利用荧光结合抗体标记细胞表面标记物，进行流式细胞分析后，可以根据细胞谱系和发育阶段确定细胞亚群及其功能。这些表面标记物具有不同的形式和功能，包括可溶性和细胞结合位点的受体，离子通道、糖蛋白、磷脂等。例如，CD4就是一种辅助性T细胞的表面标记物，而且可以根据其它趋化因子受体和分化抗原簇（CD）的表达进一步区分出CD4 T细胞不同的细胞亚群。被抗体染色的活细胞可以根据其独特的表型进行分选，用于其它实验。

一般注意事项 为使荧光结合抗体性能达到最佳，应在2-8°C避光保存，切勿冷冻。 使用之前应快速离心抗体瓶，确保抗体在管底部，不建议涡旋抗体瓶。 除抗体说明中明确指出以外，全部染色均在冰块或2-8°C下完成，且尽量避光。 如果用荧光结合抗体染色后需要短暂贮存样本，可以将样本贮存在IC固定液(# 00-8222)中。方法是将100 μL样本加入100 μL IC固定液或者2 mL一步法固定/裂解液(#00-5333)。样本可以在这两种溶液中2-8°C避光保存3天。 注：当使用IC固定液 (#00-8222)或一步法固定/裂解液(#00-5333)贮藏样本时，其对偶联染料（如APC-eFluor 780或PE-Cy7）的亮度或能量共振转移（FRET）的效率以及荧光补偿的影响很小。固定液的质量差别可影响荧光染料亮度或FRET效率。尽管我们能得出固定后荧光染料性能的一些普遍规律，但固定可能对某些隆号的抗体染色产生一定影响。 注：建议在固定样本前用细胞活性染料（FVD）染色，这样可以在流式细胞分析的过程中为活细胞设门。

细胞表面蛋白染色 - 方案A：单细胞悬液样本

 

试剂耗材：

& 12 x 75 mm流式管，或96孔U形或V形底微孔板

& 一抗（直标或纯化抗体）

& 二级试剂（用于间接染色）

& FcR封闭剂：纯化抗小鼠CD16/CD32(# AM1016010)或纯化人Fc受体结合抑制剂(#AH1016010)

& 流式细胞染色缓冲液(#222026)

& [可选] 细胞活性染料：

- 7-AAD活性染料(#00-6993)

- 碘化丙啶PI染料(#00-6990),

- 可固定的活性染料（FVD）eFluor® 455UV (#65-0868), eFluor® 450 (#65-0863), eFluor® 506 (#65-0866), eFluor® 520 (#65-0867), eFluor® 660 (#65-0864), eFluor® 780 (#65-0865)

 

实验步骤

 

注：抗体结合动力学与温度有关。在冰上染色所需孵育时间较长。而且，一些抗体需要用到非标准方式孵育会在说明书上描述。

1. 制备单细胞悬液。

2. [可选]阻止Fc受体介导的非特异性结合：

小鼠细胞：染色前，每100 μL细胞标本加入2-5 uL抗小鼠CD16/CD32纯化抗体，在2-25°C温度下预先孵育细胞10-20分钟。

人细胞：染色前，每100 μL细胞标本加入5 uL人Fc受体结合抑制剂，在2-25°C温度下预先孵育细胞10-20分钟。

3. 每管或每孔加入50 μL细胞悬液（10⁵-10⁸细胞）。

4. 将每种抗体按照推荐使用量混合于流式染色缓冲液中，使染色液的终体积达到100 μL(例如，50 μL细胞加入50 μL抗体混合液)，轻轻涡旋以混合均匀。

注：纯化或生物素结合的一级抗体直接至第8步。

5. 2-8°C或冰上避光孵育至少30分钟。

6. 加入流式细胞染色缓冲液洗涤细胞。每支流式管加入2 mL，或微量孔板的每个微孔加入200 μL。室温400-600xg离心5分钟。弃上清。

7. 重复第6步。

注：如果所有抗体为荧光直标，则直接至第14步。

8. 在2-8°C或冰上孵育60分钟。

9. 加入流式细胞染色缓冲液洗涤细胞。每支流式管加入2 mL，或微量孔板的每个微孔加入200 μL。室温400-600xg离心5分钟，弃上清。

10. 重复第9步。

11. 使用100 μL流式细胞染色缓冲液稀释适量的荧光染料标记二抗，然后加入细胞。2-8°C或冰上避光孵育至少30分钟。

12. 加入流式细胞染色缓冲液洗涤细胞。每管加入2 mL，或微量孔板的每个微孔加入200 μL。室温400-600xg离心5分钟，弃上清。

13. 重复第12步。

14. [可选]依照相应的“细胞活性染料方案”，对细胞染色以区分死活细胞。

15. [可选]对于分析之前贮藏的样本，可以100 μL流式细胞染色缓冲液中重悬细胞，加入100 μL IC固定液或2 mL一步法固定/裂解液。

注: 细胞可以在2-8°C避光保存3天。

16. 在适量的流式细胞染色缓冲液中重悬细胞。

17. 使用流式细胞仪分析样本。

 

细胞表面蛋白染色 - 方案B：人全血裂解样本

 

利用荧光结合抗体染色全血之后，10X红细胞裂解液（多物种）或一步法固定/裂解液（10X）均能用来裂解红细胞。另外，一步法固定/裂解液（10X）可以在裂解红细胞的同时固定白细胞。如果在染色前用一步法固定/裂解液裂解全血细胞，则确定染色的抗体能识别出感兴趣抗原上的被固定过的表位。关于固定/破膜对不同抗体克隆的影响，联系010-57438396。

 

试剂和耗材

 

& 10X红细胞裂解液（多物种） (# 00-4300)或一步法固定/裂解液（10X） (#00-5333)

注：使用之前，必须将10X红细胞裂解液（多物种）和一步法固定/裂解液（10X）稀释为1X。方法是取1体积的缓冲液，加入9体积室温的试剂级水。

& 12 x 75 mm流式管

& 一抗（荧光直接结合或纯化）

& 二级试剂（用于间接染色）

& FcR封闭剂：纯化的人Fc受体结合抑制剂 (#AH1016010)

& 流式细胞染色缓冲液(#222026)

&  [可选]细胞活性染料：

- 7-AAD活性染料(#00-6993)

- 碘化丙啶PI染料(#00-6990),

- 可固定的活性染料（FVD）eFluor® 455UV (#65-0868), eFluor® 450 (#65-0863), eFluor® 506 (#65-0866), eFluor® 520 (#65-0867), eFluor® 660 (#65-0864), eFluor® 780 (#65-0865)

 

实验步骤

 

注：抗体结合动力学与温度有关。在冰上染色所需孵育时间较长。而且，一些抗体需要用到非标准方式孵育会在说明书上描述。

1. 每管加入100 μL全血。

2. [可选]每100 μL全血加入5 μL纯化的人Fc受体结合抑制剂，阻断非特异性Fc受体介导的非特异性结合。2-8°C室温孵育10-20分钟。

3. 将每种抗体按照推荐使用量混合于流式染色缓冲液中，使最终染料的体积为50 μL，并加入细胞。脉冲式轻轻地涡旋混匀。

4. 室温避光孵育20-30分钟。

注：如果所有抗体都是荧光直标抗体，则直接至第7步。

对于纯化或者生物素标记抗体：

5. 加入2 mL流式细胞染色缓冲液洗涤细胞。室温400-600xg离心5分钟。弃上清。

6. 使用100 μL流式细胞染色缓冲液稀释适量的荧光标记二级试剂，然后加入细胞。2-8°C或冰上避光孵育15-30分钟。

7. 不要洗涤细胞，加入2 mL新制备的1X红细胞裂解液并轻轻涡旋混匀。室温下孵育10-20分钟。注意避光。

注：如果使用10X红细胞裂解液（多物种）(# 00-4300)，孵育时间不能超过20分钟。

8. 室温400-600xg离心5分钟，弃上清。

9. 加入2 mL流式细胞染色缓冲液，室温400-600xg离心5分钟。弃上清。

10. 重复第9步。

11. [可选]对于用10X红细胞裂解液裂解的细胞，依照相应的“细胞活性染料方案”，染色细胞以区分死活细胞。

注：活性染料（例如：碘化丙啶或7-AAD）不能用于使用一步法固定/裂解液裂解的细胞，因为固定会导致细胞破膜。细胞活性染料（FVD）可以在使用一步法固定/裂解液之前对全血细胞染色。

12. 在适量的流式细胞染色缓冲液中重悬染色的细胞。

13. 使用流式细胞仪分析样本。

 

红细胞裂解 使用10×红细胞裂解液（00-4300）裂解正常人外周血细胞。

 

基于免疫荧光染色，流式细胞分析方法可在单细胞水平上同时检测细胞表面抗原和细胞内抗原。在流式胞内实验中，通常细胞可以用甲醛固定，然后用破膜剂或乙醇透化，使抗体可以进入细胞内，完成胞内染色。 细胞内蛋白染色时，重要的是要考虑它们的位置。因为这可能决定了如何选择最优的操作步骤和缓冲系统。 例如，核蛋白和许多转录因子与Foxp3 /转录因子染色液组合（#00-5523）配合较好，而分泌蛋白如细胞因子和趋化因子搭配细胞内固定和破膜缓冲液组合（#88-8824）很好。 最后，有几种磷酸化的信号蛋白可能用前面提到的两种缓冲系统都不起作用，但可与固定/甲醇方案一起使用。 应根据经验确定不同缓冲系统和方案中的抗体性能。

细胞内抗原染色操作步骤 （本文介绍三种染色方案供参考）

---

操作步骤A： 两步法：细胞内（细胞质）蛋白质

操作步骤B： 一步法：细胞内（核）蛋白质

操作步骤C： 固定/甲醇的两步法 （磷酸化信号蛋白的固定染色方案）

 

一般注意事项

 

1. 为了获得荧光抗体的最佳性能，请将抗体4°C避光保存。 切勿冷冻。

2. 使用前，快速离心抗体以恢复最大体积。 不建议涡旋抗体。

3. 除非操作步骤中注明，否则所有染色操作应在冰上或在4°C下进行并尽可能避光。

4. 细胞内抗原检测所需的固定和破膜步骤可改变细胞的光散射性质，并可能增加非特异性背景染色。 在染色液中加入额外的蛋白质，如BSA或胎牛血清（FCS），可能有助于减少非特异性背景。 建议使用可固定细胞活性染料（FVD）来帮助消除分析过程中的死细胞。

 

操作步骤 A： 两步法：细胞内（细胞质）蛋白质

 

以下操作步骤允许在单细胞水平同时分析细胞表面分子和细胞内抗原。 在该操作步骤中，固定步骤之后是破膜，在细胞膜上穿孔，这需要在所有后续步骤中持续存在破膜液。 这使得抗体可以进入细胞的胞质。 因此，所有细胞内染色必须在存在破膜液的条件下进行。

该操作步骤推荐用于体外或体内活化后个体细胞中的胞浆蛋白、细胞因子或其他分泌蛋白的检测。 对于细胞因子检测来说，细胞因子产生的适当刺激条件和动力学会根据细胞类型和待测定的特定细胞因子而变化。 例如，为了刺激T细胞产生IFN-γ、TNF-α、IL-2 和IL-4，可以使用PMA（佛波醇酯，蛋白激酶C激活剂）和离子霉素（钙离子载体）的组合或抗-CD3抗体。 为了诱导单核细胞产生IL-6、IL-10或TNF-α，可以使用脂多糖（LPS）刺激。 对于细胞的体外刺激，在刺激操作步骤的最后几小时期间，必须用蛋白质转运抑制剂（例如莫能菌素或布雷菲德菌素A溶液）阻断细胞因子的分泌。 建议研究人员评估不同蛋白质转运抑制剂在其特定检测系统中的用途和功效。

对于核蛋白如转录因子的检测，请参见下面的操作步骤B： 一步法：细胞内（核）蛋白。 对于一些磷酸化的信号分子如MAPK和STAT蛋白的检测，可能优选使用下面的操作步骤C： 两步法： 固定/甲醇。

 

材料

 

& 12x75 mm圆底试管

& 可固定的活性染料（FVD）eFluor® 455UV (#65-0868), eFluor® 450 (#65-0863), eFluor® 506 (#65-0866), eFluor® 520 (#65-0867), eFluor® 660 (#65-0864), eFluor® 780 (#65-0865)

& 荧光偶联抗体

& 细胞内固定和破膜缓冲液组合（#88-8824）

& 流式细胞分析染色液（#222026）

& 细胞刺激混合剂（加上蛋白质转运抑制剂）（500X）（#00-4975）或蛋白质运输抑制剂混合剂（500X）（#00-4980）或布雷菲德菌素A溶液（#00-4506）或莫能菌素溶液（#00-4505）

 

缓冲液和溶液制备 

 

- 将1份10X浓缩液与9份蒸馏水混合，制备1X破膜液工作液。 每个样品需要8.5 mL 1X的破膜液。

 

12 x 75 mm管的实验步骤

 

1.制备单细胞悬液。

2.[可选]使用可固定化细胞活性染料对细胞进行染色。 有关详细信息，请参阅活性染料染色。

3.对细胞表面标记进行染色。 有关详细信息，请参阅细胞表面靶标染色。

4.最后一次洗涤后，弃上清并脉冲涡旋样品以完全解离细胞团块。 通常保留约100 μL残余体积。

5.添加100μL IC固定液来固定细胞，之后涡旋混合。

6.在室温下孵育20-60分钟。 避光。

7.加入2 mL 1X透化液，在室温下400-600 x g 离心5分钟。 弃上清。

8.重复第7步。

9.将细胞沉淀重悬于100μL 1X透化液中。 加入推荐量的直接偶联的一抗以检测细胞内抗原，并在室温下孵育20-60分钟。 避光。

10.加入2 mL 1X破膜液，在室温下400-600 x g离心5分钟。 弃上清。

11.重复第10步。

12.将染色细胞重悬于适当体积的流式细胞术染色液中。

13.通过流式细胞术分析样品。

 

96孔板实验步骤

 

1.制备单细胞悬液。 

2.[可选]使用可固定化细胞活性染料对细胞进行染色。 有关详细信息，请参阅活性染料染色，操作步骤C最佳操作步骤。

3.对细胞表面标记进行染色。 有关详细信息，请参阅细胞表面靶标染色，操作步骤A最佳操作步骤。

4.最后一次洗涤后，弃上清并脉冲涡旋样品以完全解离细胞团块。 通常保留约100 μL残余体积。

5.每孔添加200μL IC固定液来固定细胞。 最好使细胞完全重悬于添加的溶液中。 可选择移液。

6.在室温下孵育20-60分钟。 避光。

7.室温下400-600 x g离心样品5分钟。 弃上清。

8.每孔中加入200 μL 1X破膜液，室温下400-600 x g离心样品5分钟。 弃上清。

9.在剩余体积中重悬沉淀，用1X透化液将体积调节至约100 μL。

10.[可选]直接向细胞中加入2 μL 2％正常小鼠/大鼠血清封闭。 室温孵育15分钟。

11.不洗涤，加入推荐量的直接偶联抗体以检测细胞内抗原，并在室温下孵育30分钟以上。 避光。

12.每孔中加入200μL 1X破膜液，室温下400-600 x g离心样品5分钟。 弃上清。

13.重复第13步。

14.将染色细胞重悬于适当体积的流式细胞术染色液中。

15.通过流式细胞术分析。

 

操作步骤B： 一步法：细胞内（核）蛋白质 

 

以下操作步骤可以在单细胞水平同时分析细胞表面分子和细胞内抗原，包括核抗原。 该操作步骤将固定和破膜结合到一个步骤中。 推荐用于检测核抗原如转录因子，但也可用于检测许多细胞因子。 有关Foxp3 /转录因子染色液组合（货号00-5523-00）与细胞因子抗体的兼容性，请参阅抗体固定注意事项以得到更好的抗体克隆性能。

 

材料

 

& 12 x 75 mm圆底试管或 96孔V型或U型底微量滴定板

& [可选]可固定的活性染料（FVD）eFluor® 455UV (#65-0868), eFluor® 450 (#65-0863), eFluor® 506 (#65-0866), eFluor® 520 (#65-0867), eFluor® 660 (#65-0864), eFluor® 780 (#65-0865)

& [可选]正常小鼠血清（#号554401）

& [可选]正常大鼠血清（#555501）

& 荧光偶联抗体

& Foxp3 /转录因子固定破膜染色液组合（#00-5523）

& 流式细胞分析染色液（#222026）

 

缓冲液和溶液制备

 

- 将1份4×Foxp3固定/破膜浓缩液(#00-5123)与3份Foxp3 固定/破膜稀释剂(#00-5223)混合，制备新鲜的Foxp3固定/破膜工作液。 如果在管中染色，则每个样品需要1 mL工作液。

- 将1份10×破膜透化液（#00-8333）与9份蒸馏水混合，制备1×破膜液工作液。 如果在管中染色，则每个样品需要8.5 mL工作液。

 

12 x 75 mm管的实验步骤

 

1.制备单细胞悬液。 请参阅流式细胞细胞制备最佳操作步骤。

2.[可选]使用可固定细胞活力染料对细胞进行染色。 更多详情请见“活力染料染色”

3.对细胞表面标记进行染色。 有关详细信息，请参阅细胞表面靶标染色，操作步骤A。

4.最后一次细胞悬液洗涤后，弃上清并脉冲涡旋样品以完全解离沉淀。 通常保留约100 μL残余体积。

5.向每个管中加入1 mL Foxp3固定/破膜工作溶液并脉冲涡旋

6.2-8°C或室温孵育30-60分钟。 避光。 （小鼠样品可在 2-8°C遮光孵育长达18小时）。

7.每管加入2 mL 1×破膜工作液，在室温下400-600× g离心样品5分钟。 弃上清。

8.[可选]重复第7步。

9.在剩余体积的1×破膜液中重悬沉淀。 通常为100 μL。

10.[可选]直接向细胞中加入2 μL 2％正常小鼠/大鼠血清封闭。 在室温下孵育15分钟。

11.不洗涤，加入推荐量的荧光偶联抗体以检测细胞内抗原，并在室温下孵育30分钟以上。 避光。

12.每管加入2 mL 1×破膜液，在室温下400-600× g离心样品5分钟。 弃上清。

13.重复第12步。

14.将染色细胞重悬于适当体积的流式细胞染色液中。

注意：此时不建议将细胞储存于4℃，第二天进行流式检测。主要原因在于由于胞内蛋白已经做了固定透化，如果放入4度保存，不是马上上机，里面的内溶物会流出，造成结果的差别很大。因此固定过夜保存针对表面蛋白染色。可以在表面蛋白染色固定后，第二天胞内蛋白进行透化，直接上机。

15.通过流式细胞仪分析样品。

 

96孔板实验步骤

 

1.制备单细胞悬液。 请参阅流式细胞细胞制备最佳操作步骤。

2.[可选]使用可固定细胞活性染料对细胞进行染色。 更多详情请见“活力染料染色，操作步骤 C”

3.对细胞表面标记进行染色。 有关详细信息，请参阅细胞表面靶标染色，操作步骤A。

4.最后一次洗涤后，弃上清并脉冲涡旋样品以完全离解沉淀。

5.每孔加入200 µL Foxp3固定/破膜工作溶液。 最好使细胞完全重悬于添加的溶液中。 可选择移液。

6.2-8°C或室温孵育30-60分钟。 避光。 （小鼠样品可在 2-8°C遮光孵育长达18小时）。

7.在室温下400-600 x g 离心样品5分钟。 弃上清。

8.每孔加入200 µL 1X破膜液，在室温下400-600 x g 离心样品5分钟。 弃上清。

9.重复第8步。

10.在剩余体积中重悬沉淀，用1X破膜液将体积调节至约100 μL。

11.[可选]直接向细胞中加入2 μL 2％正常小鼠/大鼠血清封闭。 在室温下孵育15分钟。

12.不洗涤，加入推荐量的直接偶联抗体以检测细胞内抗原，并在室温下孵育30分钟以上。 避光。

13.每孔加入200 µL 1×破膜液，在室温下400-600 x g 离心样品5分钟。 弃上清。

14.重复第13步。

15.将染色细胞重悬于适当体积的流式细胞染色液中。

16.通过流式细胞仪分析。

 

操作步骤C： 固定/甲醇的两步法

 

以下操作步骤允许同时分析细胞表面分子和一些细胞内磷酸化信号蛋白。 在该操作步骤中，固定之后用甲醇处理细胞。 对于磷酸化蛋白质检测，合适的磷酸化刺激条件和动力学将根据细胞类型和所测定的特定信号传导事件而变化。 例如，为了诱导磷酸化-STAT1（Y701）的磷酸化，可以用 IFNγ 激活巨噬细胞，而在 T 细胞中诱导磷酸化-ERK1 / 2（T202 / Y204）则响应于PMA（佛波酯和蛋白激酶C激活剂）或抗CD3交联。

一般注意事项

1.荧光偶联的抗体可用于染色表面蛋白质，用于免疫表型分析细胞，进一步分析磷酸化蛋白质；但是，有必要考虑染色的其他考虑因素。

1)活细胞上表面标志物的抗体染色可能改变信号蛋白的表达，因为可能刺激/抑制信号传导事件。 因此，在细胞刺激之前不建议进行表面染色。 相反，表面蛋白染色可与细胞内蛋白质染色相同的步骤。 请注意，除了表面定位之外，一些蛋白质也将具有细胞内的库，这些应该考虑。 识别固定细胞/抗原决定簇的表面蛋白的抗体克隆需要评估和使用。 有关抗体克隆性能，请参阅抗体固定注意事项。

2)如果在固定前需要表面染色（由于固定引起的抗原决定基破坏），只有当偶联的荧光染料对甲醇暴露有抗性时，才能在固定/甲醇步骤之前用荧光染料偶联的抗体染色细胞（参见下表）。

耐甲醇荧光染料	甲醇敏感荧光染料
Alexa Fluor 488	PE
eFluor 660	PE-tandems
Alexa Fluor 647	PerCP
eFluor 450	PerCP-tandems
FITC	APC
	APC-tandems

2.对于贴壁细胞，我们建议将细胞固定在平板/孔中。 固定后，刮下细胞或用EDTA溶液处理进行收获并继续操作步骤。 如果不需要表面染色或表面染色蛋白对胰蛋白酶消化具有抗性，可以使用胰蛋白酶。

 

材料

 

& 12 x 75 mm圆底试管或96孔V型或U型底微量滴定板

& 自选组织培养基

& 自选细胞刺激剂

& 一抗（荧光直标）

& 流式细胞分析染色液（#222026）

& IC固定液（#00-8222）

& 90-100％甲醇（HPLC 级）

& [可选]Fc封闭： 纯化的抗小鼠CD16/CD32（#AM1016010）或纯化的人FC受体结合抑制剂（#AH1016010）

 

实验步骤

1.在合适的培养基中制备用于刺激的目标细胞。

2.细胞计数，以1-5×10 6个细胞/ mL在合适的培养基中重悬。

3.37°C 下，在需要的时间点用适当的处理来刺激细胞。 记住在 37°C孵育未处理的细胞作为阴性对照。

4.[可选]如果在固定之前需要表面染色（在步骤5中），则使用与抗甲醇荧光染料偶联的抗体，如“流式细胞细胞表面靶标染色操作步骤”中所述来染色细胞表面抗原

5.在刺激期结束时，通过将等体积的IC固定液直接添加到细胞中并涡旋混合来固定细胞以停止刺激。

6.在室温下孵育样品10-60分钟。 避光。

7.在室温下400-600 x g 离心样品5分钟。 弃上清。

8.将细胞沉淀重悬于剩余体积中，加入1 mL预冷的90-100％甲醇。 涡旋混合并在2-8°C下孵育至少30分钟。

  注意： 一旦加入甲醇，细胞可以在<-20°C下储存长达4周。

9.用过量体积的流式细胞染色液洗涤细胞

10.在室温下400-600 x g离心细胞5分钟。 弃上清。

11.用流式细胞染色液以1x10 7个细胞/ mL重悬细胞，并将1x10 ⁶个细胞（100μL）等分到单独的流式管中。

12.[可选] 在染色前，使用纯化的抗小鼠CD16 / CD32或人Fc受体结合抑制剂封闭，可以阻断细胞的非特异性Fc介导的结合。

13.每管加入推荐量的直接偶联抗体，并在室温下孵育30-60分钟。 避光。

注意： 如果需要，可以同时进行表面染色和细胞内磷酸染色。 由于并非所有抗体克隆都与固定的抗原决定簇结合，因此请参阅“固定/破膜后抗体克隆性能”表。

14.加入2 mL流式细胞术染色液，在室温下400-600x g离心4-5分钟。 弃上清。

15.重复第14步。

16.将染色细胞重悬于适当体积的流式细胞术染色液中。

17.通过流式细胞术分析样品。

 

96 孔板实验步骤

 

1.在合适的培养基中制备用于刺激的目标细胞。

2.细胞计数，以1-5×10 ⁶个细胞/mL在合适的培养基中重悬。

3.向孔中加入含有适当刺激剂的100 μL培养基。

4.向孔中加入100 μL细胞，并在所需的时间点 37°C孵育。 记住在37°C孵育未处理的细胞作为阴性对照。

5.[可选]如果在固定之前需要表面染色（在步骤6中），则使用与抗甲醇荧光染料偶联的抗体，如“流式细胞细胞表面靶标染色操作步骤”中所述来染色细胞表面抗原

6.在刺激期结束时，通过直接向孔中加入200 μL IC固定液来固定细胞以停止刺激。

7.黑暗中在室温下孵育平板10-60分钟。 避光。

8.室温600 x g离心平板4-5分钟。 弃上清。

9.将细胞沉淀重悬于残余体积中，并向孔中加入 100 μL预冷的90-100％甲醇。 涡旋混合并在2-8°C或冰上孵育平板至少30分钟。

注意： 一旦加入甲醇，细胞可以在≤20°C下储存长达 4 周。

10.加入200 µL流式细胞术染色液，在室温下600 x g离心4-5分钟。 弃上清。

11.重复第10步

12.[可选] 在染色前，使用纯化的抗小鼠CD16/CD32或人FC受体结合抑制剂封闭，可以阻断细胞的非特异性FC介导的结合。

13.每孔加入推荐量的直接偶联抗体，并在室温下孵育30-60分钟。 避光。

注：如果需要，可以同时进行表面染色和细胞内磷酸染色。 由于并非所有抗体克隆都与固定的抗原决定簇结合，因此请参阅“固定/透化后抗体克隆性能”表。

14.加入200μl流式细胞术染色液，在室温下600×g离心4-5分钟。 弃上清。

15.重复第14步。

16.将染色细胞重悬于适当体积的流式细胞术染色液中。

17.通过流式细胞术分析样品。

 

 

Invitrogen™ UltraComp eBeads™系列微球可与人、兔、小鼠、大鼠和仓鼠更多物种来源的抗体发生反应，并且不依赖于免疫球蛋白轻链结合。每滴微球溶液中含有两种微球：阳性群微球可捕获小鼠、大鼠或仓鼠等的抗体，而阴性群微球则不与抗体发生反应。向微球中加入荧光标记抗体后，流式结果图中会出现明显的阳性和阴性两群实验结果；在多色流式实验中，双峰分布信号可用于单色补偿对照。UltraComp eBeads系列微球（货号01-3333，货号01-2222）可以广泛应用多种流式荧光染料，兼容由紫外（355 nm）、紫色（405 nm）、蓝色（488 nm）、绿色（532 nm）、黄绿色（561 nm）和红色（633-640 nm）激光激发的所有荧光染料。尤其是UltraComp eBeads Plus流式补偿微球（货号01-3333）允许用于更多种属的流式抗体的补偿调节，包括人源抗体和兔源抗体；它还优化了紫激光聚合物染料的使用，如Brilliant Violet 785/786、Brilliant Violet 711、Super Bright 780和Super Bright 702标记的抗体。

 

材料

 

- 补偿微球：UltraComp eBeads（#01- 2222）或 UltraComp eBeads Plus（#01-3333-41）

- 未染色细胞

- 一抗（直接偶联）

- 流式染色缓冲液（#222026）

- 12 x 75 mm 圆底试管

注意：此方案可以用于 OneComp eBeads（#01-1111）。

 

实验步骤

 

步骤 I：单色补偿对照品的制备

 

1. 给试管贴上荧光染料标签。
2. 用力颠倒至少 10 次或脉冲涡旋，将微球混合均匀。
3. 给每个试管贴上标签，脉冲涡旋 10 次。
4. 向每个试管中加入 1 滴 UltraComp eBeads。
5. 向每个试管中加入 1 次试验量或更少的抗体偶联物，混匀。
   • 注意：UltraComp eBeads 与含有 PBS 或 HBSS、牛血清白蛋白（BSA）或 FBS 等蛋白和叠氮化钠的标准染色缓冲液兼容。请勿使用其他添加剂。如需获取更多信息，请联系技术支持部。
   • 注意：一个试验是指用于细胞样本染色的抗体量（μg），最终体积为 100 μL。如果在阴性微球群体中观察较高的背景，则可以减少抗体的用量。在这种情况下，建议用量不超过 0.125 μg。由于抗体与阳性微球的结合与抗体的特异性无关，因此无需使用最佳浓度的抗体。对于大多数抗体， 0.03–1.0 μg 的量即可得到适合的补偿值。
6. 轻弹、用力颠倒或脉冲涡旋混匀。
7. 在 2-8°C 下避光孵育15-30 分钟。
8. 向每个试管中加入 2 mL 的流式染色缓冲液，400-600 x g 离心 3-5 分钟。
9. 倒出上清液，向每个试管中加入 0.2-0.4 mL 的流式染色缓冲液。
10. 分析前，轻弹或脉冲涡旋混匀样本。

Invitrogen™ CellBlox™封闭缓冲液（Invitrogen™ CellBlox™ Blocking Buffer）是非蛋白类溶液，可以阻止Invitrogen™ NovaFluor™标记物与部分细胞发生非特异性结合，避免背景信号影响。CellBlox封闭缓冲液也用于花菁素染料（Cyanine dyes）或花菁素串联染料（Cyanine-tandem dyes）染色时，也可以封闭荧光染料与单核细胞、巨噬细胞和其他类型细胞的非特异性相互作用，降低背景信号。使用CellBlox封闭缓冲液时，仅需对染色方案进行部分调整，即在加入抗体之前，将5 µL CellBlox封闭缓冲液直接添加到100 µL含有10³–10⁸个细胞的悬液中；也可以在抗体标记细胞之前，按每个样本5 µL CellBlox封闭缓冲液添加到抗体混合物中，调整终染色体积为100µL。

重点注意：使用本实验方案进行细胞分离需使用实验方案中提到的各项产品，不建议更换不同产品。

注：当使用NovaFluor染料时，请搭配使用Cellblox封闭缓冲液。

技术提示

NovaFluor染料需配合CellBlox封闭缓冲液使用，降低染色背景。
• CellBlox封闭缓冲液适用于很多荧光染料以及Invitrogen™ LIVE/DEAD™ Fixable Dead Cell Stains。
• CellBlox封闭缓冲液可结合使用很多荧光标记抗体中，用作单核细胞和巨噬细胞的封闭溶液。
• CellBlox封闭缓冲液可与其他封闭试剂兼容，例如Fc Block、封闭蛋白、Brilliant Stain Buffer和Super Bright Complete染色缓冲液。
• 抗体标记补偿微球时无需添加CellBlox封闭缓冲液。

 

方案一：通过制备所有样本的抗体混合物和封闭液

 

1. 单细胞悬液制备：请参考最佳细胞制备方案，http://www.novobiotec.com/wiki/41。
2. 每管或孔中添加含有10³-10⁸个细胞的细胞悬液。
3. 将每种抗体按滴定剂量制备抗体混合物，加入样本前需充分混匀。
4. 按每个样本5 µL CellBlox封闭缓冲液（CellBlox Blocking Buffer，货号B001T03F01）添加到抗体混合物中，将终体积调整为100µL。例如，制备10份样本的抗体混合物，需向抗体混合物中添加50 µL CellBlox封闭缓冲液。
5. 将每份含有CellBlox封闭缓冲液的抗体混合物添加到各样本中，调整染色终体积为100 µL。
6. 在2–8°C或室温下，避光孵育30分钟。
7. 每管加入2 mL的流式细胞染色缓冲液（#222026），室温下400-600 x g离心5分钟，弃掉上清液。
8. 重复步骤7。
9. 使用适当体积的细胞染色缓冲液（#222026）重悬细胞。
10. 上样到流式细胞仪，分析样本。如需继续染色细胞内靶标，请参考2.流式胞内抗原染色。

 

备用方案一：通过制备所有样本所需封闭液+抗体单独加入

 

1. 单细胞悬液制备：请参考最佳细胞制备方案，thermofisher.cn/cellpreparation。
2. 按每份含有10³–10⁸个细胞的样本合并在一管中。
3. 按每个样本5 µL CellBlox封闭缓冲液（CellBlox Blocking Buffer，货号B001T03F01）添加到混合细胞样本中。例如，制备含10份小体积样本的细胞悬液，需向细胞悬液中添加50 µL CellBlox封闭缓冲液。
4. 将含有CellBlox封闭缓冲液的细胞悬液添加到每个样本管或孔中。
5. 将每种抗体按最佳用量添加到每个样本中，调整染色终体积为100 µL。
6. 在2–8°C或室温下，避光孵育30分钟。
7. 每管加入2 mL的流式细胞染色缓冲液（#222026），室温下400-600 x g 离心5分钟，弃掉上清液。
8. 重复步骤7。
9. 使用适当体积的细胞染色缓冲液（#222026）重悬细胞。
10. 上样到流式细胞仪，分析样本。如需继续染色细胞内靶标，请参考2.流式胞内抗原染色。

 

备用方案二：封闭液+抗体均单独加入

 

1. 单细胞悬液制备：请参考最佳细胞制备方案，thermofisher.cn/cellpreparation。
2. 每管或孔中添加含有10³-10⁸个细胞的细胞悬液。
3. 在细胞染色之前，将5 µL CellBlox封闭缓冲液（CellBlox Blocking Buffer，货号B001T03F01）直接添加到每份样本中。
4. 将每种抗体按最佳用量添加到每个样本中，调整染色终体积为100 µL。
5. 2–8°C或室温下避光，孵育30分钟。
6. 每管加入2 mL的流式细胞染色缓冲液（#222026），在室温以400-600 x g 离心5分钟，弃掉上清液。
7. 重复步骤6。
8. 使用适当体积的细胞染色缓冲液（#222026）重悬细胞。
9. 上样到流式细胞仪，分析样本。如需继续染色细胞内靶标，请参考2.流式胞内抗原染色。。

现在各种各样的流式仪器和流式染料允许进行越来越多色的流式检测实验，而多色流式实验的优势包括同时检测单细胞上的多个标记物、收集丰富的细胞实验数据以及最终更加精确鉴别细胞群（图1）。再加上，所需样本体积减少、样本检测通量提高，使得流式细胞实验的效率明显提高。但是，检测更多抗原和更多荧光染料使流式配色更加复杂，同时更需注意配色优化、实验对照以及其他细节[1]。在流式多色实验中，最大挑战是选择合适的荧光染料，同时还需兼顾荧光染料之间光谱重叠或荧光溢漏保持最少，保证流式数据结果的高质量和准确性。请参考流式配色的相关文献[2-4]。

图1.使用Attune NxT声波聚焦流式细胞仪对人外周血单个核细胞（PBMC）进行10参数免疫分型检测。根据前向散射光FSC和侧向散射光SSC对淋巴细胞和单核细胞设门（A）。在淋巴细胞中根据CD3表达圈出T细胞（B），并进一步将其细分为CD4+和CD8+ T细胞亚群（C）。调节性T细胞可表达CD4和CD25（G），它是维持机体免疫耐受的重要因素。CD62L将T细胞分为初始CD4+ T细胞和初始CD8+ T细胞（TN）；HLA-DR可由活化的T细胞（TA）表达（D, H）。外周血中树突状细胞通常不表达T和B细胞谱系标志，可表达CD11c和HLA-DR（F）。在散射光信号图中，单核细胞位于淋巴细胞上方（A），并且同时表达CD14和CD33（E）。

 

在设计流式配色方案时，重点关键要素如下：

• 在流式配色之前，了解您的仪器配置（激光器和滤光片）。
• 弱表达抗原搭配较亮荧光染料，强表达抗原搭配较弱荧光染料。
• 荧光互相干扰的荧光染料用来标记不同细胞，然后对其分别设门分析。
• 流式多色方案中应包含细胞活性检测染料，排除死细胞和细胞碎片。
• 使用荧光光谱查看器（thermosher.cn/spectraviewer）等工具，查看荧光染料之间的光谱重叠。
• 滴定抗体用量并不断优化，构建流式配色方案是反复斟酌衡量的过程。

确定荧光染料亮度

在流式细胞分析中，荧光染料的亮度不仅因它的量子产量和消光系数这些参数而变化，也受背景噪音信号影响。例如非特异性染色、细胞自发荧光以及仪器产生噪音等，这些会影响目标细胞群（阳性）和空白细胞群（阴性）的清晰分群。通过信噪比（Signal-to-noise ratio，S/N），可以确定流式检测灵敏度以及阳性群与阴性群荧光信号差异，计算方式为阳性细胞群的荧光强度中位值（MFI）除以阴性细胞群的荧光强度中位值，来得出信噪比（图2）。但是，荧光染料的相对亮度不仅由细胞群荧光的强度差决定，还由阴性细胞群荧光强度分布程度来决定。Maecker等人认为[2]，计算染色指数（Stain Index, SI）时应根据以上两种参数计算（图2），用于比较同一抗体的不同荧光染料染色（表1，图3）。

图2. 染色指数（Stain Index）和信噪比的比较。图中展示了信噪比相同的两群荧光信号，但其染色指数（Stain Index）不同，这是因为它们阴性峰的宽度不同（W1窄vs W2宽）。由于阴性峰宽度影响阳性和阴性信号的区分，因此染色指数常作为荧光染料亮度参数。

 

表1. 在CD4抗体（克隆号53.5）上不同荧光染料的染色指数。

 

图3. 使用不同荧光染料标记的CD4抗体染色结果图。在氯化铵裂解后的人全血样本中，收集10,000个淋巴细胞，评估20种的Anti human CD4抗体性能（见表1）。为获得最大信噪比，对每种荧光抗体均进行了滴定和优化，结果为（A）CD4-APC抗体亮度最高；（B）CD4-PE–Alexa Fluor 700抗体亮度中等；（C）CD4-Pacific Blue抗体亮度很低。图片左上角有每种荧光抗体的染色指数（Stain Index）。

流式实用工具：

荧光光谱查看器Spectra Viewer，流式配色工具Panel Builder

使用荧光染料光谱查看器（thermofisher.cn/spectraviewer），选择合适的荧光染料。在输入仪器的激光器和滤光片配置（图4）后，这里会展示每种荧光染料的激发光谱和发射光谱，然后选择合适的荧光染料，例如图5所示为流式5色方案。而且，还可以查看荧光溢漏表格（Spillover table），查看每个通道内每种染料之间的光谱重叠或荧光溢出（表2）。使用Panel Builder流式配色工具（thermofisher.cn/order/panel-builder），选择合适的荧光抗体。它可以简单、直观、灵活地设计流式配色方案，满足不同的流式实验方案设计的需求。与荧光光谱查看器类似，它既可展示荧光染料的激发光谱和发射光谱，也能显示在该通道所有流式抗体，使得构建多色流式检测方案更加方便，最终轻松选择到合适的抗体。

图4.荧光光谱查看器Spectra Viewer。同一荧光染料的激发光谱（A）和发射光谱（B），激光激发波长（C），带通发射滤光片波长（D）。

图5.荧光光谱查看器显示流式5色方案。这里使用了405 nm激光激发的Pacific Blue染料（紫色）、405 nm激光激发的LIVE/DEAD可固定细胞死活的黄色染料（黄色）、488 nm激光激发的R-藻红蛋白（PE，橙色）、561 nm激光激发的PE-Alexa Fluor 647（红色）及633 nm激光激发的APC-Alexa Fluor 750（棕色）的发射光谱。所示激光为405 nm（紫色）、488 nm（蓝色）、561nm（黄色）和633 nm（红色）。

表2. 在荧光光谱查看器中，这五种染料的荧光溢漏表格（图5）

表中方案是基于Attune NxT流式细胞仪的滤光片配置而设计。 百分比是指使用该滤光片检测到荧光信号的效率。比如，574/26 nm带通滤光片分别收集20.3%的LIVE/DEAD可固定细胞死活黄色染料（LIVE/DEAD Fixable Yellow Stain）荧光以及53.7%的PE荧光染料的荧光，但它们的荧光光谱实际上不会发生重叠，因为它们是由不同激光器激发的：LIVE/DEAD染色液由405 nm激光器激发而非488 nm激光器，PE由488 nm激光器激发而非405 nm激光器。

图6 Panel Builder流式配色工具页面

参考文献

1. Nat Rev Immunol (2004) 4:648–655.
2. Cytometry A (2004) 62:169–173.
3. Cytometry A (2006) 69:1037–1042.
4. Clin Lab Med (2007) 27:469–485.