单细胞转录组学分析

单细胞水平转录组学测序分析技术（以下简称单细胞测序）因其实现了单个细胞内mRNA的标记、建库扩增和分析，为存在高度异质性的细胞群体、组织类型的研究分析提供了突破性的方法，成为当前最炙手可热且发展迅速的测序技术。

单细胞测序技术带来的最大优势就是捕获单个细胞内罕见转录本并基于此获得如

新转录本的发现须在具有充分库复杂度（Library Complexity）的基础上获得，同时要求数据稳定可重复，这为建库初始样本提出了极高的要求。

 

单细胞测序对样品的要求标准

 

为了顺利满足单细胞测序建库的上样需求，获取完整、真实且可重复数据，并取得有科学价值的数据，高质量的单细胞样品制备至关重要。

Miltenyi Biotec MACS^®样本制备完整工作流程可实现全自动标准化的高效组织解离过程，获得高收率、高活力且抗原表位信息完好的高质量单细胞悬液。基于MACS® Technology对目的细胞进行磁性分选或富集，在特定应用中经验证可获得更高质量的单细胞测序数据。

- 高活性⸺确保所得测序数据的回收率（Cleanliness），样品至少满足80%的活细胞比例；

- 无碎片⸺细胞碎片会黏附游离核酸，为测序结果造成干扰的同时亦提高了测序成本；

- 单个均一⸺为确保微滴捕获的成功率和测序结果的准确性，均一且充分分散的单细胞是上机的先决条件。

 

单细胞转录组学分析

 

完整单细胞制备流程由如下四个核心步骤构成，每步的最优方案确保了终样品的优质和稳定可靠。为特定组织提供有针对性的优化方案，即使难于解离的组织类型（如成年动物脑组织、心脏、肝脏等）也可获得满足单细胞测序需求的单细胞悬液样品。

组织样品---保存和转运组织解离粗样品纯净---目的细胞---纯化与富集组织样品的组织样本经常面临获取后需暂时存放并转运到实验室的情形。该过程处置不当，会对起始样本的质量（如细胞活力和细胞表面抗原信息等）造成重大影响，使得下游研究结果的可靠性受损。因此，优质的单细胞样本制备从最优化的样

品保存和转运开始。

优势：

1. 在4°C 条件下有效保持组织新鲜长达48小时

2. 不引起组织内细胞的凋亡和异常激活

3. 细胞活力不受影响

4. 有效保持细胞得率和细胞表位信息完整

产品名称	编号	规格
MACS Tissue Storage Solution	130-100-008	100 mL

图1. MA CS组织保存溶液与其他同类产品性能比较。（左）每克组织获得的总细胞数数量。（右） 活细胞百分数比例。组织样品解离MACS高效组织样本解离是基于gentleMACS Octo全自动组织解离器的机械力扰动配合MACS组织解离试剂盒的酶解消化共同实现的。

gentleMACS Octo全自动组织解离器

• 搭配紫色顶盖的C管 可进行单细悬液制备，结果可靠

• 超过30种经验证的优化预置程序，满足几乎所有类型组织的解离；

• 可应用于几乎所有研究领域，如肿瘤研究、免疫学、神经科学、心血管及干细胞研究等；

• 可同时对多达8个样品运行不同的解离程序，效率更高；

• 完全无菌、封闭的解离体系，避免样品间夹带，保障样品可靠；

• 无气溶胶产生，从顶部软膜刺破提取样品的设计为操作人员提供安全保障。

产品名称	编号
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	130-096-427
gentleMACS C tube, sterile, 25 tubes per bag	130-096-334

• 搭配橘色顶盖的M管

• 可进行满足核酸、蛋白等分子生物学研究需求的充分组织匀浆，

• 其全封闭的结构和可刺穿的顶部取样软膜设计，为含高风险病原

• 的临床样品分子采集提供安全保障。

MACS 组织解离试剂盒全系列

产品编号	产品名称	应用简介
130-095-929	Tumor Dissociation kit, human	经验证满足多种组织来源肿瘤的解离，下游可用于肿瘤细胞、肿瘤浸润白细胞及肿瘤相关成纤维细胞等的分离。
130-101-540	Whole Skin Dissociation Kit, human	专为分离皮肤中成纤维细胞而特别优化，无需去除表皮和真皮。
130-101-540	Whole Skin Dissociation Kit, human	专为分离皮肤中成纤维细胞而特别优化，无需去除表皮和真皮。
130-103-464	Epidermis Dissociation Kit, human	专为分离表皮或皮肤活检样品内的角质细胞而特别优化
130-118-052	FFPE Tissue Dissociation Kit	用于石蜡包埋组织样品的固定后单细胞解离，下游用于二代测序。
130-095-942	Brain Tumor Dissociation Kit (P)	用于人和小鼠来源多种脑部肿瘤样本，如神经母细胞瘤、恶性胶质瘤及髓母细胞瘤，及脑部肿瘤异种移植物（xenograft）的解离
130-096-348	Embryoid Body Dissociation Kit, h, m	用于人和小鼠来源成体干细胞形成拟胚体的解离
130-110-201	Multi Tissue Dissociation Kit 1	分别为不同解离强度的试剂盒，适合于多种复杂组织的解离。面向用户的表位保存信息表有助于解离条件的优化。现有多种经验证的解离方案如：肾脏（人和小鼠）、耳、胚胎、成体动物心脏、前列腺（小鼠来源）、肺 （大鼠）等多种组织的解离。
130-110-203	Multi Tissue Dissociation Kit 2
130-110-204	Multi Tissue Dissociation Kit 3
130-096-730	Tumor Dissociation Kit, mouse	经验证满足多种小鼠来源肿瘤的解离，基于细胞系、基因诱导、及原发肿瘤，包括直结肠肿瘤、乳腺肿瘤、肺癌、黑色素瘤、骨肉瘤等原发瘤及细胞系模型导瘤的解离。
130-107-677	Adult Brain Dissociation Kit	用于成年小鼠、大鼠脑组织的解离，支持成体各种神经细胞类型的分离。
130-092-628	Neural Tissue Dissociation Kit - Papain	用于小鼠神经干细胞、神经元分离为目的的神经组织解离。
130-093-231	Neural Tissue Dissociation Kit - Trypsin	用于小鼠神经干细胞、神经元分离为目的的神经组织解离。
130-097-410	Lamina Propria Dissociation Kit, mouse	用于小鼠肠道固有层内免疫细胞分离的组织解离。
130-095-927	Lung Dissociation Kit, mouse	用于小鼠肺部内内皮细胞、免疫细胞分离的肺组织解离。
130-105-807	Liver Dissociation Kit, mouse	用于小鼠肝脏内非实质细胞获取的肝组织解离。
130-095-928	Epidermis Dissociation Kit, mouse	用于真皮内Langhans细胞、免疫细胞分离进行的组织解离。
130-095-926	Spleen Dissociation Kit	用于小鼠脾脏内多种免疫细胞分离的组织解离。
130-098-373	Neonatal Heart Dissociation Kit, m&r	用于大、小鼠心脏的解离，用于下游非心肌细胞分离
130-098-305	Skeletal Muscle Dissociation Kit, m&r	大、小鼠骨骼肌组织的解离，用于下游非肌细胞分离。
130-105-808	Adipose Tissue Dissociation Kit, m&r	用于大、小鼠脂肪组织的解离，用于下游非脂肪细胞，如脂肪干细胞、免疫细胞、内皮细胞及间质细胞等的分离。
130-095-943	Neurosphere Dissociation Kit	用于体外培养神经球传代等的解离。

粗样品纯净

---

解离后的单细胞粗液内仍含有不同含量的细胞团、组织碎片、红细胞和凋亡细胞，将对单细胞测序建库造成影响：细胞团块无法被成功捕获和包裹、组织碎片和凋亡细胞黏附核酸影响细胞回收率、红细胞大量存在降低了测序有效性且提高了测序成本。

MACS SmartStrainer细胞滤器

用于组织解离后，团块和碎片的滤除。提供30 μm, 70 μm和100 μm三种不同孔径规格，可适配15 mL和50 mL离心管, 聪明的小设计显著提升使用感受：

1.可叠加使用，一次操作实现多种直径的区分

2.巧妙的通风口设计，不再为滤网堵塞液体滞留发愁

3.不同孔径以颜色区分，不担心孔径错配

 

产品名称	产品编号
SmartStrainer 30 μM	130-098-458
SmartStrainer 70 μM	130-098-462
SmartStrainer 100 μM	130-098-463

红细胞裂解

用于含血细胞较多组织块解离后的红细胞去除操作。温和的红细胞裂解，对维持其他细胞类型（如免疫细胞）的活力和表面抗原信息尤为关键，处理后的样品适用于流式细胞分析及单细胞测序等应用。

产品名称	产品编号
Red Blood Cell Lysis Solution	212010

碎片去除溶液

适用于心脏、神经、肝等通常产生大量组织碎片的组织类型解离后的碎片去除，该步骤十分重要，可避免大量组织碎片黏附核酸、测序结果混杂大量背景噪声的发生。基于密度梯度离心的即用型试剂，可高效、快速地完成碎片去除。

产品名称	产品编号
Debris removal solution	130-109-398

 

死细胞去除试剂盒

 

基于细胞磁力分选金标准的MACS Technology,有效识别已经死亡和凋亡的细胞并充分去除，获得高活性的单细胞悬液，满足单细胞测序建库标准的同时，节约测序成本，确保测序结果的有效性（数据详见应用实例⸺肿瘤异质性研究）。

死细胞去除试剂盒同样适用于其他容易产生大量死细胞的应用场景，可充分排除死细胞对下游应用的影响和干扰,比如：

• 原代细胞培养接种前；

• 冻存细胞复苏后、接种前；

• 细胞转染操作后；

 

产品名称	产品编号
Dead Cell Removal kit	130-090-101

 

流式细胞术荧光染料相关参数的整理汇总，以便在流式抗体荧光染料选择时参考。

荧光染料的选择比较复杂。选择合适的染料取决于两个主要特性：荧光染料能够被特定波长的激光激发，以及发射波长能够被光学滤镜和探测器区分。流式细胞仪中激光器与探测器的配置决定了适用的荧光染料组合。

紫外线-可见光光谱

紫外-可见光谱中特定波长的激光可以激发相应的荧光染料

为避免荧光的发射波谱因发射波波谱重叠而发生串色，影响实验结果的分析，所以在选择抗体荧光染料时要综合考虑仪器的激发激光波长和发射波长能够被光学滤镜和探测器区分以及不同荧光染料的发射波谱不发生重叠。

1、优先考虑仪器的激发激光波长，根据激光参数选择荧光染料；

2、其次考虑荧光的发射波谱是否会被光学滤镜和探测器区分；

3、考虑所要检测的抗原表达量高低和避免荧光染料发射波谱重叠；

4、依据以上几个因素，综合考虑荧光染料的染色指数高低，最后确定最优的荧光抗体染色方案。

（关于荧光补偿调节将在专门介绍：流式细胞的荧光补偿调节）

荧光染料	荧光发射波	最大激发波(nm)	激发激光(nm)	最大发射波（nm）
Brilliant Ultraviolet 395	Violet	348	355	395
Hoechst 33342	Blue	350	355, 375	461
BD Horizon V450	Blue	404	405	448
VioBlue	Blue	400	405	452
Pacific Blue	Blue	401	405	452
Super Bright 436	Blue		405	436
Brilliant Violet 421	Blue		405	421
Alexa Fluor 405	Blue	401	405	421
eFluor 450	Blue	401	405	421
Brilliant Ultraviolet 496	Blue	348	355	496
eFluor 506	Green	419	405	506
BD Horizon V500	Green	415	405	500
Brilliant Violet 510	Green		405	510
AmCyan	Green	457	405	491
VioGreen	Green	388	405	520
VioBright 515	Green	488	488	514
Vio 515	Green	488	488	514
Brilliant Blue 515	Green	490	488	515
Alexa Fluor 488	Green	495	488	519
FITC	Green	494	488	519
VioBright FITC	Green	496	488	520
eFluor 520	Yellow	475	488	535
Brilliant Ultraviolet 563	Yellow	348	355	563
PE-Alexa Fluor 610	Yellow	496	488	565,628
Pe-Alexa Fluor 700	Yellow	496	488	565, 723
PE-Cy5.5	Yellow	496	488	565,694
Brilliant Violet 570	Yellow		405	570
Alexa Fluor 532	Yellow		532	553
eFluor 570	Yellow	535	488, 532, 561	585
PE	Yellow	496, 564	488, 532, 561	578
PE-eFluor610	Yellow	496, 565	488	607
Brilliant Violet 605	Yellow		405	603
Super Bright 600	Yellow		405	600
PE-Texas Red	Orange	496, 564	488, 532, 561	615
PI	Orange	351	488, 532, 561	617
PE-Vio615	Orange	565	488, 561	619
eFluor 615	Red	560	532, 561	645
Super Bright 645	Red		405	645
Brilliant Violet 650	Red		405	645
7-AAD	Red	543	488, 532, 561	647
APC	Red	650	633, 635, 640	660
Brilliant Ultraviolet 661	Red	348	355	661
Alexa Fluor 647	Red	650	633, 635, 640	668
eFluor 660	Red	633	633	668
PE-Cy5	Red	496, 564	488, 532, 561	667
PerCP	Red	482	488, 532	678
Brilliant Blue 700	Far Red	485	488	693
PerCP-Cy5.5	Far Red	482	488, 532	695
Super Bright 702	Far Red		405	702
PerCP-Vio700	Far Red	482	488	704
PerCP-eFluor 710	Far Red	488	488	710
Brilliant Violet 711	Far Red		405	711
Alexa Fluor 700	Far Red	696	633, 635, 640	719
Brilliant Ultraviolet 737	Far Red	348	355	737
Brilliant Violet 750	Far Red		405	750
APC-eFluor 780	Far Red	645	633	767
PE-Vio 770	Infrared	565	488, 561	775
APC-Vio770	Infrared	652	561, 635	775
Super Bright 780	Infrared		405	780
PE-Cy7	Infrared	496, 564	488, 532, 561	565, 785
Brilliant Violet 785	Infrared		405	785
APC-Cy7	Infrared	650	633, 635, 640	785
BD APC-H7	Infrared	650	633, 635, 640	785
APC-Alexa Fluor 750	Infrared	650, 750	633, 635, 640	801
Brilliant Ultraviolet 805	Infrared	348	355	805

 

一、荧光蛋白：

（1）蛋白质结构编码了荧光。这些荧光蛋白包括绿色荧光蛋白（GFP）、YFP、RFP和各种衍生物。

 

荧光蛋白始祖--绿色荧光蛋白

 

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP），基于GFP晶体结构，通过定点或随机突变手段以期找到功能更强的GFP突变体。应用范围最广的当属增强型GFP（EGFP）和Emerald（祖母绿），不稳定增强型绿色荧光蛋白（dEGFP），增强型黄色荧光蛋白（EYFP），增强型蓝色荧光蛋白（EBFP），增强型蓝绿色（青色）荧光蛋白（ECFP）等各种衍生型GFP，发出的荧光颜色各不相同。

 

红色荧光蛋白

 

GFP 虽然用途广泛，但由于其发射光谱仅局限于440-529 nm, 细胞内成像时背景较高,无法对活体生物皮下进行更深的荧光标记。与GFP相比，其激发和发射波长更长，在细胞内成像时背景低，并且红色荧光蛋白能够与 GFP共同标记。

最早用于研究的红色荧光蛋白是 DsRed（发射峰在583nm），来源于珊瑚，荧光强、稳定性好。DsRed易形成寡聚体，且成熟速度慢，DsRed的突变体有mBanana、mOrange、dTomato、mTangerine、mStrawberry 和mCherry，其中mStrawberry和mCherry，发射峰分别为596nm和610nm，亮度分别为EGFP的75%和50%左右。

常用荧光蛋白的物理属性

蛋白	光谱型颜色	激发峰（nm）	发射峰（nm）	亮度	光稳定性	pKa	聚集状态	发色团	虑光装置
EBFP2	蓝色	383	448	18	55	5.3	弱二聚体	SHG	DAPI/BFP
ECFP	蓝绿色	433/445	475/503	13	64	4.7	弱二聚体	TWG	CFP
mCerulean	蓝绿色	433/445	475/503	27/24	36	4.7	单体	TWG	CFP
mTFP1	蓝绿-绿色	462	492	54	110	4.3	单体	AYG	CFP
mEGFP	绿色	488	507	34	174	6	单体	TYG	FITC/GFP
mEmerald	绿色	487	509	39	101	6	单体	TYG	FITC/GFP
sfGFP	绿色	485	510	54	157	5.5	弱二聚体	TYG	FITC/GFP
EYFP	黄色	514	527	51	60	6.9	弱二聚体	GYG	FITF/YFP
mVenus	黄色	515	528	53	15	6	单体	GYG	FITC/YFP
mCitrine	黄色	516	529	59	49	5.7	单体	GYG	FITC/YFP
Ypet	黄色	517	530	80	49	5.6	弱二聚体	GYG	FITC/YFP
mKO	橙色	548	559	31	122	5	单体	CYG	TRITC/DsRed
tdTomato	橙色	554	581	95	98	4.7	T二聚体	MYG	TRITC/DsRed
TagRFP	橙色	555	584	48	37	＜4.0	单体	MYG	TRITC/DsRed
mRFP1	红色	584	607	12.5	8.7	4.5	单体	QYG	TxRed
mCherry	红色	587	610	17	96	＜4.5	单体	MYG	TxRed
mKate	远红外	588	635	15	166	6	单体	MYG	TxRed
mPlum	远红外	590	649	3.2	53	＜4.5	单体	MYG	TxRed

 

（2）衍生自在藻类和植物中发现的藻胆蛋白。

 

这些蛋白质使用藻胆蛋白辅因子来吸收光能，包括藻红蛋白（PE）、别藻蓝蛋白（APC）和紫草素叶绿素（PerCP）。

特点：

具有较大的斯托克斯位移（75-200 nm），并且具有稳定的发射光谱。

由于藻胆蛋白较大，因此它们在结合过程中通常具有1：1的蛋白质与荧光染料比率，因此对于定量流式细胞术非常有用。

易受光致漂白，不建议长时间或反复暴露于激发光源中。

 

二、有机小分子

 

FITC（分子量389 Da）、Alexa Fluor 488（FITC类似物，分子量643 Da）、Texas Red（TxRed，分子量625 Da）、Alexa Fluor 647（分子量1155 Da） 、Pacific Blue（分子量242 Da）和Cy5（分子量762 Da）等

 

特点：

 

具有一致的发射光谱和较小的斯托克斯位移（激发波长和发射波长之间的差，大约为50-100 nm）

光稳定好，容易与抗体偶联，应用广泛。

 

三、量子点

 

QDot是一种半导体，可以根据粒子的尺寸调整其不同的发射波长

五种不同的量子点探针溶液显示为用相同的长波长uv灯激发；探针的大小决定颜色。

 

Qdot探针是纳米级（大约为蛋白质大小）的原子簇，包含数百至几千个原子的半导体材料（镉与硒或碲混合），该材料已被另外的半导体壳（硫化锌）覆盖 ）以改善材料的光学性能。 这些粒子发荧光的方式与传统荧光团完全不同，而没有电子跃迁的参与。

特点：

亮度高、光稳定性好

QDots通常被紫激光激发，由于这些补偿问题难以解决，并且将Qdot结合到抗体上较为困难，所以这些试剂在多参数方案中大多被高分子染料取代。

 

四、聚合物染料

 

Brilliant Violet (BV)、Brilliant Ultraviolet (BUV) 和Brilliant Blue (BB)。

 

特点：

 

染料由收集光信号的聚合物链组成，可以根据聚合物链的长度和连接的分子亚基，“调节”吸收和发射特定波长的光。

这些染料非常稳定，与藻胆蛋白具有相似的量子效率，光稳定性大大提高。

仅吸收特定波长的光，因此避免了Qdots存在的跨波长激发的问题。

 

五、重金属离子

 

适用于质谱流式分析，不是用荧光素结合的，而是与镧系元素系列中的单个同位素重金属离子结合。

目前商业上有35种镧系元素同位素可用于抗体偶联。

 

六、串联染料

 

串联染料是利用Förster共振能量转移（称为FRET或荧光共振能量转移）原理的特殊类别的荧光分子。串联染料（或荧光团）由两个共价连接的荧光分子组成。一个用作供体分子，而另一个用作受体。这产生了具有供体分子的激发和受体的发射性质的独特荧光团。

 

特点：

 

串联染料非常亮，具有较大的斯托克斯位移值（150-300 nm），检测低密度的抗原时非常有用。

串联染料的稳定性不如供体荧光染料，并且能量转移效率因批次而异，使补偿复杂化。

注：串联染料非常敏感和容易降解。这导致受体发射光损失和供体发射光增强，特别是如果荧光团使用相同激光器激发。例如，如果使用PE和PE-Cy7，并且PE-Cy7荧光团开始降解，则其发射的光将在PE通道中检测到，从而给导致错误的数据。串联染料降解的主要原因之一（除了氧自由基）是暴露于光 - 这是完全可预防的！所以，当染色细胞时，避免曝光或处于极端的温度变化环境。后一种建议的原因是某些串联染料可能易受细胞介导的解耦影响，因此在低温下减慢细胞代谢可有助于保持稳定性。

 

七、核酸染料

 

核酸染料DAPI可嵌入到DNA双螺旋中

核酸荧光染料对细胞核染色后定量测量细胞所发出的荧光强度，就可以确定细胞核中DNA、RNA的含量，并可以对细胞周期（如PI，7-AAD，DyeCycle Violet，DAPI）和细胞的增殖状况进行分析，分选染色体（如Hoescht 33342， Chromomycin A3），利用侧群分析对干细胞进行分选（如Hoescht 33342），死活细胞区分以及对细菌进行分选。。有多种荧光染料可以对细胞中的DNA或RNA染色，常用的DNA染料包括碘化丙啶(PI)、DAPI、Hoechst 33342等，RNA染料有噻唑橙、吖啶橙等。

 

八、细胞增殖染料

 

用BrdU（溴脱氧尿嘧啶核苷）孵育细胞，使其掺入细胞DNA合成过程，然后用针对BrdU的抗体和DNA染料染色，便可测量细胞增殖。但是，此方法不适合长期增殖研究。

羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）可用于跟踪增殖细胞的多次分裂。在合适的浓度下，不影响细胞生长或形态，适合长期增殖研究。

 

九、细胞死活染料

 

细胞活力可以通过排除性染料（如碘化丙啶、DAPI）确定，染料不能固定，仅适用于无感染性且需立即分析的细胞。也可通过染料与细胞内胺类物质的结合检测，胺类染料包括Live/Dead（ThermoFisher），Zombie（Biolegend）或Fixable Viablity（BD Biosciences），适用于固定的细胞，适合有传染性细胞、胞内抗原染色的细胞、多聚甲醛固定的细胞。

 

十、钙指示剂染料

 

钙指示剂染料与钙结合后会发生色移，可用于指示细胞激活和信号传导。

最常用的染料仍然是indo-1，即紫外双相钙探针。另外还有fluo-3的Blue-green calcium probes。

随着仪器的迭代更新，科研的进步崛起，单激光、单通道的流式分析已经不能满足科研人员的需求，多激光、多通道流式检测无论在免疫分型、细胞分选还是其它领域都受到广泛青睐。而多色荧光流式检测中最重要的就是荧光配色，合理的荧光搭配是获得最佳结果的基础。准确把握以下荧光配色五大原则，可以轻松获得最佳荧光配色。

1. 了解流式细胞仪配置

2. 染料的亮度与抗原表达量相匹配

3. 荧光光谱重叠最小

4. 避免复合染料联合使用带来的假阳性

5. 尽量使用红色激光激发自发荧光高的样本

 

原则1    了解流式仪配置

 

配色之前必须先了解使用的流式仪配置，有几个激光，几个通道。激光器有紫外激光（375 nm）、紫色激光（405 nm）、蓝色激光（488 nm）、绿色激光（532 nm）、黄绿激光（561 nm）、红色激光（637 nm）。通道则因滤光片的不同而不同。不同的品牌、不同的型号会配置不同的激光器和滤光片，从而实现多激光多荧光检测。

Attune NxT 4激光14色荧光选择表

 

激发激光	滤光片(nm)	推荐荧光染料	荧光蛋白
Violet–405 nm	440/50	eFluor 450, SuperBright 436,Alexa Fluor 405, Pacific Blue, V450, BV421,	Sirius, Azurite, eCFP, eBFP, mTarquoise, Cerulean
	512/25	eFluor 506, Pacific Green, V500, BV510	vGFP
	603/48	SuperBright 600, Pacific Orange, Qdot 605, BV605, eFluor 605NC, eFluor 625NC
	710/50	SuperBright 702,Qdot 705, BV711
Blue–488 nm	530/30	Alexa Fluor 488, FITC	eGFP, Emerald, eYFP
	590/40	PE-Alexa Fluor 610, PE-eFluor 610, PE-Texas Red, PE, PE-CF594, PI
	695/40	PE-Alexa Fluor 700, Tri-Color, PE-Cy5.5, PerCP, PerCP-Cy5.5, Qdot 705, PerCP-eFluor 710
Yellow–561 nm	585/16	PE	mOrange, RFP, dTomato
	620/15	PE-Alexa Fluor 610, PE-eFluor 610, PE-Texas Red, PE, PE-CF594	mCherry, DsRed, mKate, mStrawberry
	695/40	PE-Alexa Fluor 700, PE-Cy5.5, PE-Cy5, Qdot 705, Tri-Color
	780/60	PE-Cy7, Qdot 800
Red–637 nm	670/14	APC, Alexa Fluor 647, Qdot 655, eFluor 660
	720/30	Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, APC-Alexa Fluor 700, Qdot 705, APC-R700
	780/60	APC-Alexa Fluor 750, APC-Cy 7, Qdot 800, APC-H7, APC-eFluor 780

 

原则2   染料的亮度与抗原表达量相匹配

 

不同的抗原表达强弱不同，不同的荧光染料的亮度也不同。在配色时注意弱表达抗原搭配强荧光染料，高表达抗原选择不太亮的染料，即“强弱配”。

比如在CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺（Treg细胞）中，CD3和CD4表达很强，而CD25和Foxp3表达较弱，因此在进行Treg多色流式检测时，CD3和CD4可搭配荧光较弱（FTTC、percp-cy5.5等）的染料，而CD25和foxp3则宜搭配荧光较强（PE、APC、PE-CY7等）的染料。

荧光染料的荧光强度可以通过染色指数^*获得，由于染色指数受到激光波长和频率、检测器的范围和分辨率等的影响，但是在不同仪器上，染色指数计算结果也会不同，因此染色指数只能作为参考。

抗原表达的强弱可参考相关文献，也可以通过实验获得。比如当不清楚几个标记哪个表达强，哪个表达弱的时候，可以用同一个荧光标记的不同抗体标记抗原，通过流式进行观察，斯托克斯位移^*大的，抗原表达就强。

*染色指数（Stain Index）：选定一种抗原，使用流式仪器获取的统计学数据来完成计算的。对于流式来说，在仪器设置一定的情况下，染色指数是一种更为实用反应荧光亮度的参数。染色指数可以用来体现一个荧光通道（或仪器）的检测灵敏度。

                   

    D = 阳性群的中位值与阴性群中位值之差

    W = 阴性群的宽度 (2 x rSD)

*斯托克斯位移：是指荧光光谱较相应的吸收光谱位移。同一荧光标记不同的抗原，斯托克斯位移越大，说明抗原表达越强，反之越小。

 

eBioscience流式荧光染料相对亮度表

 

荧光素	激发波长	最大发射波长	相对亮度
Super Bright 436	405	436	3 to 4
eFluor® 450	405	450	2
eFluor® 506	405	506	1
Super Bright 600	405	600	4 to 5
Super Bright 645	405	645	4 to 5
SuperBright  702	405	702	4
FITC	488	518	3
Alexa Fluor® 488	488	519	3
R-PE	488	578	5
PE-eFluor® 610	488	607	3 to 4
PE-Cyanine 5	488	667	4
PE-Cyanine 5.5	488	695	3 to 4
PerCP-Cyanine 5.5	488	695	3
PerCP-eFluor® 710	488	710	4
PE-Cyanine 7	488	785	3
R-PE	561	578	5
PE-eFluor® 610	561	607	3 to 4
PE-Cyanine 5	561	667	4
PE-Cyanine 5.5	561	695	3 to 4
PE-Cyanine 7	561	785	3
APC	637	660	4
eFluor® 660	637	660	4
Alexa Fluor® 647	637	668	4
Alexa Fluor® 700	637	723	2
APC-eFluor® 780	637	780	2

 

原则3    荧光光谱重叠最小

每种染料都具有最大激发光谱和最大发射光谱，当荧光染料被激光器激发后，会呈现一个右边有拖尾的类似于正态分布的图谱，从光谱上可以看出，不同的染料之间会有重叠，而且一般发射光谱小的对发射光谱大的有较大的溢漏。尤其是同一激光的不同通道更容易发生荧光溢漏（此时需要做补偿）。比如，当FITC和PE都用蓝光488 nm激发时，FITC的荧光会溢漏到PE的通道，因此需要调节补偿。而如果用488 nm激发FITC，用561 nm激发PE，那么就不会发生荧光溢漏，也就无需做补偿。因此进行多色流式检测时，尽量选用多激光激发。

除了强弱配，多激光激发以外，流式配色中还有一些小原则，比如弱表达的抗原放在影响小的通道，比如405 nm的第一通道，488 nm下的FITC通道，637 nm下的APC通道等。同一细胞上表达的抗原尽量避免溢漏，尽量减少母细胞对子细胞的溢漏，反之可以。比如CD3是CD4的母细胞，所以当选用FITC和PE时，最好用CD3-PE，CD4-FITC，从而减少CD3对CD4的溢漏等等。

 

原则4    尽量避免复合染料联合使用带来的假阳性

 

复合染料是一种通过荧光共振能量转移原理（fluorescence resonance energy transfer, FRET）将小分子染料和荧光蛋白串联在一起组成的染料，比如PE-Cy7、APC-Cy7、PE-Cy5.5、Percp-Cy5.5等。这些复合染料不稳定，因此在使用过程中要尽量避免高温、固定，如果固定建议冰上完成。而且还要考虑其对donor染料通道和Acceptor染料通道的溢漏（比如PE-Cy5.5中，PE为donor染料，Cy5.5为Acceptor染料）；Percp的激发光谱宽，也可以被405  nm激发，因此要注意Percp系列对405 nm下通道的溢漏；同样APC系列染料也可被561 nm激发，因此也要特别注意。而Cy5会非特异地结合到Fc受体增加假阳性，因此在在巨嗜细胞、NK细胞、单核细胞这些FcR表达高的细胞中尽量不用Cy5染料。

 

原则5    尽量用红色激光激发自发荧光高的样本

 

每种细胞都会有不同水平的自发荧光，而且自发荧光多以绿色荧光常见，而自发荧光在波长较长时迅速降低，因此尽量用红色激光激发自发荧光高的样本。比如CD14单核细胞自发荧光比较高，则可选用APC、Alexa Fluor 700等红激光激发染料。

 

根据以上五大原则进行多色流式检测配色一般是没有问题的，当然流式配色也不唯一，流式配色是否好用还需要上机进行检测，毕竟“实践才是检验真理的唯一标准”。

常见染料配色

 

四色（双激光）	六色（双激光）	八色（三激光及以上）	十色（三激光及以上）
FITC或Alexa Fluor 488	FITC或Alexa Fluor 488	FITC或Alexa Fluor 488	FITC或Alexa Fluor 488
PE	PE	PE	PE
			PE-eFluor 610
PerCP-eFluor 710或PerCP-Cyanine 5.5	PerCP-eFluor 710或PerCP-Cyanine 5.5	PerCP-eFluor 710或PerCP-Cyanine 5.5	PerCP-eFluor 710或PerCP-Cyanine 5.5
	PE-Cyanine 7	PE-Cyanine 7	PE-Cyanine 7
			Alexa Fluor 700
APC或eFluor 660或Alexa Fluor 647	APC或eFluor 660或Alexa Fluor 647	APC或eFluor 660或Alexa Fluor 647	APC-eFluor 780
	APC-eFluor 780	APC-eFluor 780	APC-eFluor 780
		eFluor 450或Super Bright 436	eFluor 450或Super Bright 436
		eFluor 506	eFluor 506

 

流式细胞仪标准激光配置参数：

 

 

流式细胞仪	UV 375nm	Violet 405nm	Blue 488nm	Yellow 561nm	Red	Near-IR 808nm
BD Accuri C6			533/30 585/40 670/LP		640nm 675/25
BD FACSAria Fusion	450/50 670/LP	450/50 525/40 610/20 660/10 710/50 780/60	530/30 695/40	582/15 610/20 710/50 780/60	633nm 670/30 730-45 780/60
BD FACSAria Ⅲ	450/50 670/LP	450/50 510/50 610/20 660/10 710/50 780/60	530/30 695/40	582/15 610/20 710/50 780/60	633nm 660/20 730/45 780/60
BD LSRFortessa		450/50 525/50 610/20 660/20 710/50 780/60	530/30 575/26 610/20 670/30 695/40 780/60		640nm 670/14 730/45 780/60
BD LSRⅡ		450/50 525/50 610/20 660/20 710/50 780/60	530/30 575/26 610/20 670/30 695/40 780/60		640nm 670/14 730/45 780/60
BC CytoFlex LX	450/45 525/40 675/30	450/50 525/40 610/20 660/10 780/60	525/40 690/50 780/60	585/42 610/20 675/30 710/50 763/43	638nm 660/10 712/25 780/60	840/20 885/40

 

8到12色几款主流机型，不同波长激光器常见通道配置，以及每个通道常用的优选荧光素：

Laser line (emission)Channel	Representative avaiable flurochromes	Instruments and collection channels
		8-colors	10-colors			＞10 colors
		FACSCanto Ⅱ（8 colors）c	FACSCanto Ⅱ（10 colors）c	Naviosd	FACSLyric（10 colors）c	FACSLyric/FACS Celesta（12 colors）c	LSR Ⅱc	LSR Fortessa X-20c
Violet(≈405nm)
VL1	PacB,HV450,BV421,eFluor450,VioBlue,SB436	★	★	★	★	★	★	★
VL2	PacO,HV500C,DC515,BV510,eFluor506,KrO,VioGreen,BV480	★	★	★	★	★	★	★
VL3	BV570						★
VL4	BV605,SB600		★			★	★	★
VL5	BV650,SB645						★	★
VL6	BV711,SB702					★	★	★
VL7	BV785,SB780					★	★	★
Blue（≈488nm）
BL1	FITC,AF488,BB515,eFluor520，Vio515	★	★	★	★	★	★	★
BL2	PE,eFluor570	★	★	★	★	★	★
BL3	PE TR/ECD,PE CF594,PE Dazzle594,PE eFluor610,PEVio615,PE DyLight594			★			★
BL4	PE Cy5/Tricolor,PE Cy5.5,PerCP,PerCP Cy5.5	★	★	★	★	★	★	★
BL5	PE Cy7,PE AF750,PEVio770	★	★	★	★	★	★
Yellow-Green(≈561nm)b
YGL1	PE
YGL2	PE TR/ECD,PE CF594,PE Dazzle594，PE eFluor610,PEVio615,PE DyLight 594
YGL3	PE Cy5/Tricolor
YGL4	PE Cy5.5,PEVio700
YGL5	PE Cy7
Red（≈633nm）
RL1	APC,AF647，eFluor660,Vio647	★	★	★	★	★	★	★
RL2	AF700,APC AF700，APC R700		★	★	★	★	★	★
RL3	APC Cy7,APC H7,APC C750,APC AF750, APC Fire750,APC eFluor780,APC Vio770	★	★	★	★	★	★	★

 

8到12色推荐荧光素搭配：

8-color configuration

VL1a

VL2b

BL1c

BL2

BL4

BL5

RL1

RL3c

BV421

BV510

FITC

PE

PerCP Cy5.5

PE Cy7

APC

APC H7

10-color configuration

VL1a

VL2b

VL4

BL1

BL2

BL3

BL4

BL5

RL1

RL2

FACSCanto/FACS Lyric 10-color optical configuration

BV421

BV510

BV605

FITC

NAVIOS optical configuration

BV421

BV510

FITC

12-color-3 laser(VL5,BL5,RL3)configuration

VL1a

VL2b

VL4

VL5

VL6

VL7

BL1

BL2

BL4

BL5

RL1

RL2

FACS Lyric 12-color optic configuration

BV421

BV510

BC605

BV711

BV785

FITC

PE

PerCP Cy5.5

PECy7

APC

APC AF700

12-color-4 laser(VL6,BL2,YL5,RL3)configuration

VL1a

VL2b

VL4

VL5

VL6

VL7

BL1

BL4

YGL1

YGL2

YGL5

RL1

RL2

RL3d

Option 1

BV421

BV510

BV605

BV711

FITC

PerCP Cy5.5

PE

PE CFG594

PE Cy7

APC

APC AF700

APC H7

Option 2

BV421

BV510

BV650

BV785

FITC

PerCP Cy5.5

PE

PE CFG594

PE Cy7

APC

APC AF700

APC H7

 

 

 

 

eBioscience™ Super Bright 染料是在紫色激光 (405 nm) 下被激发,按照发射波长命名的一系列基于荧光聚合物和串联物的荧光基团。这些Super Bright 染料由于其亮度高，可更好地鉴别模糊亚群，其抗体偶联物能为您多色检测Panel设计提供更多选择，并扩展您的紫色激光应用范围。

Super Bright 染料与Brilliant Violet的比较

 

- 都是由紫色激光激发染料

- Super Bright 流式抗体亮度与Brilliant Violet相同

- 两者在所有流式细胞术中使用方法相同，不需特别调整染色步骤

- 联合使用两个多聚染料需使用Super Bright staining buffer减少多聚染料间的非特异性结合

 

Super Bright 染料聚合物选择指南

 

染料	Super Bright 436	Super Bright 600	Super Bright 645	Super Bright 702	Super Bright 780
可替换染料	Brilliant Violet™ 421	Brilliant Violet™ 605	Brilliant Violet™ 650	Brilliant Violet™ 711	Brilliant Violet™ 786
亮度	相当于 Brilliant Violet™ 421 比 eFluor 450 或是 Pacific blue 亮	相当于Brilliant Violet™ 605 比Pacific Orange 亮	亮度略亮于Brilliant Violet™ 650	相当于Brilliant Violet™ 711	亮度略亮于Brilliant Violet™ 786 或 Brilliant Violet™ 785
激发波长	violet (405 nm)	violet (405 nm)	violet (405 nm)	violet (405 nm)	violet (405 nm)
发射波长	436 nm	600 nm	645 nm	702 nm	780 nm
建议的带通滤片	450/50	610/20	660/20	710/50	780/60
了解更多	查看Super Bright 436染料详细信息	查看Super Bright 600染料详细信息	查看Super Bright 645染料详细信息	查看Super Bright 702染料详细信息	查看Super Bright 780染料详细信息
比较数据	查看数据	查看数据	查看数据	查看数据	查看数据

 

寻找相应染料的抗体：

 

- Super Bright 436  替代Brilliant Violet 421 (BV421)

- Super Bright 600  替代Brilliant Violet 605 (BV605)

- Super Bright 645  替代Brilliant Violet 650 (BV650)

- Super Bright 702  替代Brilliant Violet 711 (BV711)

- Super Bright 780  替代Brilliant Violet 786 (BV786)

仅用于科研

利用荧光结合抗体标记细胞表面标记物，进行流式细胞分析后，可以根据细胞谱系和发育阶段确定细胞亚群及其功能。这些表面标记物具有不同的形式和功能，包括可溶性和细胞结合位点的受体，离子通道、糖蛋白、磷脂等。例如，CD4就是一种辅助性T细胞的表面标记物，而且可以根据其它趋化因子受体和分化抗原簇（CD）的表达进一步区分出CD4 T细胞不同的细胞亚群。被抗体染色的活细胞可以根据其独特的表型进行分选，用于其它实验。

一般注意事项 为使荧光结合抗体性能达到最佳，应在2-8°C避光保存，切勿冷冻。 使用之前应快速离心抗体瓶，确保抗体在管底部，不建议涡旋抗体瓶。 除抗体说明中明确指出以外，全部染色均在冰块或2-8°C下完成，且尽量避光。 如果用荧光结合抗体染色后需要短暂贮存样本，可以将样本贮存在IC固定液(# 00-8222)中。方法是将100 μL样本加入100 μL IC固定液或者2 mL一步法固定/裂解液(#00-5333)。样本可以在这两种溶液中2-8°C避光保存3天。 注：当使用IC固定液 (#00-8222)或一步法固定/裂解液(#00-5333)贮藏样本时，其对偶联染料（如APC-eFluor 780或PE-Cy7）的亮度或能量共振转移（FRET）的效率以及荧光补偿的影响很小。固定液的质量差别可影响荧光染料亮度或FRET效率。尽管我们能得出固定后荧光染料性能的一些普遍规律，但固定可能对某些隆号的抗体染色产生一定影响。 注：建议在固定样本前用细胞活性染料（FVD）染色，这样可以在流式细胞分析的过程中为活细胞设门。

 

细胞表面蛋白染色 - 方案A：单细胞悬液样本

试剂耗材：

& 12 x 75 mm流式管，或96孔U形或V形底微孔板

& 一抗（直标或纯化抗体）

& 二级试剂（用于间接染色）

& FcR封闭剂：纯化抗小鼠CD16/CD32(# AM1016010)或纯化人Fc受体结合抑制剂(#AH1016010)

& 流式细胞染色缓冲液(#222026)

& [可选] 细胞活性染料：

- 7-AAD活性染料(#00-6993)

- 碘化丙啶PI染料(#00-6990),

- 可固定的活性染料（FVD）eFluor® 455UV (#65-0868), eFluor® 450 (#65-0863), eFluor® 506 (#65-0866), eFluor® 520 (#65-0867), eFluor® 660 (#65-0864), eFluor® 780 (#65-0865)

 

实验步骤

 

注：抗体结合动力学与温度有关。在冰上染色所需孵育时间较长。而且，一些抗体需要用到非标准方式孵育会在说明书上描述。

1. 制备单细胞悬液。

2. [可选]阻止Fc受体介导的非特异性结合：

小鼠细胞：染色前，每100 μL细胞标本加入2-5 uL抗小鼠CD16/CD32纯化抗体，在2-25°C温度下预先孵育细胞10-20分钟。

人细胞：染色前，每100 μL细胞标本加入5 uL人Fc受体结合抑制剂，在2-25°C温度下预先孵育细胞10-20分钟。

3. 每管或每孔加入50 μL细胞悬液（10⁵-10⁸细胞）。

4. 将每种抗体按照推荐使用量混合于流式染色缓冲液中，使染色液的终体积达到100 μL(例如，50 μL细胞加入50 μL抗体混合液)，轻轻涡旋以混合均匀。

注：纯化或生物素结合的一级抗体直接至第8步。

5. 2-8°C或冰上避光孵育至少30分钟。

6. 加入流式细胞染色缓冲液洗涤细胞。每支流式管加入2 mL，或微量孔板的每个微孔加入200 μL。室温400-600xg离心5分钟。弃上清。

7. 重复第6步。

注：如果所有抗体为荧光直标，则直接至第14步。

8. 在2-8°C或冰上孵育60分钟。

9. 加入流式细胞染色缓冲液洗涤细胞。每支流式管加入2 mL，或微量孔板的每个微孔加入200 μL。室温400-600xg离心5分钟，弃上清。

10. 重复第9步。

11. 使用100 μL流式细胞染色缓冲液稀释适量的荧光染料标记二抗，然后加入细胞。2-8°C或冰上避光孵育至少30分钟。

12. 加入流式细胞染色缓冲液洗涤细胞。每管加入2 mL，或微量孔板的每个微孔加入200 μL。室温400-600xg离心5分钟，弃上清。

13. 重复第12步。

14. [可选]依照相应的“细胞活性染料方案”，对细胞染色以区分死活细胞。

15. [可选]对于分析之前贮藏的样本，可以100 μL流式细胞染色缓冲液中重悬细胞，加入100 μL IC固定液或2 mL一步法固定/裂解液。

注: 细胞可以在2-8°C避光保存3天。

16. 在适量的流式细胞染色缓冲液中重悬细胞。

17. 使用流式细胞仪分析样本。

 

细胞表面蛋白染色 - 方案B：人全血裂解样本

 

利用荧光结合抗体染色全血之后，10X红细胞裂解液（多物种）或一步法固定/裂解液（10X）均能用来裂解红细胞。另外，一步法固定/裂解液（10X）可以在裂解红细胞的同时固定白细胞。如果在染色前用一步法固定/裂解液裂解全血细胞，则确定染色的抗体能识别出感兴趣抗原上的被固定过的表位。关于固定/破膜对不同抗体克隆的影响，联系010-57438396。

试剂和耗材

& 10X红细胞裂解液（多物种） (# 00-4300)或一步法固定/裂解液（10X） (#00-5333)

注：使用之前，必须将10X红细胞裂解液（多物种）和一步法固定/裂解液（10X）稀释为1X。方法是取1体积的缓冲液，加入9体积室温的试剂级水。

& 12 x 75 mm流式管

& 一抗（荧光直接结合或纯化）

& 二级试剂（用于间接染色）

& FcR封闭剂：纯化的人Fc受体结合抑制剂 (#AH1016010)

& 流式细胞染色缓冲液(#222026)

&  [可选]细胞活性染料：

- 7-AAD活性染料(#00-6993)

- 碘化丙啶PI染料(#00-6990),

- 可固定的活性染料（FVD）eFluor® 455UV (#65-0868), eFluor® 450 (#65-0863), eFluor® 506 (#65-0866), eFluor® 520 (#65-0867), eFluor® 660 (#65-0864), eFluor® 780 (#65-0865)

 

实验步骤

 

注：抗体结合动力学与温度有关。在冰上染色所需孵育时间较长。而且，一些抗体需要用到非标准方式孵育会在说明书上描述。

1. 每管加入100 μL全血。

2. [可选]每100 μL全血加入5 μL纯化的人Fc受体结合抑制剂，阻断非特异性Fc受体介导的非特异性结合。2-8°C室温孵育10-20分钟。

3. 将每种抗体按照推荐使用量混合于流式染色缓冲液中，使最终染料的体积为50 μL，并加入细胞。脉冲式轻轻地涡旋混匀。

4. 室温避光孵育20-30分钟。

注：如果所有抗体都是荧光直标抗体，则直接至第7步。

对于纯化或者生物素标记抗体：

5. 加入2 mL流式细胞染色缓冲液洗涤细胞。室温400-600xg离心5分钟。弃上清。

6. 使用100 μL流式细胞染色缓冲液稀释适量的荧光标记二级试剂，然后加入细胞。2-8°C或冰上避光孵育15-30分钟。

7. 不要洗涤细胞，加入2 mL新制备的1X红细胞裂解液并轻轻涡旋混匀。室温下孵育10-20分钟。注意避光。

注：如果使用10X红细胞裂解液（多物种）(# 00-4300)，孵育时间不能超过20分钟。

8. 室温400-600xg离心5分钟，弃上清。

9. 加入2 mL流式细胞染色缓冲液，室温400-600xg离心5分钟。弃上清。

10. 重复第9步。

11. [可选]对于用10X红细胞裂解液裂解的细胞，依照相应的“细胞活性染料方案”，染色细胞以区分死活细胞。

注：活性染料（例如：碘化丙啶或7-AAD）不能用于使用一步法固定/裂解液裂解的细胞，因为固定会导致细胞破膜。细胞活性染料（FVD）可以在使用一步法固定/裂解液之前对全血细胞染色。

12. 在适量的流式细胞染色缓冲液中重悬染色的细胞。

13. 使用流式细胞仪分析样本

 

红细胞裂解 使用10×红细胞裂解液（00-4300）裂解正常人外周血细胞。

 

 

简介

改进的基本免疫荧光染色和流式细胞分析操作步骤可用于在单细胞水平上同时流式分析细胞表面分子和胞内抗原。 通常，细胞用甲醛固定以稳定细胞膜，然后用破膜剂或酒精透化，使得胞内抗原的抗体可以在细胞内进行染色。 细胞内蛋白染色时，重要的是要考虑它们的位置。因为这可能决定了如何选择最优的操作步骤和缓冲系统。 例如，核蛋白和许多转录因子与Foxp3 /转录因子染色液组合（货号00-5523）配合较好，而分泌蛋白如细胞因子和趋化因子搭配细胞内固定和破膜缓冲液组合（货号88-8824）很好。 最后，有几种磷酸化的信号蛋白可能用前面提到的两种缓冲系统都不起作用，但可与固定/甲醇方案一起使用。 应根据经验确定不同缓冲系统和方案中的抗体性能。

细胞内抗原染色操作步骤 （本文介绍三种染色方案供参考）

---

操作步骤A： 两步法：细胞内（细胞质）蛋白质

操作步骤B： 一步法：细胞内（核）蛋白质

操作步骤C： 固定/甲醇的两步法 （磷酸化信号蛋白的固定染色方案）

一般注意事项

 

1. 为了获得荧光抗体的最佳性能，请将抗体4°C避光保存。 切勿冷冻。

2. 使用前，快速离心抗体以恢复最大体积。 不建议涡旋抗体。

3. 除非操作步骤中注明，否则所有染色操作应在冰上或在4°C下进行并尽可能避光。

4. 细胞内抗原检测所需的固定和破膜步骤可改变细胞的光散射性质，并可能增加非特异性背景染色。 在染色液中加入额外的蛋白质，如BSA或胎牛血清（FCS），可能有助于减少非特异性背景。 建议使用可固定细胞活性染料（FVD）来帮助消除分析过程中的死细胞。

    

操作步骤 A： 两步法：细胞内（细胞质）蛋白质

 

以下操作步骤允许在单细胞水平同时分析细胞表面分子和细胞内抗原。 在该操作步骤中，固定步骤之后是破膜，在细胞膜上穿孔，这需要在所有后续步骤中持续存在破膜液。 这使得抗体可以进入细胞的胞质。 因此，所有细胞内染色必须在存在破膜液的条件下进行。

该操作步骤推荐用于体外或体内活化后个体细胞中的胞浆蛋白、细胞因子或其他分泌蛋白的检测。 对于细胞因子检测来说，细胞因子产生的适当刺激条件和动力学会根据细胞类型和待测定的特定细胞因子而变化。 例如，为了刺激T细胞产生IFN-γ、TNF-α、IL-2 和IL-4，可以使用PMA（佛波醇酯，蛋白激酶C激活剂）和离子霉素（钙离子载体）的组合或抗-CD3抗体。 为了诱导单核细胞产生IL-6、IL-10或TNF-α，可以使用脂多糖（LPS）刺激。 对于细胞的体外刺激，在刺激操作步骤的最后几小时期间，必须用蛋白质转运抑制剂（例如莫能菌素或布雷菲德菌素A溶液）阻断细胞因子的分泌。 建议研究人员评估不同蛋白质转运抑制剂在其特定检测系统中的用途和功效。

对于核蛋白如转录因子的检测，请参见下面的操作步骤B： 一步法：细胞内（核）蛋白。 对于一些磷酸化的信号分子如MAPK和STAT蛋白的检测，可能优选使用下面的操作步骤C： 两步法： 固定/甲醇。

 

材料

 

&12x75 mm圆底试管

& 可固定的活性染料（FVD）eFluor® 455UV (#65-0868), eFluor® 450 (#65-0863), eFluor® 506 (#65-0866), eFluor® 520 (#65-0867), eFluor® 660 (#65-0864), eFluor® 780 (#65-0865)

& 荧光偶联抗体

& 细胞内固定和破膜缓冲液组合（货号88-8824）

& 流式细胞分析染色液（货号222026）

& 细胞刺激混合剂（加上蛋白质转运抑制剂）（500X）（货号00-4975）或蛋白质运输抑制剂混合剂（500X）（货号00-4980）或布雷菲德菌素A溶液（货号00-4506）或莫能菌素溶液（货号00-4505）

缓冲液和溶液制备 

- 将1份10X浓缩液与9份蒸馏水混合，制备1X破膜液工作液。 每个样品需要8.5 mL 1X的破膜液。

 

12 x 75 mm管的实验步骤

 

1.制备单细胞悬液。

2.[可选]使用可固定化细胞活性染料对细胞进行染色。 有关详细信息，请参阅活性染料染色。

3.对细胞表面标记进行染色。 有关详细信息，请参阅细胞表面靶标染色。

4.最后一次洗涤后，弃上清并脉冲涡旋样品以完全解离细胞团块。 通常保留约100 μL残余体积。

5.添加100μL IC固定液来固定细胞，之后涡旋混合。

6.在室温下孵育20-60分钟。 避光。

7.加入2 mL 1X透化液，在室温下400-600 x g 离心5分钟。 弃上清。

8.重复第7步。

9.将细胞沉淀重悬于100μL 1X透化液中。 加入推荐量的直接偶联的一抗以检测细胞内抗原，并在室温下孵育20-60分钟。 避光。

10.加入2 mL 1X破膜液，在室温下400-600 x g离心5分钟。 弃上清。

11.重复第10步。

12.将染色细胞重悬于适当体积的流式细胞术染色液中。

13.通过流式细胞术分析样品。

 

96孔板实验步骤

 

1.制备单细胞悬液。 

2.[可选]使用可固定化细胞活性染料对细胞进行染色。 有关详细信息，请参阅活性染料染色，操作步骤C最佳操作步骤。

3.对细胞表面标记进行染色。 有关详细信息，请参阅细胞表面靶标染色，操作步骤A最佳操作步骤。

4.最后一次洗涤后，弃上清并脉冲涡旋样品以完全解离细胞团块。 通常保留约100 μL残余体积。

5.每孔添加200μL IC固定液来固定细胞。 最好使细胞完全重悬于添加的溶液中。 可选择移液。

6.在室温下孵育20-60分钟。 避光。

7.室温下400-600 x g离心样品5分钟。 弃上清。

8.每孔中加入200 μL 1X破膜液，室温下400-600 x g离心样品5分钟。 弃上清。

9.在剩余体积中重悬沉淀，用1X透化液将体积调节至约100 μL。

10.[可选]直接向细胞中加入2 μL 2％正常小鼠/大鼠血清封闭。 室温孵育15分钟。

11.不洗涤，加入推荐量的直接偶联抗体以检测细胞内抗原，并在室温下孵育30分钟以上。 避光。

12.每孔中加入200μL 1X破膜液，室温下400-600 x g离心样品5分钟。 弃上清。

13.重复第13步。

14.将染色细胞重悬于适当体积的流式细胞术染色液中。

15.通过流式细胞术分析。

 

操作步骤B： 一步法：细胞内（核）蛋白质 

 

以下操作步骤可以在单细胞水平同时分析细胞表面分子和细胞内抗原，包括核抗原。 该操作步骤将固定和破膜结合到一个步骤中。 推荐用于检测核抗原如转录因子，但也可用于检测许多细胞因子。 有关Foxp3 /转录因子染色液组合（货号00-5523-00）与细胞因子抗体的兼容性，请参阅抗体固定注意事项以得到更好的抗体克隆性能。

 

材料

 

& 12 x 75 mm圆底试管或 96孔V型或U型底微量滴定板

& [可选]可固定的活性染料（FVD）eFluor® 455UV (#65-0868), eFluor® 450 (#65-0863), eFluor® 506 (#65-0866), eFluor® 520 (#65-0867), eFluor® 660 (#65-0864), eFluor® 780 (#65-0865)

& [可选]正常小鼠血清（货号554401）

& [可选]正常大鼠血清（货号555501）

& 荧光偶联抗体

& Foxp3 /转录因子固定破膜染色液组合（货号00-5523）

& 流式细胞分析染色液（货号222026）

缓冲液和溶液制备

- 将1份4×Foxp3固定/破膜浓缩液(#00-5123)与3份Foxp3 固定/破膜稀释剂(#00-5223)混合，制备新鲜的Foxp3固定/破膜工作液。 如果在管中染色，则每个样品需要1 mL工作液。

- 将1份10×破膜透化液（#00-8333）与9份蒸馏水混合，制备1×破膜液工作液。 如果在管中染色，则每个样品需要8.5 mL工作液。

 

12 x 75 mm管的实验步骤

 

1.制备单细胞悬液。 请参阅流式细胞细胞制备最佳操作步骤。

2.[可选]使用可固定细胞活力染料对细胞进行染色。 更多详情请见“活力染料染色”

3.对细胞表面标记进行染色。 有关详细信息，请参阅细胞表面靶标染色，操作步骤A。

4.最后一次细胞悬液洗涤后，弃上清并脉冲涡旋样品以完全解离沉淀。 通常保留约100 μL残余体积。

5.向每个管中加入1 mL Foxp3固定/破膜工作溶液并脉冲涡旋

6.2-8°C或室温孵育30-60分钟。 避光。 （小鼠样品可在 2-8°C遮光孵育长达18小时）。

7.每管加入2 mL 1×破膜工作液，在室温下400-600× g离心样品5分钟。 弃上清。

8.[可选]重复第7步。

9.在剩余体积的1×破膜液中重悬沉淀。 通常为100 μL。

10.[可选]直接向细胞中加入2 μL 2％正常小鼠/大鼠血清封闭。 在室温下孵育15分钟。

11.不洗涤，加入推荐量的荧光偶联抗体以检测细胞内抗原，并在室温下孵育30分钟以上。 避光。

12.每管加入2 mL 1×破膜液，在室温下400-600× g离心样品5分钟。 弃上清。

13.重复第12步。

14.将染色细胞重悬于适当体积的流式细胞染色液中。

注意：此时不建议将细胞储存于4℃，第二天进行流式检测。主要原因在于由于胞内蛋白已经做了固定透化，如果放入4度保存，不是马上上机，里面的内溶物会流出，造成结果的差别很大。因此固定过夜保存针对表面蛋白染色。可以在表面蛋白染色固定后，第二天胞内蛋白进行透化，直接上机。

15.通过流式细胞仪分析样品。

 

96孔板实验步骤

 

1.制备单细胞悬液。 请参阅流式细胞细胞制备最佳操作步骤。

2.[可选]使用可固定细胞活性染料对细胞进行染色。 更多详情请见“活力染料染色，操作步骤 C”

3.对细胞表面标记进行染色。 有关详细信息，请参阅细胞表面靶标染色，操作步骤A。

4.最后一次洗涤后，弃上清并脉冲涡旋样品以完全离解沉淀。

5.每孔加入200 µL Foxp3固定/破膜工作溶液。 最好使细胞完全重悬于添加的溶液中。 可选择移液。

6.2-8°C或室温孵育30-60分钟。 避光。 （小鼠样品可在 2-8°C遮光孵育长达18小时）。

7.在室温下400-600 x g 离心样品5分钟。 弃上清。

8.每孔加入200 µL 1X破膜液，在室温下400-600 x g 离心样品5分钟。 弃上清。

9.重复第8步。

10.在剩余体积中重悬沉淀，用1X破膜液将体积调节至约100 μL。

11.[可选]直接向细胞中加入2 μL 2％正常小鼠/大鼠血清封闭。 在室温下孵育15分钟。

12.不洗涤，加入推荐量的直接偶联抗体以检测细胞内抗原，并在室温下孵育30分钟以上。 避光。

13.每孔加入200 µL 1×破膜液，在室温下400-600 x g 离心样品5分钟。 弃上清。

14.重复第13步。

15.将染色细胞重悬于适当体积的流式细胞染色液中。

16.通过流式细胞仪分析。

 

操作步骤C： 固定/甲醇的两步法

 

以下操作步骤允许同时分析细胞表面分子和一些细胞内磷酸化信号蛋白。 在该操作步骤中，固定之后用甲醇处理细胞。 对于磷酸化蛋白质检测，合适的磷酸化刺激条件和动力学将根据细胞类型和所测定的特定信号传导事件而变化。 例如，为了诱导磷酸化-STAT1（Y701）的磷酸化，可以用 IFNγ 激活巨噬细胞，而在 T 细胞中诱导磷酸化-ERK1 / 2（T202 / Y204）则响应于PMA（佛波酯和蛋白激酶C激活剂）或抗CD3交联。

一般注意事项

1.荧光偶联的抗体可用于染色表面蛋白质，用于免疫表型分析细胞，进一步分析磷酸化蛋白质；但是，有必要考虑染色的其他考虑因素。

• 活细胞上表面标志物的抗体染色可能改变信号蛋白的表达，因为可能刺激/抑制信号传导事件。 因此，在细胞刺激之前不建议进行表面染色。 相反，表面蛋白染色可与细胞内蛋白质染色相同的步骤。 请注意，除了表面定位之外，一些蛋白质也将具有细胞内的库，这些应该考虑。 识别固定细胞/抗原决定簇的表面蛋白的抗体克隆需要评估和使用。 有关抗体克隆性能，请参阅抗体固定注意事项。

• 如果在固定前需要表面染色（由于固定引起的抗原决定基破坏），只有当偶联的荧光染料对甲醇暴露有抗性时，才能在固定/甲醇步骤之前用荧光染料偶联的抗体染色细胞（参见下表）。

耐甲醇荧光染料	甲醇敏感荧光染料
Alexa Fluor 488	PE
eFluor 660	PE-tandems
Alexa Fluor 647	PerCP
eFluor 450	PerCP-tandems
FITC	APC
	APC-tandems

2.对于贴壁细胞，我们建议将细胞固定在平板/孔中。 固定后，刮下细胞或用EDTA溶液处理进行收获并继续操作步骤。 如果不需要表面染色或表面染色蛋白对胰蛋白酶消化具有抗性，可以使用胰蛋白酶。

 

材料

 

& 12 x 75 mm圆底试管或96孔V型或U型底微量滴定板

& 自选组织培养基

& 自选细胞刺激剂

& 一抗（荧光直标）

& 流式细胞分析染色液（货号222026）

& IC固定液（货号00-8222）

& 90-100％甲醇（HPLC 级）

& [可选]Fc封闭： 纯化的抗小鼠CD16/CD32（货号 AM1016010）或纯化的人FC受体结合抑制剂（货号AH1016010）

 

实验步骤

1.在合适的培养基中制备用于刺激的目标细胞。

2.细胞计数，以1-5×10 6个细胞/ mL在合适的培养基中重悬。

3.37°C 下，在需要的时间点用适当的处理来刺激细胞。 记住在 37°C孵育未处理的细胞作为阴性对照。

4.[可选]如果在固定之前需要表面染色（在步骤5中），则使用与抗甲醇荧光染料偶联的抗体，如“流式细胞细胞表面靶标染色操作步骤”中所述来染色细胞表面抗原

5.在刺激期结束时，通过将等体积的IC固定液直接添加到细胞中并涡旋混合来固定细胞以停止刺激。

6.在室温下孵育样品10-60分钟。 避光。

7.在室温下400-600 x g 离心样品5分钟。 弃上清。

8.将细胞沉淀重悬于剩余体积中，加入1 mL预冷的90-100％甲醇。 涡旋混合并在2-8°C下孵育至少30分钟。

  注意： 一旦加入甲醇，细胞可以在<-20°C下储存长达4周。

9.用过量体积的流式细胞染色液洗涤细胞

10.在室温下400-600 x g离心细胞5分钟。 弃上清。

11.用流式细胞染色液以1x10 7个细胞/ mL重悬细胞，并将1x10 ⁶个细胞（100μL）等分到单独的流式管中。

12.[可选] 在染色前，使用纯化的抗小鼠CD16 / CD32或人Fc受体结合抑制剂封闭，可以阻断细胞的非特异性Fc介导的结合。

13.每管加入推荐量的直接偶联抗体，并在室温下孵育30-60分钟。 避光。

注意： 如果需要，可以同时进行表面染色和细胞内磷酸染色。 由于并非所有抗体克隆都与固定的抗原决定簇结合，因此请参阅“固定/破膜后抗体克隆性能”表。

14.加入2 mL流式细胞术染色液，在室温下400-600x g离心4-5分钟。 弃上清。

15.重复第14步。

16.将染色细胞重悬于适当体积的流式细胞术染色液中。

17.通过流式细胞术分析样品。

 

96 孔板实验步骤

 

1.在合适的培养基中制备用于刺激的目标细胞。

2.细胞计数，以1-5×10 ⁶个细胞/mL在合适的培养基中重悬。

3.向孔中加入含有适当刺激剂的100 μL培养基。

4.向孔中加入100 μL细胞，并在所需的时间点 37°C孵育。 记住在37°C孵育未处理的细胞作为阴性对照。

5.[可选]如果在固定之前需要表面染色（在步骤6中），则使用与抗甲醇荧光染料偶联的抗体，如“流式细胞细胞表面靶标染色操作步骤”中所述来染色细胞表面抗原

6.在刺激期结束时，通过直接向孔中加入200 μL IC固定液来固定细胞以停止刺激。

7.黑暗中在室温下孵育平板10-60分钟。 避光。

8.室温600 x g离心平板4-5分钟。 弃上清。

9.将细胞沉淀重悬于残余体积中，并向孔中加入 100 μL预冷的90-100％甲醇。 涡旋混合并在2-8°C或冰上孵育平板至少30分钟。

注意： 一旦加入甲醇，细胞可以在≤20°C下储存长达 4 周。

10.加入200 µL流式细胞术染色液，在室温下600 x g离心4-5分钟。 弃上清。

11.重复第10步

12.[可选] 在染色前，使用纯化的抗小鼠CD16/CD32或人FC受体结合抑制剂封闭，可以阻断细胞的非特异性FC介导的结合。

13.每孔加入推荐量的直接偶联抗体，并在室温下孵育30-60分钟。 避光。

注：如果需要，可以同时进行表面染色和细胞内磷酸染色。 由于并非所有抗体克隆都与固定的抗原决定簇结合，因此请参阅“固定/透化后抗体克隆性能”表。

14.加入200μl流式细胞术染色液，在室温下600×g离心4-5分钟。 弃上清。

15.重复第14步。

16.将染色细胞重悬于适当体积的流式细胞术染色液中。

17.通过流式细胞术分析样品。

 

 

 

 

 

细胞固定/破膜后往往会对抗体的标记有影响，但是不同的克隆号，影响的程度有所差别，在此我们总结了一些常用抗体克隆号受细胞固定/破膜影响的比较分析，以供大家实验参考，希望可以帮助到您的实验进展顺利。

 

IC： Intracellular Fixation
抗原	克隆号	活细胞（IC固定前）1	IC固定和破膜洗涤后1	IC固定/甲醇处理后2
人
CD3	OKT3	+++	++	+
	UCHT1	+++	+++	+++
	SK7	+++	++*	+++
CD4	OKT4	+++	+*	+/-
	RPA–T4	+++	+++*	+
	SK3	+++	+++	+
CD5	UCHT2	+++	+++	+++
CD8	OKT8	+++	+/–	–
	RPA–T8	+++	+++	+/–
	SK1	+++	+++*	+/–
CD8b	SIDI8BEE	+++	++	++
CD11a	HI111	+++	+++	+
CD11b	CBRM1/5	+	–	+++
	ICRF44	++	–	+++
CD11c	3.9	++	+*	++
CD14	61D3	+++	+++*	++
CD19	HIB19	+++	++*	+/–
CD20	2H7	+++	+++	–
CD25	BC96	+	–	+/–
CD27	O323	+++	+*	+
CD31	WM59	+++	++*	+++
CD33	p67.6	+++	+++*	+++
CD38	HB7	++	-	++
	HIT2	++	-	++
CD40	5C3	++	-	++
CD44	IM7	+++	+++	+++
CD45	2D1	+++	+++	+++
	HI30	+++	+++	+++
CD45RA	HI100	+++	+++	+++
CD45RO	UCHL1	+++	+++	++
CD56	MEM–188	+	-	+/–
	CB56	+	-	+/–
	CMSSB	++	+/–*	-
CD57	TB01	++	++	++
CD62L	DREG–56	++	-	++
CD69	FN50	+++	++	++
CD80	2D10.4	+	–	+
CD83	HB15e	++	++	++
CD86	IT2.2	+	+*	+
CD94	HP–3D9	++	++	++
CD95	DX2	+	-	+
CD127	RDR5	++	+*	++
CD161	HP–3G10	++	++*	+
小鼠
CD3	145–2C11	++	+	+/–
	500A2	+++	+++*	+++
	17A2	+++	+++	+++
CD4	GK1.5	+++	++*	+++
	RM4–5	+++	+++*	+++
CD8	53–6.7	+++	++	++
CD11b	M1/70	++	++	++++
CD11c	N418	+++	+++	++
CD19	1D3	+++	++*	-
	MB19–1	++	-	-
CD24	M1/69	+++	+++	++
CD25	PC61.5	+	-	+
	3C7	++	-	+
	7D4	++	++	+
CD39	24DMS1	+	-	++
CD44	IM7	++	++*	++
CD45	30–F11	+++	+++	+++
CD45R(B220)	RA3–6B2	+++	++	+++
CD49b	DX5	++	-	+
CD69	H1.2F3	++	-	-
CD185(CXCR5)	SPRCL5	++	-	-
GR–1	RB6–8C5	+++	+++	++
NK1.1	PK136	++	+	+
IgD	11–26c	+++	+++*	++
IgM	ll/41	++	++*	++
TCR beta	H57–597	++	++*	++
大鼠
CD25	OX39	+
犬
CD4	ykix302.9	+++	+
CD5	ykix322.3	+++	-
CD8a	ycate55.9	+++	++
CD44	ykix337.8	+++	++
CD45	ykix716.13	+++	++
CD45R	ykix753.22	+++	++
CD90	ykix337.217	+++	++
MHC Class II	ykix334.2	+++	+++

相对染色：(+++)最亮, (++) 较亮, (+) 亮, (+/–) 弱, (–) 阴性

1 使用细胞内固定&破膜液试剂盒(货号 88-8824)进行实验。细胞在室温下固定15-30分钟，然后按照“细胞内蛋白染色 - 方案A：两步法（胞内）蛋白质方案”用破膜剂洗涤。

2 细胞在室温下用50%IC固定液(货号. 00-8222)固定15-30分钟，然后按照“细胞内蛋白染色 - 方案C：固定/甲醇两步法处理方案”，利用90-100%甲醇冰上孵育30分钟。

*请注意带*号的克隆，表明长时间固定不利于染色。