四甲基罗丹明甲酯(TMRM)或相关TMRE（四甲基罗丹明乙酯）是小的、细胞可渗透性染料，可积聚在活性线粒体中。如果细胞健康，线粒体功能正常，则信号很亮。当线粒体膜电位下降时，TMRM和TMRE积聚停止，荧光信号变弱甚至消失。该探针的最大优势是动态监测线粒体膜电位变化。TMRM和TMRE信号可以在活细胞或分离的线粒体中用传统的高内涵荧光显微镜、微孔板或流式细胞仪进行检测（图2）。

TMRM有不同规格，可满足您的凋亡检测需求。参见选择指南（表2单波长发射试剂），用于检测线粒体膜电位的动态变化。用于流式细胞分析的MitoProbe TMRM检测试剂盒包括TMRM以及CCCP，一种线粒体膜电位抑制剂和流式细胞分析的详细方案。

图2. TMRM是线粒体膜电位检测试剂盒用来检测细胞凋亡（A）Tubulin Tracker Green和Image-iT TMRM试剂标记的HeLa细胞展示出非常高的兼容性和染色特异性。图像显示多个有丝分裂活细胞与微管组装成一个有丝分裂纺锤体与微管丝，以及出现的分裂沟表明细胞质分裂完成。（B）用DMSO（对照）或500nM星孢菌素处理Jurkat细胞（人T淋巴细胞系）2小时。细胞随后在37℃用MitoProbe TMRM染色30分钟，然后洗涤再用Annexin V Pacific Blue偶联试剂进行染色。星孢菌素诱导细胞凋亡所得到的细胞群包含一群健康的MitoProbe TMRM阳性细胞和一群凋亡的Annexin V Pacific Blue阳性且MitoProbe TMRM低荧光的细胞。

阳离子碳菁染料在细胞中的积聚是对膜电位的反应。MitoProbe DiIC₁（5）试剂盒专为流式细胞分析应用而设计，它提供了远红色荧光DiIC₁（5）碳菁染料以及线粒体膜电位抑制剂CCCP。在低于100nm的浓度下，阳离子DiIC₁（5）染料积累在活细胞具有活性膜电位的线粒体中（图3）。然而，与DiOC₂（3）不同，DiIC₁（5）染料表现出单波长发射，其荧光信号随着活性线粒体的增加而增加。

MitoTracker探针是一种小的（<1kDa）细胞渗透性线粒体选择性染料，含有巯基反应性氯甲基基序，在固定后仍然维持在线粒体内。因为探针与线粒体硫醇形成共价键，所以它们只能用作终点检测活细胞上样时的线粒体膜电位，而不能实时检测线粒体膜随时间动态的变化。
 

虽然在研究线粒体结构的分析中可以标记MitoTracker后再固定细胞，但如果需要研究线粒体膜功能，强烈建议使用一些精选的MitoProbe试剂。 当比较固定后对照和处理样品的线粒体膜电位时，发现只有MitoTracker Orange CMTMRos和MitoTracker Red CMXRos在信号下降后保持一致的差异。这些单波长发射试剂可用于流式细胞分析、成像显微分析和高内涵分析（图4和图5）。

参见以上MitoTracker选择指南，以确定哪种MitoTracker最适合您的实验。

图5. 使用MitoTracker Orange CMTMRos定量线粒体膜电位。A549或HeLa细胞在GIBCO minimal essential培养基(MEM)和Nunclon Sphera孔板中培养超过2天以形成球体。在正常细胞培养条件下，用DMSO或一系列不同浓度的氯硝柳胺处理样品24小时，然后用250nM MitoTracker Orange和2.5uM CellEvent Caspase 3/7绿色试剂在37℃下标记30分钟。 使用Thermo Scientific CellInsight CX7 LZR高内涵成像系统采集图像，然后使用HCS Studio软件V 2.0进行图像分析。结果显示，线粒体膜电位下降（橙色）和凋亡细胞死亡增加（绿色）是氯硝柳胺剂量依赖的，上图是定性结果，下图是剂量反应与平均信号强度的定量结果。
 

HCS线粒体健康检测试剂盒是为通过在同一个孔中同时检测两个细胞健康参数而开发的：有丝分裂毒性和细胞毒性检测有96孔板规格的。MitoHealth染料在活细胞的线粒体中集聚，与线粒体膜电位成正比（图6）。用Image-iT DEAD Green Viability Stain检测细胞毒性。Image-iT DEAD Green Viability Stain对DNA具有高亲和力，并形成高亮度且稳定的染料-核酸复合物；当不与DNA结合时，它没有荧光。

图6. 使用HCS线粒体健康检测试剂盒对缬氨霉素处理过的HeLa细胞进行成像，分析有丝分裂毒性和细胞毒性。9面板图像显示HeLa细胞（未经处理，用165 nm或120μM缬氨霉素处理）用下列之一染色：Hoechst 33342，细胞膜通透性染色或线粒体膜电位染色

MitoSOX Red和Green线粒体超氧化物指示剂是荧光试剂，专为高选择性检测健康活细胞线粒体中的超氧化物而设计（图 7 和 8）。 这些试剂很容易被超氧化物氧化，但不会被其他活性氧 (ROS) 或活性氮 (RNS) 氧化，并且超氧化物歧化酶可防止探针氧化（图 9 和 10）。 MitoSOX Red 指示剂被超氧化物氧化后会在约 400 nm 处产生荧光激发峰，该峰在其他活性氧产生的激发光谱中不存在。 因此，400 nm 处的荧光激发和约 590 nm 处的发射检测可将超氧化物与其他活性氧区分开来。 MitoSOX Green 指示剂可以使用传统的 FITC/GFP 滤光片组进行检测。 对于超氧化物的选择性检测，采用 488 nm 激发（510 nm 发射）。

图9. 无细胞环境中 MitoSOX Green (MSG) 和 MitoSOX Red (MSR) 线粒体超氧化物指示剂的选择性。无细胞系统用于产生活性氧（ROS）。 将每种 ROS 分别添加到 10 µM MSG 和 MSR溶液中，并在室温下孵育 30 分钟。将 DNA 添加到含有 MSR 的溶液中。 超氧化物歧化酶用作超氧化物的阴性对照。 使用超氧化钾生成用在 MSG 上的超氧化物，使用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统生成用在MSR上的超氧化物。 结果表明，MSG 和 MSR 对超氧化物具有选择性，对其他活性氧没有选择性。

图10. 可视化葡萄糖介导的氧化应激。将人骨肉瘤（U2OS）活细胞置于Minimum Essential 培养基（MEM）中，并在37℃下用CO₂孵育过夜。为了减轻高糖介导的氧化应激，用PBS洗涤样品B-D，然后添加低糖的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），并在37℃下用CO₂孵育过夜。然后用Hanks平衡盐溶液（HBSS）洗涤样本，然后按如下处理30分钟：（A、B）细胞保留在HBSS中；（C）细胞在HBSS+100μM抗霉素A中孵育；（D）细胞在HBSS+100μM DEANO中孵育。向每个样品中加入5μM的MitoSOX红色试剂，将细胞孵育30分钟，并用成像。多面板图，未经高糖培养基处理的细胞用红色和蓝色荧光染色，与未经高糖处理的细胞和经一氧化氮发生器处理的细胞相比，仅显示蓝色荧光，经超氧发生器处理的细胞用红色和蓝色荧光染色。

线粒体Ca²+浓度升高在启动程序性细胞死亡（凋亡）以及其他细胞水平的过程中起着重要作用（8）。荧光探针在结合Ca²+时表现出光谱响应，使研究人员能够使用荧光显微镜、流式细胞分析和荧光光谱法研究细胞内游离Ca²+浓度的变化。 如图10所示，Rhod-2是一种荧光钙指示剂，也可用于检测线粒体Ca²+浓度（8）。Rhod-2的AM脂（Rhod-2，AM，货号R1245MP）能轻松地将染料负载到活细胞中。进入细胞后，细胞内酯酶切割AM基团，释放Rhod-2盐形式，后者结合线粒体Ca²+后发出荧光。

图11. 线粒体钙水平和动力学的多参数成像。（A）用CellLight Mitochondria-GFP和5μM Rhod-2、AM在37℃下标记HeLa细胞15分钟，成像时间超过100秒。（B–D）为区域（A）放大的图像，展示随着时间的推移，单个细胞内的单个线粒体。（C，D）当用10μM组织胺处理后，钙从内部被释放出来。Rhod-2橙红色荧光的增加揭示了线粒体紧邻钙释放的位置。（C）中的箭头表示线粒体可能损害了钙吸收，如果单独使用Rhod-2、AM检测，可能会遗漏这一细节。星号表示单个线粒体，显示钙水平暂时升高。4面板显示了用绿色荧光线粒体（靶向GFP）和rhod-2钙指示剂（也定位于线粒体）的橙色荧光染色的细胞的显微镜视图。
 

线粒体膜通透性转换孔(MPTP)是位于线粒体内外膜的非特异性通道，似乎参与细胞死亡过程中线粒体成分的释放。MPTP的开关极大地改变了线粒体的渗透性以及线粒体膜电位。这种持续孔隙激活是由线粒体Ca²+超载、线粒体谷胱甘肽氧化、线粒体活性氧水平升高和其他促凋亡条件引起的。

我们开发了两种用于检测线粒体转换孔开放的试剂盒，一种用于成像显微分析（Image-iT LIVE线粒体转换孔检测试剂盒，图11），另一种用于流式细胞分析（MitoProbe转换孔检测试剂盒，图12）。与仅依赖线粒体膜电位的检测方法相比，这两种试剂盒能直接检测线粒体膜通透性转换孔的开关。本试剂盒采用钙黄绿素的乙酰氧甲基酯(AM)（一种无色、无荧光的酯酶底物），以及钙黄绿素荧光淬灭剂CoCl₂（钴）来选择性地标记线粒体。加至细胞后，钙黄绿素AM被动扩散进入细胞，并在细胞器包括线粒体内聚集。一旦进入细胞，钙黄绿素AM可被细胞内酯酶分解并释放出极性很强的荧光染料钙黄绿素，这种荧光染料在短时间内不能大量透过线粒体膜或者细胞膜。当线粒体内钙黄绿素荧光保持稳定时，添加CoCl₂淬灭细胞质内的钙黄绿素荧光。作为对照，用钙黄绿素AM和CoCl₂同时处理的细胞也加入诸如离子酶素的Ca₂+载体（使过量的Ca²+进入细胞，激活线粒体转换孔，继而淬灭线粒体钙黄绿素荧光）。离子酶素的这一反应可被环孢素A所抑制，据报道环孢素A化合物通过抑制亲环蛋白D（cyclophilin D）阻止线粒体转换孔的形成。

图13. 用于流式细胞分析的MitoProbe转换孔检测试剂盒流式细胞分析直方图显示了各种试剂盒组分的作用。用MitoProbe转换孔检测试剂盒标记Jurkat细胞，并通过流式细胞术进行分析。（A）在缺乏CoCl₂和离子霉素的情况下，细胞质和线粒体中存在荧光钙黄绿素，产生明亮的信号。（B）在存在CoCl₂的情况下，线粒体中的钙黄绿素发出荧光信号，但细胞质钙黄绿素荧光淬灭，与图A相比，总荧光降低。（C）当离子霉素、钙离子载体和CoCl₂与钙黄绿素AM同时加入细胞时，来自细胞质和线粒体的荧光信号会大大下降。3个流式细胞术柱状图显示绿色荧光细胞数量的变化，从未处理细胞的高水平，线粒体钙黄绿素猝灭时的中等水平，到胞浆和线粒体荧光信号猝灭后的极低水平。

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