2	80°C, 5 min	16
FastDigest BseSI	37°C	5	5	5	30	3	80°C, 15 min	16
FastDigest BseXI	65°C	15
(pBR322 DNA)	15	15	15	3	80°C, 15 min	16
FastDigest Bsh1236I	37°C	5	5	5	5	1	80°C, 10 min	16
FastDigest Bsh1285I	37°C	15	15	15	15	3	80°C, 15 min	1
FastDigest BshNI	37°C	5	60	5	15	2	65°C, 10 min	16
FastDigest BshTI	37°C	5	5	5	5	3	80°C, 5 min	16
FastDigest Bsp119I	37°C	5	5	5	5	1	80°C, 5 min	16
FastDigest Bsp120I	37°C	5	5	15	5	3	80°C, 10 min	16
FastDigest Bsp1407I	37°C	5	5	5	5	3	65°C, 10 min	16
FastDigest Bsp143I	37°C	5	5	10	5	4	65°C, 20 min	16
FastDigest BspLI	37°C	5	5	5	5	2	65°C, 20 min	16
FastDigest BspOI	37°C	5	5	15	5	3	80°C, 5 min	1
FastDigest BspTI	37°C	5	5	5	5	4	No (chloroform extraction)	16
FastDigest Bst1107I	37°C	5	5	5	10	3	No (chloroform extraction)	6
FastDigest BstXI	37°C	5	5	5	5	4	80°C, 5 min	1
FastDigest Bsu15I	37°C	5	5	5	5	2	65°C, 5 min	16
FastDigest BsuRI	37°C	5	5	5	5	3	No (chloroform extraction)	16
FastDigest BveI	37°C	15	15	60	20	5	65°C, 5 min	16
FastDigest CaiI	37°C	5	5	5	5	4	65°C, 10 min	16
FastDigest Cfr10I	37°C	5	5	10	5	2	No (chloroform extraction)	2
FastDigest Cfr13I	37°C	5	5	5	5	2	No (chloroform extraction)	16
FastDigest CpoI	37°C	5	5	5	5	1	65°C, 5 min	16
FastDigest CseI(pBR322 DNA)	37°C	15	15	30	15	2	80°C, 5 min	16
FastDigest CsiI	37°C	5	10	5	15	4	65°C, 5 min	16
FastDigest Csp6I	37°C	5	5	5	5	2	80°C, 10 min	16
FastDigest DpnI(pBR322 DNA)	37°C	5	5	not applicable	10	1	80°C, 5 min	16
FastDigest DraI	37°C	5	5	5	5	4	65°C, 5 min	16
FastDigest Eam1104I(phiX174 DNA)	37°C	5	5	5	5	3	80°C, 5 min	6
FastDigest Eam1105I	37°C	5	5	5	5	3	65°C, 5 min	16
FastDigest Ecl136II	37°C	5	5	5	5	1	65°C, 5 min	6
FastDigest Eco105I	37°C	5	5	5	5	3	65°C, 5 min	16
FastDigest Eco130I	37°C	5	5	20	20	3	65°C, 5 min	16
FastDigest Eco147I	37°C	5	5	5	5	3	80°C, 10 min	16
FastDigest Eco31I	37°C	5	5	5	5	3	65°C, 5 min	16
FastDigest Eco32I	37°C	5	5	5	5	2	No (chloroform extraction)	16
FastDigest Eco47I	37°C	5	5	5	5	1	80°C, 20 min	16
FastDigest Eco47III	37°C	5	5	5	5	4	65°C, 5 min	16
FastDigest Eco52I	37°C	5	20	20	5	3	65°C, 5 min	16
FastDigest Eco57I	37°C	15	30	15	15	2	65°C, 5 min	16
FastDigest Eco72I	37°C	5	5	5	5	2	80°C, 10 min	1
FastDigest Eco81I	37°C	5	5	5	5	2	80°C, 10 min	16
FastDigest Eco88I	37°C	5	5	5	5	2	65°C, 5 min	16
FastDigest Eco91I	37°C	5	5	5	5	2	65°C, 10 min	2
FastDigest EcoO109I	37°C	5	10	15	5	2	65°C, 5 min	16
FastDigest EcoRI	37°C	5	5	20	5	2	80°C, 5min	0.5
FastDigest EheI	37°C	5	5	5	5	2	65°C, 5 min	6
FastDigest Esp3I	37°C	5	5	5	5	1	65°C, 10 min	6
FastDigest FaqI	37°C	15	30	15	15	3	65°C, 5 min	16
FastDigest FokI	37°C	5	5	5	5	1	65°C, 5 min	1
FastDigest FspAI	37°C	5	5	5	5	4	65°C, 5 min	16
FastDigest FspBI	37°C	5	15	5	20	3	80°C, 5 min	16
FastDigest GsuI	30°C	15	30	15	15	2	65°C, 5 min	16
FastDigest HhaI	37°C	5	5	5	5	1	No (chloroform extraction)	16
FastDigest Hin1I	37°C	5	5	5	5	1	65°C, 5 min	16
FastDigest Hin1II	37°C	5	10	5	10	4	80°C, 5 min	16
FastDigest Hin6I	37°C	5	10	5	5	2	80°C, 10 min	16
FastDigest HincII	37°C	5	5	5	10	1	65°C, 5 min	16
FastDigest HindIII	37°C	5	5	20	10	3	80°C, 10 min	16
FastDigest HinfI	37°C	5	5	5	5	2	65°C, 20 min	16
FastDigest HpaII	37°C	5	5	5	5	3	65°C, 5 min	16
FastDigest Hpy8I	37°C	5	5	5	10	2	80°C, 5 min	16
FastDigest HpyF10VI	37°C	5	5	5	5	2	80°C, 5 min	16
FastDigest HpyF3I	37°C	5	5	5	10	3	65°C, 5 min	16
FastDigest KflI(pJET1-SanDI DNA/BamHI)	37°C	5	5	5	10	5	No (chloroform extraction)	16
FastDigest Kpn2I	37°C	5	5	5	5	2	80°C, 5 min	16
FastDigest KpnI	37°C	5	5	5	5	3	80°C, 5 min	16
FastDigest KspAI	37°C	5	5	5	5	3	65°C, 20 min	0.5
FastDigest LguI	37°C	5	5	5	5	2	65°C, 5 min	16
FastDigest Lsp1109I(pBR322 DNA)	37°C	5	5	5	10	2	65°C, 5 min	1
FastDigest MauBI(pJET1-MauBI DNA/BamHI, 5 min)	37°C	no sites	5	10	5	5	65°C, 5 min	16
FastDigest MbiI	37°C	5	5	5	5	3	65°C, 5 min	16
FastDigest MboI	37°C	5	5	5	10	1	65°C, 15 min	16
FastDigest MboII	37°C	5	5	5	5	2	65°C, 5 min	16
FastDigest MlsI	37°C	5	5	30	20	3	80°C, 20 min	16
FastDigest MluI	37°C	5	5	5	15	3	80°C, 5 min	16
FastDigest MnlI	37°C	5	5	5	5	2	65°C, 5 min	16
FastDigest Mph1103I	37°C	5	5	5	10	3	65°C, 15 min	6
FastDigest MreI(pJET1-MreI DNA/Eam1105I, 5 min)	37°C	no sites	5	5	5	3	80°C, 5 min	16
FastDigest MspI	37°C	5	5	5	5	3	No (chloroform extraction)	16
FastDigest MssI	37°C	5	5	5	5	2	65°C, 10 min	16
FastDigest MunI	37°C	5	5	5	5	3	No (chloroform extraction)	16
FastDigest Mva1269I	37°C	5	5	5	5	3	65°C, 5 min	16
FastDigest MvaI	37°C	5	5	5	10	4	No (chloroform extraction)	1
FastDigest NcoI	37°C	5	10	10	5	3	65°C, 15 min	16
FastDigest NdeI	37°C	5	5	60	30	3	65°C, 5 min	6
FastDigest NheI	37°C	5	15	5	5	5	65°C, 5 min	6
FastDigest NmuCI	37°C	5	5	5	10	2	65°C, 5 min	16
FastDigest NotI(pTZ19RJL2 DNA/BseLI, 5 min)	37°C	no sites	30	5	10	2	80°C, 5 min	16
FastDigest NsbI	37°C	5	5	5	5	3	65°C, 15 min	16
FastDigest OliI(phiX174 DNA)	37°C	5	5	10	5	3	65°C, 5 min	6
FastDigest PacI(pJET1-PacI DNA/SdaI, 5 min)	37°C	no sites	5	5	5	2	65°C, 10 min	16
FastDigest PaeI	37°C	5	5	5	5	5	65°C, 5 min	16
FastDigest PagI(phiX174 DNA)	37°C	5	10	5	10	3	80°C, 5 min	0.5
FastDigest PdiI(pBR322 DNA/NdeI)	37°C	5	5	5	5	4	65°C, 15 min	16
FastDigest PdmI	37°C	5	5	5	5	2	65°C, 5 min	16
FastDigest PfeI	37°C	5	5	10	5	2	65°C, 5 min	16
FastDigest Pfl23II	37°C	15	15	15	15	3	65°C, 5 min	16
FastDigest PfoI	37°C	5	5	5	5	3	65°C, 5 min	16
FastDigest Ppu21I	37°C	5	5	5	5	1	65°C, 5 min	16
FastDigest PsyI	37°C	5	5	5	5	2	80°C, 5 min	4
FastDigest Psp1406I	37°C	5	5	5	5	3	65°C, 5 min	16
FastDigest Psp5II	37°C	5	5	5	20	2	80°C, 5 min	6
FastDigest PspFI	37°C	5	5	5	5	4	80°C, 5 min	16
FastDigest PstI	37°C	5	5	30	5	3	No (chloroform extraction)	16
FastDigest PsuI	37°C	5	5	5	5	2	80°C, 5 min	16
FastDigest PteI	37°C	5	5	5	5	3	80°C, 5 min	16
FastDigest PvuI	37°C	5	15	5	5	4	80°C, 5 min	16
FastDigest PvuII	37°C	5	5	5	5	1	No (chloroform extraction)	0.5
FastDigest RruI	37°C	5	5	5	5	5	No (chloroform extraction)	4
FastDigest RsaI	37°C	5	5	5	5	3	No (chloroform extraction)	16
FastDigest RseI	37°C	5	5	5	5	4	65°C, 20 min	16
FastDigest SacI	37°C	5	15	30	10	1	65°C, 5 min	16
FastDigest SalI	37°C	5	5	60	5	3	65°C, 10 min	16
FastDigest SaqAI(pBR322 DNA)	37°C	5	5	5	5	4	65°C, 5 min	1
FastDigest SatI	37°C	5	5	10	5	3	65°C, 5 min	16
FastDigest ScaI	37°C	5	5	5	5	4	65°C, 10 min	16
FastDigest SchI	37°C	5	5	30	5	2	80°C, 5 min	1
FastDigest SdaI	37°C	5	5	5	5	3	No (chloroform extraction)	1
FastDigest SduI	37°C	5	5	5	5	2	80°C, 15 min	1
FastDigest SfaAI(pJET1-AsiSI DNA/SdaI, 5 min)	37°C	no sites	5	60	5	5	80°C, 5 min	16
FastDigest SfiI(pUC19-SfiI DNA, 15 min)	50°C	no sites	15	15	15	5	No (chloroform extraction)	16
FastDigest SgsI	37°C	5	5	5	5	2	65°C, 20 min	16
FastDigest SmaI	37°C	5	5	5	5	1	65°C, 5 min	16
FastDigest SmiI(M13mp18 DNA/MvaI, 5 min)	37°C	no sites	20	30	30	2	65°C, 15 min	1
FastDigest SsiI	37°C	5	5	5	5	2	65°C, 5 min	4
FastDigest SspI	37°C	5	5	5	30	2	65°C, 5 min	1
FastDigest TaaI	65°C	5	5	5	5	3	No (chloroform extraction)	16
FastDigest TaiI	65°C	5	5	5	5	2	No (chloroform extraction)	16
FastDigest TaqI	65°C	5	5	5	5	4	No (chloroform extraction)	16
FastDigest TasI(pBR322 DNA)	65°C	5	5	5	5	3	No (chloroform extraction)	6
FastDigest TatI	65°C	15	15	15	20	5	No (chloroform extraction)	1
FastDigest TauI	55°C	15	60	15	30	3	No (chloroform extraction)	16
FastDigest Tru1I	65°C	5	5	5	10	3	No (chloroform extraction)	2
FastDigest TscAI	65°C	5	5	5	5	2	No (chloroform extraction)	6
FastDigest Van91I	37°C	5	5	5	5	3	65°C, 10 min	6
FastDigest VspI	37°C	5	5	5	30	2	65°C, 5 min	16
FastDigest XagI	37°C	5	5	5	20	2	65°C, 5 min	16
FastDigest XapI	37°C	5	5	5	10	4	80°C, 5 min	16
FastDigest XbaI	37°C	5	5	5	10	2	65°C, 20 min	16
FastDigest XceI	37°C	5	5	5	5	2	65°C, 5 min	16
FastDigest XhoI	37°C	5	5	5	10	2	80°C, 5 min	16
FastDigest XmaJI	37°C	5	10	5	10	2	No (chloroform extraction)	16
FastDigest XmiI	37°C	5	5	60	5	2	65°C, 5 min	16

12. 工具酶总览

DNA聚合酶	RNA聚合酶	核糖核酸酶	脱氧核糖核酸酶
• DNA Polymerase I (#EP0041) • Klenow Fragment (#EP0051/EP0054) • Klenow Fragment, exo- (#EP0421/EP0422) • T4 DNA Polymerase(#EP0061) • T7 DNA Polymerase(#EP0081) • phi29 DNA Polymerase (#EP0091) • EquiPhi29 DNA Polymerase (#A39390) • Bsm DNA Polymerase (#EP0691)	• T7 RNA Polymerase(#EP0111) • T3 RNA Polymerase (#EP0101/EP0103) • SP6 RNA Polymerase (#EP0131/EP0133)	• RNase A, DNase and protease-free (#EN0531) • RNase T1 (#EN0541) • RNase A/T1 Mix (#EN0551) • RNase I (#EN0601) • RNase H (#EN0201) RNase A，不含DNase和蛋白酶，10 mg/mL, 10mg（#FB02516001） RNase H(#FB02517050/FB02517010)	• DNase I, RNase-free (#EN0521) • dsDNase (#EN0771) • Endonuclease IV, E. coli (Endo IV) (#EN0591) • Endonuclease V, T. maritima (Endo V) (#EN0141) • Exonuclease I (Exo I) (#EN0581/EN0582) • Exonuclease III (Exo III) (#EN0191) • Lambda Exonuclease(#EN0561) DNase, 50 次反应（#FB02515005） DNase I，不含 RNase，1 U/µL, 1000 单位（#FB02514100）
限制性内切酶	磷酸酶 & 磷酸激	连接酶	其它
• FastDigest Restriction Enzymes • Conventional Restriction Enzymes	• FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase(#EF0651/EF0652/EF0654) • T4 Polynucleotide Kinase (T4 PNK)(#EK0031/EK0032) T4多聚核苷酸激酶，10 U/µL, 2500 单位（#FB02504250） T4多聚核苷酸激酶，10 U/µL, 500 单位（#FB02504050）热敏碱性磷酸酶（#FB02500100/FB02500105）	• T4 DNA Ligase (#EL0011/EL0013/EL0016) • T4 RNA Ligase (#EL0021) T4 DNA连接酶，5 U/µL, 1,000 单位（#FB02503100） E. Coli DNA 连接酶, 400 单位（#FB02501040） DNA 连接试剂盒（#FB02502005/FB02502015）	• RiboLock RNase Inhibitor (#EO0381) • Proteinase K (recombinant), PCR grade (#EO0491/EO0492) • Pyrophosphatase, inorganic (#EF0221) • Uracil DNA Glycosylase (#EN0361) • S1 Nuclease (#EN0321) • Micrococcal Nuclease(#EN0181) RNase 抑制剂, 2500 单位（#FB02518250/ FB02518254）

13. 等温扩增及其应用

等温核酸扩增（等温扩增）及其应用领域

等温扩增比较
等温扩增 - 核酸序列依赖扩增NASBA
1. 原理： NASBA技术是检测RNA的等温扩增方法，通常在42 ℃左右进行，需要逆转录酶Maxima H Minus Reverse Transcriptase (200 U/µL)（#EP0751/EP0752/EP0753）、RNA酶H（#EN0201/EN0202）、T7 RNA聚合酶（#EP0111/EP011）和一对引物来完成。其正向引物包含T7启动子互补序列。反应过程中正向引物与RNA链结合，由逆转录酶催化形成DNA-RNA双链；RNA酶H消化杂交双链中的RNA,保留DNA单链；在反向引物与逆转录酶的作用下形成含有T7启动子序列的DNA双链；在T7 RNA聚合酶的作用下完成转录过程，产生大量目的RNA。 2．特点： NASBA的优点在于产物是单链RNA，不易造成遗留污染；由于转录过程产生大量RNA，具有更高的灵敏度；将反转录和扩增反应一步完成，适用于RNA样品的分析，缺点是需用RNA酶抑制剂防止RNA降解。
	核酸序列依赖扩增 (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification , NASBA) • 以RNA为模板进行等温扩增并能实时观测结果的检测方法 • 反应分两步：非循环和循环扩增 • 通过分子信标探针检测扩增得到的RNA产物 • 广泛应用于细菌、病毒等多种病原微生物的检测 NASBA的优势： • 反转录和扩增在同一反应管中进行 • 灵敏——扩增产物可高达109拷贝 • 低成本谁会进行NASBA？ • 对感染性疾病进行病毒检测和监测的科研人员 • 目前使用PCR方法进行病毒检测的科研人员 • 进行现场核酸检测的科研、工业、POC客户
等温扩增 – 多重置换扩增MDA/WGA
多重置换扩增(Multiple dilacement amplification, MDA)是1998年由耶鲁大学Lizardi博士首次提出。这种恒温扩增的方法依赖于链置换扩增原理，利用噬菌体中phi29DNA聚合酶（#EP0091/EP0092/EP009），高度扩增DNA。该酶对于模板有很强的模板结合能力，能连续扩增100Kb的DNA模板而不从模板上解离。同时这种酶具有3’-5"外切酶活性，错误率仅为5x10^-6，大约比Taq DNA聚合酶低100倍，因此可以保证扩增的高保真性。
	多重置换扩增（Multiple Displacement Amplification, MDA) • MDA是最常用的全基因组扩增（Whole Genome Amplification, WGA）方法 • 利用Phi29 DNA聚合酶（#EP0091/EP0092/EP009）的链置换活性，在恒温下进行基因组 DNA的扩增 MDA的优势： • 扩增能力强，高保真扩增 • 产量高，使用极少量的DNA样本便可获得大量扩增产物，且扩增片段长谁会进行MDA？ • 进行单细胞研究的客户，如单细胞全基因组测序
等温扩增 - RCA
1．原理： RCA借鉴了自然界中环状DNA复制方式。所需酶为phi29DNA聚合酶（#EP0091/EP0092/EP009），在37 ℃左右进行。普通RCA的过程为：引物与环状DNA模板结合后延伸，生成含有大量目的基因的DNA单链。在此基础上还发展出了多种改进技术，如多位点同时进行扩增的多引物RCA、使用两条引物提高扩增效率的指数RCA。 2．特点： RCA的优点有：扩增效率高；种类多，应用广；产物为单链DNA，能与探针直接结合实现信号放大。局限性在于所需模板为环状DNA。
	滚环扩增（Rolling Circle Amplification, RCA) • 以环状 DNA为模板，通过一个短的DNA引物（与部分环状模板互补），在phi29 DNA 聚合酶催（#EP0091/EP0092/EP009）化下合成长重复单链DNA。 • RCA检测模板需为单链环状结构，如果是线性DNA，需经过环化处理； RCA的优势： • 不仅可以直接扩增 DNA 和 RNA，还可以通过指数扩增实现对靶核酸的信号放大 • 灵敏度达到一个拷贝的核酸分子谁会进行MDA？ • 细胞原位检测、SNP检测，蛋白质分析、免疫芯片、全基因组扩增、DNA生物传感器
等温扩增 – LAMP/RT-LAMP
1．原理： 2000年，日本学者Notomi等报道了LAMP技术。LAMP在60~65 ℃条件下进行，需要4条引物和具有链置换功能的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶(DNA polymerase of Bacillus stearothermophilus，BstDNA聚合酶)（#EP0691）。外引物与PCR引物类似，而内引物则含有两段序列。过程如下：（1）内引物结合目的基因，在BstDNA聚合酶的作用下延伸为双链。外引物与双链DNA的5′端结合，在一端形成环状结构。另一端经过同样过程，形成两端为环的哑铃状结构。（2）哑铃状结构的单链DNA具有模板与引物的双重功能，在Bst聚合酶（#EP0691）的催化下即能延伸。（3）内引物也能与环状结构结合，在酶的作用下进行延伸。 2．特点： LAMP的优点为特异性和灵敏度高；扩增产物可通过电泳、电化学传感器、横向流动试纸条等方法判定结果。局限性在于引物设计繁琐，易出现非特异性扩增，可通过标准化引物和调整缓冲液浓度克服此缺点。
	环介导等温扩增（ Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) • LAMP是一种在恒温下进行快速、简单和特异性的DNA扩增方法，利用 Bst/Bsm DNA聚合酶（#EP0691）的强链置换活性 • RT-LAMP包含反转录步骤，从RNA中合成cDNA模板 LAMP的优势： • 不需要昂贵的仪器，成本低 • 检测流程快速（15-60分钟）、简单 • 耐受抑制剂，对样本质量要求不高 • 多种结果验证方法（浊度法、比色法、凝胶电泳法，实时定量法）谁会进行LAMP？ • 病原体检测 • 食品和水质安全检测 • 癌症研究和诊断
等温扩增应用酶
名称	货号	等温扩增技术
名称	货号	NASBA	MDA	RCA	LAMP
T7 RNA Polymerase (20 U/µL	EP0111/EP011	√
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL)	EO0381/EO0382/EO0384	√			√
RNase H (5 U/µL)	EN0201/EN0202	√
Phi29 DNA Polymeras	EP0091/EP0092/EP009		√	√
EquiPhi29™ DNA Polymerase	A39390/A30391/A30392		√	√
Exo-Resistant Random Primer	SO181		√
Maxima H Minus Reverse Transcriptase (200 U/µL)	EP0751/EP0752/EP0753	√			√
T4 DNA Ligase (5 U/µL)	EL0011/EL001			√
Bsm DNA Polymerase, large fragment	EP0691				√

14. 酶活定义

	传统酶活单位定义	新型酶活单位定义 (基于反应次数)
定义	1 unit的酶在经优化的缓冲液中60分钟内酶切 1 µg的 lambda DNA	1 µL的酶在统一缓冲液中在推荐的时间内酶切 1 µg的底物DNA
反应条件	传统反应条件	新型酶活单位在推荐的反应条件下可完全酶切所有类型的DNA
备注	为了克服DNA来源、样本量或样本纯度引起的变异，通常推荐加入5- 10倍的酶量	酶按照µL体积或者反应次数
酶切翻案

文章目录

分子生物学

1. 样本制备及PCR选择指南

2. DNA聚合酶及常规PCR

3. 热启动PCR以及热启动DNA聚合酶

特点

应用

产品组成

特点

应用

产品组成

4. 高保真PCR

5. 直接PCR

6. 逆转录酶

7. 操作方法和使用推荐

8. 疑难解答指南

9. qPCR 引物集锦

10. 限制性内切酶反应条件

11. FastDigest 快速内切酶反应条件

12. 工具酶总览

13. 等温扩增及其应用

14. 酶活定义