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小肠/结肠类器官研究
小肠/结肠类器官研究
1. 小肠/结肠类器官
在过去的十年中，一个重大的转变是从事肠道研究的科研工作者使用模型的变化，目前使用肠类器官进行肠上皮研究占据了重要位置。肠类器官培养物是三维（3D）体外组织模型，该模型具有体内肠道组织的许多生理学相关特征。这些特征包括：围绕功能性管腔的极化上皮层，及所有类型的肠上皮细胞都按体内肠道的比例和空间进行排列。
肠类器官的类型
原代肠组织来源的类器官
2009年，Hans Clevers实验室对于肠类器官培养体系进行了开创性的研究1，该项研究描述了一种培养体系，其中对成年肠道干细胞的干细胞niche进行了体外表征。2011年，Sato等人1发表的第一个研究方案描述了从小鼠肠组织分离出的完整的肠隐窝以及对它们随后的培养，以形成类器官。肠隐窝被嵌入Matrigel中，并在一种生长培养基中培养，该培养基含有特殊的生长因子，其目的是为了模拟体内肠隐窝基底里的信号通路。这项研究工作表明，从解离肠隐窝、通过流式挑选所获得的单一LGR5+肠道干细胞，是有可能生成能肠类器官的。该小鼠小肠培养体系被建立后，经过调整，可用于从来自人体小肠以及人体和小鼠结肠隐窝和单个肠干细胞生成类器官2,3。相对于小鼠和人体肠上皮类器官首次研发的基本培养方法，已经有了很多的进步和改良。Stemcell Technology基于Hans Clevers文献，研发了首个完全、成份确定的小鼠肠道类器官培养基（货号#06005）和人肠类器官培养基（货号#06010）。
多能干细胞来源的类器官
在引入肠道干细胞衍生的类器官培养体系之后不久，研究人员发现了一种新方法，用于将hPSCs诱导为人体肠类器官，而这种方法在很大程度上使用了与3D类器官培养的相同方法4。相比于从分离的隐窝或LGR5+肠道干细胞而生长的肠上皮类器官，hPSCs来源的肠类器官包含了间充质部分，而这有助于培养物里的肠道干细胞niche的信号通路5。人多能干细胞（PSC）衍生的小肠类器官是三维细胞培养体系，包括一层极性的单层肠上皮。顶端细胞表面围绕着中空的官腔，基底外侧细胞表面与胞外基质和产生相关肠龛因子的间充质部分相接触。这些类器官具有主要的细胞类型和肠上皮关键的功能特征，提供与体内组织直接相关的生理特性。这些类器官保持稳定扩增的干/祖细胞群，可以通过传代进行长期维持培养和扩增，或被冻存用于后续的实验。
从未经分化的细胞建立肠类器官的方案涵盖以下流程：首先将hPSCs分化为定型内胚层以及中、后肠道规格的单层培养物，通过三维培养物进行肠道诱导形成肠类器官4。有趣的是，在定向分化为后肠的培养物中，三维培养物的形成可自发性地发生；显示后肠标记物的球状细胞从单层培养物萌出芽来，而且可以轻易地从培养上清中分离出来。类似于原代组织来源的类器官，这些部分分化的球状细胞被嵌入Matrigel液滴中，并在细胞培养基中进行培养，从而促进它们分化为肠系以及随后的部分成熟4。基于Spence等2的文献，开发了STEMdiff肠类器官试剂盒（货号#05140）用于在30天内有效的从胚胎干细胞（ESCs）或诱导多能干细胞（iPSCs）构建小肠类器官。
肠类器官完全培养基
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培养基
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肠类器官 |
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IntestiCult肠类器官生长培养基（小鼠）（货号 #06005） 首个完全、且成分确定，用于培养小鼠肠类器官的生长培养基。使用该培养基，研究人员可以在五到七天的时间内轻松培养出适用于实验的、可繁殖的类器官。IntestiCult可实现对小鼠肠上皮类器官的有效建立、扩增和长期维持培养。 |
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IntestiCult肠类器官生长培养基（人）（货号 #06010） 首个完全、且成分确定，用于培养人肠类器官的生长培养基。使用该培养基不到一周的时间，即可观察到类器官， 每7到10天传代一次以进行维持培养和扩增。不同的供体样本来源的类器官均可实现肠干细胞的高效扩增。目前已有多篇发表的文献使用了该培养基。 |
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用于在30天内有效的从hPSCs构建小肠类器官 支持从多种人ES和iPS细胞系高效分化为肠类器官。本试剂盒不含血清，在已发表的配方上进行了优化，提高了类器官形成和扩增的效率和实验的重现性。 |
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肠类器官培养方法
在最初培育小鼠小肠类器官时，培养基中添加了EGF(表皮生长因子)，R-spondin-1和Noggin等生长因子2。后来发现，培养小鼠结肠类器官时，除上述三种生长因子外，还需添加Wnt-3A。然而对人类小肠及结肠类器官的研究表明，除了上述的4种生长因子(EGF，R-spondin-1，Noggin和Wnt-3A)外，还需要加入TGF-β抑制剂(A-83-01)和p38 MAP激酶抑制剂(SB 202190)2。最近的研究显示，从人胚胎干细胞(ESCs)或诱导多能干细胞(iPSCs)在体外培育得到的人小肠类器官(HIO)移植入体内后可形成有功能的成熟小肠组织。为诱导其形成定向内胚层(definitive endoderm，DE)，人ESCs或iPSCs需先用含Activin A的培养基培养，然后在含有Activin A，FGF-4以及GSK3抑制剂(CHIR 99021)的培养基中培养形成球状 体 (spheroids)。这些球状体随后被放置在Matrigel中，并用添加了EGF和Noggin的小肠生长培养基维持培养，即可产生上述的HIO。最后，研究人员将HIO移植到免疫缺陷小鼠的体内进行进一步观察6。
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Intestine肠 |
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细胞来源 |
相关细胞因子和小分子 |
相关培养基 |
文献 |
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组织 |
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组织 |
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PSC |
N/A |
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PSC |
DMEM/F12, RPMI1640, Advanced DMEM/F12 |
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PSC |
IGF1, FGF2 |
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PSC |
RPMI1640, Advanced DMEM/F12 |
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Colon结肠 |
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细胞来源 |
相关细胞因子 |
相关培养基 |
文献 |
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hAdSC |
EGF, Rspondin, Noggin, WNT3A, Nicotinamide, Gastrin, TGFβinhibitor, p38 inhibitor |
Toshiro Sato, Daniel E Stange, Marc Ferrante,et al.,Gastroenterology. 2011 |
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参考文献
1. Sato T et al. (2011) Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epitheliumGastroenterology 141(5): 1762–72.
2. Sato T et al. (2009) Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche Nature 459(7244): 262–5.
3. Jung P et al. (2011) Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells Nat Med 17(10): 1225–7.
4. Spence JR et al. (2011) Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro Nature 470(7332): 105–9
5. van de Wetering M et al. (2015) Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients Cell 161(4): 933–45
6. Watson CL, Mahe MM, Múnera J, et al. An in vivo model of human small intestine using pluripotent stem cells. Nat. Med. 2014; 20:1310-1314.
2. 人肠类器官培养试剂准备
IntestiCult™肠类器官生长培养基是一种完全的细胞培养基，可有效地建立和长期维持人肠隐窝产生的肠道细胞类器官。肠类器官为研究肠上皮提供了一种方便的体外器官培养系统成熟的肠道器官建立了突出的“芽”，类似于体内肠道隐窝。肠器官培养可应用于研究肠上皮的发育和功能，模拟肠道疾病，并进行靶向小分子筛选。肠类器官培养还可用于研究成体干细胞特性和再生治疗。
主要试剂和耗材
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货号 |
名称 |
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IntestiCult类器官培养基（#06010） |
IntestiCult类器官培养基组分A（#06011） |
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IntestiCult类器官培养基组分B（#06012） |
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含15mM HEPES DMEM/F12 培养基 |
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不含钙和镁的D-PBS |
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07174 |
GCDR细胞解离试剂 |
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Corning,#3526 |
TC-treated 24孔细胞培养板 |
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Y-27632 (2HCl), 1 mg |
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Corning,#356231 |
Corning Matrigel |
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70 µm细胞筛 |
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CryoStor CS10冻存液 |
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Trypsin-EDTA（0.05%） |
试剂准备
A. 制备完全的IntestiCult™肠类器官培养基
采用无菌技术准备完全的IntestiCult™肠类器官生长培养基（组分A+组分B）。下面的示例用于制备100 mL完整培养基。如果准备其它体积，可做相应调整。
1. 室温（15 - 25℃）或2 - 8℃过夜解冻IntestiCult™肠类器官生培养基组分A和B，混合均匀。
注：一旦解冻，须立即使用，或分装储存于-20℃（最长储存3个月）。分装后的培养基在解冻后须立即使用，不可反复冻融。
2. 向50 mL IntestiCult™ 类器官生长培养基组分B中加入50 mLIntestiCult™ 类器官生长培养基组分A，混合均匀。
注：如不立即使用，可在2 - 8℃储存最多1周。
3. 使用前加入抗生素（例如：50μg/mL庆大霉素或者100 µg/mL青霉素/链霉素)。
B. DMEM + 1% BSA
用无菌技术制备DMEM+ 1%BSA。下面的例子是制备50 mL的DMEM+ 1%BSA。如果制备其它体积，可做相应调整。
1. 在50 mL离心管中，将 2 mL 25% BSA的加入到含有15 mM HEPES的48 mL DMEM/F12（货号#36254）中。
2. 涡旋混匀，置于冰上。
注：如不立即使用，可在2 - 8℃储存最多6个月。
3. 人结肠隐窝分离和类器官传代
人结肠隐窝分离和类器官传代（Matrigel Dome培养）
开始操作之前，请阅读整个操作流程。
采用无菌技术进行以下操作。
A. 从活检样本中分离人结肠隐窝
1. 冰上融化100 µL Matrigel。
注：这足以接种多达4个培养dome。隐窝数量（B节步骤1）不同，可能需要的Matrigel量也不同。
2. 将下列试剂置于冰上：D-PBS（不含Ca和Mg）和DMEM+1%BSA（B节准备的试剂）。
3. 组织处理过的24孔培养皿置于37℃培养箱中加热至少2小时。
4. 在15 mL离心管中，用10 mL预冷的PBS清洗组织样本。让组织通过重力下沉(大约5秒)，然后吸去上清液。
5. 重复步骤4 ，留下1mL上清液在离心管中。
6. 用1mL移液器将组织和剩余的1mL上清液转移到1.5mL微型离心管中。
7. 使用无菌剪刀，将组织剪成尽可能小的碎片。用1mL移液器将组织碎片转移到一个新的15mL离心管。用PBS冲洗微型离心管并将清洗后的液体一起转移至新的离心管中。
8. 让组织碎片在重力作用下下沉(大约5秒)，然后吸去上清液。
9. 在离心管中加入10 mL的GCDR细胞解离试剂。中等速度(~40转/分)的摇床上在冰上孵育30分钟。
10. 290 x g离心5分钟，弃去上清液。
注：对于本操作流程的其余部分，在操作组织样本之前，先用DMEM+ 1%的BSA预湿移液管。这是为了防止了隐窝附着在移液管的管壁上。
11. 加入1mL冰冷的DMEM +1% BSA。为了从组织中取出隐窝，用1mL移液器上下用力吹打20次。
注：避免移液管尖接触管壁和管底。
12. 使用1mL移液管，将离心管内容物通过70 µm细胞筛（货号#352350）(向一侧倾斜)，将内容物过滤到一支新的15 mL离心管。用1mL冰冷的DMEM +1% BSA清洗原来的离心管，并将液体通过70 µm细胞筛。
B. 从分离的人结肠隐窝培养类器官
1. 按如下方式确定样本（来自于A节）中的隐窝总数：
a. 在适当的计数器皿表面（如玻璃载玻片或6孔板的一孔）上放置10µL样品的试样，做3次重复。
b. 使用倒置显微镜，对每个试样的隐窝进行计数。
c. 确定3个试样中隐窝的平均数，然后乘以200以确定2 mL样本中的隐窝总数。
d. 以一个dome中有1000个隐窝，确定能接种几个dome。
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例如： 试样1：18个 试样2：23个 试样3：19个 平均数：20个× 200=4000个 这足够接种包含1000个隐窝的4个培养dome。 注：1000个隐窝/dome将产生150-200个成熟的类器官。 |
2. 200×g离心5分钟。吸去上清液，留下100µL。
注：以下步骤用于接种4x50 µL含1000个隐窝的dome。如果根据步骤1中的计数需要更少或更多的dome，则调整Matrigel和DMEM+1% BSA的体积比为1:1的最终混合物（例如8x50µL培养dome，向样品试管中加入200 µL Matrigel和100 µLDMEM+1%BSA）。
3. 从37℃培养箱中取出24孔板。用DMEM +1%BSA预湿200 µL枪头。
4. 将100 µL Matrigel添加到样品管中。上下吹打10次重悬细胞团。避免产生气泡
5. 使用预湿的200µL枪头，吸取50 µL Matrigel-隐窝悬液，并按照下面的方式，加入到24孔组织处理过的培养板中心8孔中的其中1孔中：
a. 将移液枪在培养孔上方中心，保持垂直。将枪头靠近但不与培养孔底接触。
b. 轻压移液枪，直到在枪头的末端看到液滴为止。
c. 缓慢放下移液枪，直到液滴接触培养孔的底面。
d. 轻轻将剩余的体积分配（只到吸管上的第一站）到其它培养孔，同时把移液枪从培养孔里拿开。
注：离开冰后大约60秒内快速将Matrigel-隐窝接种。
6. 重复步骤5直到Matrigel-隐窝悬液被接种完。
7. 将培养板小心地放入37℃培养箱中。37℃孵育10分钟，使dome固化。不要扰动dome。
8. 在室温（15-25℃）下制备3 mL IntestiCult™ 类器官生长培养基（试剂准备，见A部分）。对于原代培养（类器官尚未传代），加10 µL 3mM 的Y-27632（货号#72302）（终浓度10 µM）。混合完全。
注：每个培养的dome需要750 µLIntestiCult™类器官生长培养基；3mL培养基足够培养4个dome。如果制备不同数量的dome，相应地调整培养基的体积。
9. 轻轻地，将750 µLIntestiCult™类器官生长培养基（原代养物+Y-27632）沿着培养孔壁添加到各培养孔中。请勿直接加在dome上。
10. 在没使用的培养孔中加入无菌的PBS。
11. 盖好培养板，37℃、5% CO2孵育。
12. 每2天，用IntestiCult™类器官生长培养基（无Y-27632）进行一次完全换液。
13. 进入C部分进行传代
C. 传代人肠类器官
1. 对于原代培养物，7-14天后传代。对于已经传代的类器官，每7-10天传代一次。相比小的、黑暗的、塌陷的或过度生长的芽状类器官，较大的隐窝或芽状类器官拥有的活碎片产量更高。
2. 从37℃培养箱中取出组织处理过的24孔板预热至少2小时。
3. 制备 IntestiCult™类器官生长培养基，预热到室温（15-25℃）。
注：传代1孔，需要750 µL培养基。
4. 冰上融化Matrigel，接种1孔需要25 µLMatrigel。
5. 将DMEM + 1% BSA置于冰上。
6. 小心地从要传代的每孔中吸去培养基，不要扰动Matrigel dome。
7. 在每个培养孔的dome顶部中加入1mL室温(15-25°C)的GCDR（货号#07174）。室温下孵育1分钟。
8. 用GCDR预湿1mL的枪头；用此移液枪头将Matrigel dome彻底从培养孔底刮擦下来。将GCDR在培养孔中上下吹吸2-3次，打破dome。 确保所有的Matrigel碎片从培养皿上浮起来。
注：上下吹打的时候，避免枪头碰到培养孔底部。
9. 用同样的移液枪，将类器官混合物转入15 mL离心管中。
10. 在每个新的培养孔中加入1mL GCDR。用GCDR预湿的枪头，将GCDR上下吹打2-3次冲洗培养孔。将冲洗的培养孔中的内容物转移到步骤8中的15mL离心管中。
11. 对于每个要传代的培养孔重复步骤7-9。
12. 中等速度（40转/分）的摇床上室温（15 - 25°C）孵育离心管10分钟。
13. 2-8℃，290 x g离心5分钟，轻轻倒去上清液。
14. 向每跟离心管中加入1mL预冷的DMEM+1%BSA。使用预湿的1mL枪头，通过上下吹打15次重悬类器官。
注：避免枪头碰触离心管壁和管底。
15. 用1mL移液枪，将离心管里的内容物通过70 µm的细胞筛(一边倾斜)过滤到一根新的15 mL离心管中。
有关传递流程的后续步骤，请参阅B节。
4. 人肠类器官冻存与复苏
冻存人肠类器官
本操作流程适用于每管冻存和复苏200个类器官。为达到最佳的结果，冻存应在类器官成熟（传代7-10代）后进行。
注意：肠类器官从原代建立后，至少应进行两次传代后才适宜进行冻存；为达到最佳效果，应使用成熟的并具有多芽的类器官。相比小的、暗的类器官，较大的隐窝和芽状器官会形成更高产量的碎片（图6）。
1. 将不含钙和镁离子 的PBS ，含15mM HEPES的DMEM/F-12 和CryoStor® CS10 置于冰上。
2. 使用倒置显微镜，对每孔的成熟类器官进行计数。为保证每管中含有200个类器官，可将几孔的培养物合并冻存。
3. 吸出培养孔中的IntestiCult™类器官生长培养基。加入1mL冷的 （2 – 8℃）D-PBS。
4. 使用D-PBS预先湿润1mL的枪头，上下吹打10 – 20次吹散Matrigel® 基质。将含有200个类器官的混合物转移至1个15mL的离心管，如 需要可合并几个培养孔。
5. 使用预先湿润的1mL的枪头，将1mL冷的（2 – 8℃）D-PBS加入每孔进行清洗，上下吹打5次，转移至第4步的离心管中。
6. 以290 x g，2 – 8℃离心5分钟。小心去除上清液，不要接触到沉 淀的类器官。
7. 使用7 – 10mL冰冷的含有15mM HEPES的DMEM/F-12重悬类器 官沉淀。轻柔的敲打离心管，或者使用枪头轻柔的吹打，吹散沉 淀。再以200 x g，2 – 8℃离心5分钟，小心去除上清液。
8. 使用1mL冰冷的（2 – 8℃）CryoStor CS10重悬类器官沉淀，每管冻存200个类器官。
注意： 操作迅速，尽量缩短未冻存的类器官与CryoStor CS10的 接触时间。
9. 使用同一个枪头，将含有类器官的CryoStor CS10转移至预先标 记好的冻存管中。将冻存管放入具有500mL异丙醇的细胞冻存 盒或不含IPA的冻存盒。
10. 将细胞冻存盒置于-80℃冰箱24小时后，将细胞冻存管转移至液 氮（-135℃）中进行长期的储存。肠类器官可在-135℃下冻存6个 月。不建议在-80℃进行长期储存。
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图6.人肠类器官冻存 用于冷冻保存的人类肠道器官应在其成熟后，大约7-10天后冷冻保存。为了取得最好的效果，应该使用较大的隐窝或芽状器官（红色圈）。较小的、黑暗的或塌陷的器官（蓝色圈）可能不能提供可接受的解冻后生存能力 |
肠类器官复苏
1. 冰上解冻120μL Matrigel 基质 ，将 预先配置好的完全IntestiCult类器官生长培养基预热至室温 （15~25℃）。24孔板的4个培养孔需要3.1mL完全培养基。配制完全培养基， 试剂准备。将所需的TC处 理的24孔培养板置于37℃孵箱预热 30分钟。
2. 将2mL的25% BSA母液与48mL含有15mM HEPES的DMEM/F-12 混合于一支50mL的离心管中，用于配置含有 1% BSA的DMEM/F-12清洗液。操作过程中，室温（15 – 25℃）保 存。本清洗液可于2~8℃保存6个月。
3. 将2mL含有1% BSA的DMEM/F-12加至一个15mL离心管中，放于 室温（15 ~25℃）。
注意： 为避免影响细胞活率，细胞应当马上转移至该离心管中。
4. 拿出冻存的类器官，置于37℃水浴中。当冻存液变为液体，解冻 即完全，此时应在管底观测到类器官。在37℃解冻大概需要 2~ 2.5分钟，培养物过热会影响类器官的复苏效率。
注意：解冻后立即进入下一步，以避免活力显著下降。不建议将类器官暴露于连续复苏 – 冻存的循环中。
5. 打开前，使用70%酒精或异丙醇擦拭冻存管外部。使用1mL枪头将1mL含有1% BSA的DMEM/F-12直接加入管中。上下吹打4次， 将冻存管中的内容物混匀。立即使用预先湿润的1mL枪头将冻存 管中的内容物转移至第3步的离心管中，即含有2mL 1% BSA的 DMEM/F-12。
6. 用2 x 1mL含有1％ BSA的DMEM/F-12将细胞冻存管清洗两次，然后转移到离心管中。务必清洗到细胞冻存管的整个内表面区域，包括盖子内部。
7. 以200 x g，2 – 8°C离心5分钟，去除CryoStor CS10。小心去除 上清液。避免产生气泡。如果离心后存在气泡，则在吸出上清液 体之前，先小心地吸去气泡。
8. 使用200μL枪头，加入100μL室温（15 ~25℃）的完全 IntestiCult™器官生长培养基重悬类器官。
9. 使用200μL枪头加入100μL Matrigel。上下吹打5 – 10次，混匀培养物，以确保整个样品的密度和粘度一致。避免产生气泡。
10. 使用预先湿润的200μL枪头，吸取50μL，并加入到提前预热的24 孔板其中四个孔中的中心部位。为了防止接种时出现气泡，在使 用移液枪时指压到第一段（不要按到底部）。于37℃，5％ CO2下 孵育10分钟，使Matrigel固化。
11. 使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入750μL预热至室温 （15~25℃）的完全IntestiCult™类器官生长培养基。不要将培 养基从dome上直接加入。
12. 将无菌D-PBS加至其它未接种dome的孔中。将培养板的盖子盖好，并在37℃和5％ CO2下进行培养。每周进行三次完全换液。
14. 为了获得最佳结果，解冻后应对冻存的类器官进行两次传代。冷冻后，类器官生长变慢。类器官通常在传代后5~10天进行传代 （图7）。通常类器官的生长速度应在一次传代后恢复（图7）。
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图7.肠器官解冻后迅速恢复 A. 解冻后的一天，器官较小，但看起来明亮而健康 B. 4~5天后，细胞器开始形成芽 C. 解冻后2代健康人肠道器官用于下游应用，如培养、分化或其他实验
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5. 人肠类器官分化
人肠类器官分化
本方案描述了通过建立类器官以获得高度分化细胞的方法。分化后，这些单层细胞形态变厚且具有明显柱状结构，此为肠道终末分化细胞具有的特征。请注意，按照该步骤得到的分化的类器官不含有显著的成熟干细胞群，且不能进一步扩增或传代。
A.试剂准备
下例为制备100 mL的肠类器官分化培养基（IntestiCult™ 类器官生长培养基组分 A + DMEM/F-12 with 15 mM HEPES）。如果制备其它体积，请调整相应添加物的量。
1. 在室温（15 - 25℃）或在2 - 8℃过夜解冻IntestiCult™ 肠类器官生长培养基组分A，混合均匀。解冻后须立即使用，或分装储存于-20℃ （最长储存3个月）。分装后的培养基在解冻后须立即使用，不可反复冻融。
2. 向50 mL 含15 mM HEPES的DMEM/F-12 中加入50 mL IntestiCult™ 肠类器官生长培养基组分A，混合均匀。如不立即使用，可在 2 - 8℃储存最多1个星期。
3. 使用前加入抗生素（例如：50 μg/mL庆大霉素）。 如果需要制备IntestiCult™ 肠类器官生长培养基，请参考第一部分 试剂准备。
B.肠类器官的分化
1. 建立类器官3D培养体系（见“人结肠隐窝分离和类器官传代”）。分化前，类器官最少需要经过一次传代。如果类器官是用其它培养体系建立的，则需在 IntestiCult™ 肠类器官生长培养基中至少传代三次才可以开始分化步骤。
2. 传代开始时（0天），根据标准操作步骤接种于 IntestiCult™ 肠类器官生长培养基（将组分A和组分B以1：1混合）。在37℃ 和5%的CO2条件下培养。
3. 在第2天和第4天使用 IntestiCult™ 肠类器官生长培养基进行完全换液。
4. 在第5天，将培养基换成肠类器官分化培养基（ IntestiCult™ 肠类器官分化培养基）以开始分化。在37℃和5% 的CO2条件下进行培养。
注：根据类器官的生长尺寸和状态不同，可将分化前的维持培养阶段延长到9天（图1）。如果类器官在培养9天后还没有达到适合分化的状态，则每隔2天使用 IntestiCult™ 肠类器官生长培养基进行一次完全换液。
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图1. 肠类器官在分化前的形态和质量会决定分化成功与否 A. 类器官过小不适合开始分化 B. 具有合适的尺寸和健康的类器官可以开始分化 |
5. 培养基更换为IntestiCult类器官分化培养基后，类器官可继续培养5天。通常在2到3天后就可看到分化的特征（图2），包括类器官单层上皮细胞变厚，因为细胞开始呈现柱状形态、出现杯状细胞或其它终末分化类型的细胞、随时间推移出现死细胞和凋亡细胞的聚集。
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图2. 类器官的形态会随分化而改变
随着类器官的分化，其上皮开始增厚并出现更多已分化的细胞。未分化的类器官（图A，C）外壁更薄，且少量极化（polarized）染色到的成熟细胞偏少。分化完成的类器官（图B，D）上皮增厚，因为细胞开始呈现柱状形态。同时可观察到包括杯状细胞在内的其它终末分化细胞，和一些死细胞。 A. IntestiCult™ 类器官生长培养基培养9天后未分化的类器官。大部分类器官外壁很薄且内部中空，且达到适合分化的尺寸和质量。 B. 分化后的肠类器官。大部分类器官外壁变厚且内部中空区域更少。 C. 对IntestiCult™ 类器官生长培养基培养9天后的未分化类器官进行染色。类器官外壁较薄且缺少明显极化。图中显示Villin（绿色）、E-cadherin（红色），和DAPI（蓝色）。 D. 对使用Intestinal Organoid Differentiation Medium进行分化培养4天的类器官进行染色。图中显示Villin（绿色），E-cadherin（红色），和DAPI（蓝色）
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6. 人肠类器官的单层上皮培养
人肠类器官的单层上皮培养（单层人肠上皮培养体系）
肠类器官为研究人员提供了更具生理相关的细胞模型，并被广泛应用于各个研究领域，以提高实验设计的灵活性和精确度。但是，肠类器官的封闭腔室结构不适用于某些特定的实验研究，造成了它的局限性。该操作步骤描述了如何使用建立好的稳定扩增的肠类器官建立单层肠上皮培养体系的方法。单层肠上皮培养体系具有外露的单层上皮的顶面，从而适合多种研究，比如，研究顶端细胞表面受体、与共生或病原微生物的相互作用、模拟肠内容物中潜在的有益或有害物质的作用。单层肠上皮培养体系可培养在玻璃盖玻片上以实现高质量图形成像，也可以培养在Transwell上以检测物质穿过上皮层的主动和被动运输，和电荷屏障功能性检测。单层培养物可以通过不同培养器皿建立，以灵活适应不同培养体系。
在下面操作步骤中，以类器官形态扩增得到的细胞被接种于被稀释的培养基质上，形成均一融合的单层并且在7天内分化形成肠上皮。通过定期换液，可将单层培养物维持培养最多3周。
培养皿的包被
单层肠上皮的培养首先要用稀释的Matrigel溶液对培养皿进行包被。以下步骤适用于使用Coming*Matrigel*进行包被。其它基质液如Collagen I Collagen IⅣ.Vitronectin XF(货号#07180)也可以用于包被（详细步骤请参考产品说明书)。
1. 将分装后的一份Corning Matrigel在冰上解冻。
2.取适量冷的(2.8℃)D-PBS至维形管中并放在冰上。推荐用量请参照表1。
3. 将已解冻的Matrigel"加入到冷的D-PB5里、比例是1 uL的Matrigel*加入49 uLD-PBS。混合均匀.置于冰上。
4. 立助用稀释的好的Matrigee对组织培养处理的培养皿进行包被。包被液体积推荐用量请参考表1.
注意:保证包被液均匀覆盖培养皿度部;包被液不足会导致细胞无法贴壁。
5. 在使用前至少在37℃孵育1小时。避免使Matrigel溶液挥发。
注意:如果不立即用、用封口膜密封培养以防止Matrigel溶液挥发,可在2-8℃存放最多1周。继续下一步骤前应将之前储存的Matrigel溶液在室温复温30分钟。
6. 慢慢倾斜培养皿使多余的MatrigelP溶液聚集到边缘。吸取出多余的Matigel溶液、注意不要刮到包被表面。
表1 建议添加的稀释的Matrigel体积
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培养皿 |
每孔使用稀释的Matrigel的体积(µL) |
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6孔板 |
1000 |
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24孔Transwell培养板 |
200 |
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24孔板 |
200 |
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96孔板 |
100 |
准备培养基
下例为制备100 mL的单层生长培养基（IntestiCult™ 类器官培养基组分 A +组分B + Y-27632）。如需准备不同体积，可根据以上比例调整。
1. 在室温（15 - 25℃）或在2 - 8℃过夜解冻IntestiCult™ 类器官培养基组分 A和组分 B。
注意：解冻后立即使用，或分装储存在-20℃，最多可保存三个月。分装的样本解冻后立即使用，不可反复冻融。
2. 将50 mL的组分B加入50 mL的组分 A。混合均匀。
3. 加入10 μM的Y-27632。混合均匀。
注意：如果不立即使用，可在2 - 8℃保存最多1周。
4. 使用前加入抗生素（如，50 μg/mL庆大霉素）。
将肠类器官接种为单层培养体系
1. 按照以下描述收集3-4个类器官的Matrigel®domes（约含100-150个类器官）。使用不同培养皿时建议收集的dome数量请参考表2。
2. 向每个含有dome的孔中加入1mL的温和细胞解离试剂（GCDR，货号#07174）。
3. 室温（15-25℃）孵育1分钟。
4. 使用1000μL的移液枪头，用力吹打以吹散Matrigel®dome结构并重悬类器官。
表2 将肠类器官接种为单层培养体系时建议收集的dome数量
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待接种的培养皿 |
每孔接种所需dome数量* |
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24孔板 |
3-4 |
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24孔Transwell培养板 |
2-3 |
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96孔板 |
1 |
*假设收集50 μL大小的domes。
注意：接种效率根据类器官传代次数而变化。
5. 将悬液在室温孵育10分钟，同时轻柔的搅动或震荡。
6. 将几个孔的悬液混合。200xg，2-8℃，离心5分钟。
7. 弃去上清液。加入3mL冷的DMEM/F-12。200xg，2-8℃，离心5分钟。
8. 吸出尽量多的上清液，尽量不要打扰到底部沉淀。将类器官重悬于1mL预热的（37℃）Trypsin-EDTA（0.05%）中。
9. 用1000μL的移液枪头将悬液吹打混匀。将类器官在37℃孵育5-10分钟。
10. 用力吹打或涡旋以尽量混匀并破坏类器官。将类器官放在显微镜下观察以确认其结构被破坏。类器官应该被分散成单个细胞或小的类器官片段（fragment）。如果有大量大的fragment或整个类器官存在，应重复吹打或涡旋步骤以保证碎片被分散（图3）。
注意：以下的步骤需尽快完成，因为细胞容易发生聚集。
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图3. 以单层接种前，类器官必须被打散成单细胞或小细胞团 A. 单细胞是单层接种最理想的选择。 B. 小的细胞团也可以用于单层接种。 C.大的细胞团不适合进行单层接种。如果吹打后仍存 在大的细胞团，建议进行重复吹打和涡旋（第10步）以获得小 的细胞团或单个细胞。 |
11.加入1mLDMEM/F-12后吹打混匀。将碎片以200xg，2-8℃，离心5分钟。
12.弃去上清液并将类器官碎片重悬于单层生长培养基中，详情参考表3。
表3 重悬类器官所需单层生长培养基体积
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待接种的培养器皿 |
每孔接种需要的单层生长培养基体积 |
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6孔板 |
1.5 mL |
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24孔Transwell培养板 |
500 µL |
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24孔板 |
≥100 µL |
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96孔板 |
100 µL |
13.缓慢轻柔地将细胞悬液加入孔中。在37℃和5% CO2培养。每天观察成长情况。每隔2-3天进行培养基完全换液。
注意：单层一般在2-3天达到100%汇合率（满板程度）；若贴壁效果不好，则扩增速度会减缓。但给予足够的培养时间后，汇合率仍然会达到100%。
友情提示：培养开始后，如果保证按时换液，细胞活力和单层的融合率可维持至少3周。如果需要进行特定实验，可以用DMEM/F-12替换单层生长培养基。单层可在DMEM/F-12中维持细胞活力和完整性至少24小时。单层可在Intestinal类器官分化培养基维持至少1周以进行进一步分化。
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图4. 在24孔Transwell培养板中培养的肠上皮单层体系（Intestinal 单层培养） 随着培养进行，单层会达到100%融合率。此过程一般需要2-3天，但其会受接种效率影响，而接种效率可能会受到类器官传代次数影响。 A. 低融合率的人单层肠类器官（小于25%） B. 接种2天后的人单层肠类器官（50%的融合率） C. 培养7天后的人单层肠类器官（100%的融合率） |
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图5. 培养7天后的IntestinalMonolayer将IntestinalMonolayer培养于玻璃盖玻片（置于培养孔中）上，并使用荧光染色成像。 A. 使用E-cadherin（红色）、Villin（绿色），和DAP（I蓝色）进行染色。 B. Cytokeratin18（绿色）和Tricellulin（红色）表明单层内存在三细胞紧密连接（tricellulartightjunctions）。细胞核使用DAP（I蓝色）进行复染。 |
主要试剂和材料
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货号 |
名称 |
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IntestiCult类器官培养基 |
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IntestiCult类器官培养基组分A（#06011） |
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IntestiCult类器官培养基组分B（#06012） |
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含15mM HEPES DMEM/F12 培养基 |
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不含钙和镁的D-PBS |
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GCDR细胞解离试剂 |
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38017 |
经组织处理过的24孔培养板 |
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Y-27632 (2HCl), 1 mg |
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Corning® Matrigel |
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70 µm细胞筛 |
7. 人多能干细胞(hPSC)肠类器官分化和培养
人多能干细胞（hPSC）是进行体外再生医学、疾病模型和化合物筛选研究的重要工具。最近的研究表明，通过模拟人发展中的信号通路可以将hPSCs分化为组织特异性细胞类型。分化特定阶段的时间、持续时间和生长因子浓度决定了细胞的谱系。Jason Spence, James Wells, a和他的同事最近的工作就利用这些原理开发了一种多阶段的体外分化方案，用于形成人小肠类器官1。通过优化操作流程开发了STEMdiffTM肠道类器官分化试剂盒，以提高多个人胚胎干细胞（ES和诱导多能干细胞（iPS））细胞系分化的效率和一致性。STEMdiffTM肠类器官分化试剂盒是一种无血清培养基，支持hPSCs通过三个不同的分化阶段：内胚层、中/后肠和小肠分化为人肠类器官。使用这个试剂盒进行细胞分化，可形成由极化的肠上皮形成的绒毛结构和周围的生态位因子产生的间充质组成的类器官。使用该试剂盒产生的类器官可以冷冻保存，也可以使用STEMdiffTM肠类器官生长培养基通过每7-10天传代一次来进行长期维持培养。
第一部分 包被培养皿
应分装和冷冻保存 Matrigel（货号 #354277，www.novobiotec.com）。有关分装的完整说明和建议，请查阅与 Matrigel同时提供的产品说明书。分装后的小包装可在-70℃下最多储存 6 个月。
将一份分装好的 Matrigel加入到 25 mL 的 DMEM/F-12 中，这足以包被四个6孔培养板（1 mL/孔）或三个 100 mm 培养皿（8 mL/培养皿）。
1)将一份分装后的 Matrigel 从-70℃取出，置于冰上解冻。
2)将24 mL的稀释培养基 DMEM/F-12+15mM HEPES加入一个50 mL试管中，并置于冰上。
3)将解冻后的 Matrigel加入到上述50 mL 离心管中，充分混匀。如需要，可用预冷培养基冲洗试管。稀释倍数见每个批次Matrigel的COA文件。
4)立即用稀释后的Matrigel溶液包被组织培养板。推荐的培养皿及包被体积见表1 。
表1 推荐的培养皿及包被体积
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培养器皿 |
稀释的基质胶体积 |
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24孔板 |
250µL/孔 |
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12孔板 |
500µL/孔 |
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6 孔板 |
1 mL/孔 |
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100 mm 培养皿 |
6 mL/培养皿 |
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T-25 cm2 培养瓶 |
3 mL/瓶 |
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T-75 cm2 培养瓶 |
8 mL/瓶 |
5)转动培养皿，使基质胶均匀包被培养皿。
6)使用前，包被的培养皿应放在室温（15-25℃）下至少1小时。请勿让培养皿上包被的基质变干。使用之前，请勿移除Matrigel溶液。
注：如果不立即使用，培养皿必须密封，以防止蒸发（如利用 Parafilm®）。包被后的培养皿在 2 - 8℃存储，7天内使用完。
7)使用前，提前半小时使包被好的培养皿达到室温（15-25℃）。
第二部分 操作流程图
图1 STEMdiff™肠类器官试剂盒支持从hPSCs分化为人肠类器官
（A）培养人PSC通过三阶段分化，使用特定阶段的专用培养基产生人肠道类器官。（B）分化不同阶段的代表性图片。第0天内胚层分化。在培养的第3天，培养物表现出典型的定型内胚层分化特性并开始进行中/后肠分化。在中/后场分化期间（第5-7天），细胞单层释放至培养基形成中/后肠球体。将这些球体收集，用基质包裹，并在STEMdiff™肠类器官生长培养基中进一步培养成熟为肠类器官。
第三部分 传代用于类器官分化的细胞
以下操作流程用于在mTeSRTM1中培养的人ES或iPS细胞从6孔板到24孔板的传代。使用高质量（分化率小于5%）的细胞至关重要。关于如何维持高质量的人ES和iPS细胞进行分化的完整说明，请参阅《操作手册：人多能干细胞培养》。
使用以下描述的团块传递方法（第三部节）。使用无菌技术进行以下操作。所显示的体积是用于从6孔培养板的一孔传代到24孔培养板一孔。如果使用其它培养皿，请做相应调整。
注：当ES和 iPSC细胞的融合率达到70%时进行传代。
1)使用 Matrigel包被24孔组织处理过的培养板（见第一部分）。
2)分装足量的mTeSR™1并使其达到室温 (15- 25℃)。
注：切勿在37℃水浴加热 mTeSR™1。
3)通过显微镜观察并鉴定已分化的区域。用马克笔或透镜标志器在培养板底部标记这些区域。
4)用移液枪或移液管去除标记区域内这些分化的部分。每次操作时避免将培养板在培养箱外持续放置超过 15 分钟。
注：去除分化的细胞将提高细胞分化效率。
5)从培养孔中吸出培养基，并在每孔中加入 1 mL GCDR。
6)室温 (15 - 25°C)孵育8分钟形成团块。
注：使用的的细胞系和解离试剂不同，孵育时间也可能不同，因此需要在显微镜下监测解离的状态从而确定最佳解离时间。
7)吸出GCRD加入1 mL mTeSR™1，使用移液枪或细胞刮轻轻刮除集落。
注：操作时要务必小心，尽量防止打散集落。
8)将解离的细胞聚集体转移到一个 50 mL 离心管中。[可选择]用另外的1 mL mTeSR™1洗涤培养孔收集剩余的克隆。
注：不必对细胞聚集体进行离心。
9)用1 mL或者2 mL移液管小心上下吹打细胞聚集体混合物，以将其打散至所需的大小。一个均匀的细胞团块悬浮液大小约50-200 μm是最佳的。不要将其制备成单细胞悬液。
10)轻轻摇动管子，以确保细胞聚集物均匀分布。将5 μL的悬浮液转移到一个每孔添加了50 μL的D-PBS（不含Ca2+和Mg2+）的96孔板的一孔中。计算每孔中团块数（直径50-200μm）。
注：如果细胞聚集体 > 200 µm，重复步骤 9 - 10。
11)按照下面的方法计算接种6000个团块需要的团块悬液体积(µL) ：
团块悬液体积 (µL)=6000个团块/（5 µL样本中的团块/5 µL）
12)在添加了0.5 mL mTeSR™1的24孔板中的每孔中接种含有6000个团块的适当体积（在步骤11中计算）。37°C下孵育，5%CO2和95%湿度。通过千欧左右摇动培养板确保细胞均匀分布在培养孔中。24小时内不要扰动培养板。
注：推荐进行预实验，从而确定最佳的团块接种密度。接种一系列团块密度 (例如，每孔 4,000, 5,000, 和 6,000),并且在同一天进行细胞分化。
13)进行第四部分细胞分化。
第四部分 单层培养的hPSCs分化
在开始分化之前，培养24小时后在显微镜下评估细胞的融合率（见第三部分）。此时细胞分化率应少于5%而融合率应该达到85-90%。如果细胞尚未达到这一水平，用0.5-1.0 mL新鲜mTeSRTM1（无Y-27632）培养基代替培养孔中的培养基，并在37°C下再孵育24小时。增殖较慢的细胞株的初始接种密度可能需要优化。
（1）定型内胚层分化
A.定型内胚层分化培养基
第0天：准备第0天，1天和2天需要的定型内胚层分化培养基 (STEMdiff™ 内胚层基础培养基+ STEMdiff™ 定性内胚层分化添加物CJ)，每个培养孔1.7 mL。以下是准备2 mL定型内胚层分化培养基，如果准备别的体积，进行适当调整。
1)冰上解冻添加物并完全混匀。
注：如果不立即使用，分装并储存于-20°C。不要超过添加物的效期。分装好的添加物解冻后，应立即使用。避免反复冻融。
2)室温（15-25℃）或者2-8℃过夜解冻整瓶内胚层基础培养基。完全混匀。
注：如果不立即使用，在2-8℃存储2个月内用完。也可以分装储存于-20°C。不要超过培养基标签上的日期。分装好的添加物解冻后，应立即使用或储存于2-8℃2周内用完。避免反复冻融。
3)1.98 mL预冷的内胚层基础培养基中加入200µL添加物，完全混匀。储存于2-8℃。
B. 定型内胚层分化
1)第0天：37℃预热第0天需要的定型内胚层分化培养基 (0.7 mL/孔)。将剩下的培养基储存于2-8℃。
2)吸出培养孔中的mTeSR™1。沿着孔壁逐滴加入0.7 mL定型内胚层分化培养基。
3)37℃，5% CO2 和 95%湿度孵育24小时。
4)第1天：37℃预热第1天需要的定型内胚层分化培养基 (0.5 mL/孔)。将剩下的培养基储存于2-8℃。
5)吸出培养孔中的培养基。沿着孔壁逐滴加入0.5 mL定型内胚层分化培养基。
6)37℃，5% CO2 和 95%湿度孵育24小时。
7)第2天：37℃预热剩余的定型内胚层分化培养基。
8)吸出培养孔中的培养基。沿着孔壁逐滴加入0.5 mL定型内胚层分化培养基。
9)37℃，5% CO2 和 95%湿度孵育24小时。
10)第3天：对细胞进行内胚层检测（9.1节）。复孔可以继续分化成中/后肠（第6.2节）。
注：在内胚层诱导过程中，细胞会经历大量的死亡。尽可能减少细胞在37°C培养箱外的时间。在24小时内胚层诱导后，细胞非常敏感，培养时需要小心更换培养基。经过72小时的孵育，将形成致密的融合单层内胚层细胞。
（2）中/后肠（MH）分化
A. MH分化培养基
第3天：准备第3-8天需要的MH分化培养基 (STEMdiff™ 内胚层基础培养基+ STEMdiff™ 胃肠道分化添加物PK+STEMdiff™ 胃肠道分化添加物 UB)，每个培养孔3.0 mL。以下是准备3.0 mL MH分化培养基，如果准备别的体积，进行适当调整。
1)冰上解冻添加物PK和UB，与基础培养基混合之前一直置于冰上。完全混匀。
注：如果不立即使用，分装并储存于-20°C。不要超过添加物的效期。分装好的添加物解冻后，应立即使用。避免反复冻融。
2)2.94 mL预冷的内胚层基础培养基中加入30 µL PK添加物和30 µL UB添加物，完全混匀。储存于2-8℃。
B. 中/后肠（MH）分化
1)第3天：将足量的MH分化培养基 (0.5 mL/孔)升温至室温(15 - 25°C)。将剩下的培养基储存于2-8℃。
2)吸出培养孔中的培养基。沿着孔壁逐滴加入0.5 mL定型内胚层分化培养基。
3)37℃，5% CO2 和 95%湿度孵育24小时。
4)第4-9天：全换液并按照下面的方法每24小时观察一次球体。
注：确保培养物在取出后30分钟内放回培养箱。
a.在显微镜下观察单层。三维结构可能最早在分化的第4天就能被看见。游离漂浮的中/后肠球体将出现在分化的第5-9天。
b.用1m L移液管，从细胞中取出0.5 mL培养基，转移到无菌的24孔平底透明培养板上，以评估从单层中提取的中/后肠球体的数量和浓度。
c.在细胞中加入 0.5 mL新鲜的MH培养基。 37℃，5% CO2 和 95%湿度孵育24小时。
注：尽管第5-9天释放的球体都能产生小肠类器官，但是细胞在中/后肠培养基中的培养的时间长短将决定小肠类器官发育的区域特征。例如，十二指肠（较短的培养时间）或回肠（较长的培养时间）2。中/后肠球最高产率的出现时间可能因hPSC细胞系不同而有所不同。对于可重复的实验结果，使用同一个时间点分化的中/后肠球，可持续地收获和开始人肠道类器官的培养。经常在第8天观察到最多的肠芽。
图2 中/后肠培养伴随球体的成功形成和释放
第6天分化培养的代表性图片显示了中/后肠球体的剧烈形成，通过细胞单层芽进入培养基中。图像（C）由极化的上皮细胞包围的内细胞团的典型球体形态。从左到右依次放大：2X、4X和10X。
5)球体嵌入：用移液管将各培养孔中的球体悬浮液加入24孔板的一个培养孔中进行计数。15 mL离心管中添加适当的体积，对应的大约有50个左右悬浮球（根据先前的球体计数）。进行第7.0节肠道类器官培养。
注：一个中/后肠球是直径≥75μm的细胞聚集体，可能形成一个人肠类器官。多个融合球体应该被算作一个单元，将形成一个人肠道类器官。
注：剩余的单层培养物可用于测定中/后肠形成（第9.2节）或研究随后的几天嵌合成球体的进一步分化。
第五部分 人肠类器官培养
（1）人肠类器官的初始培养
A.STEMdiff™肠类器官生长培养基
1)准备接种4孔的（2 mL/孔）STEMdiff™肠类器官生长培养基（STEMdiff™肠类器官基础培养基+STEMdiff™肠类器官生长添加物+L-谷氨酰胺）体积。以下是准备2 mLSTEMdiff™肠类器官生长培养基，如果准备别的体积，相应的调整。
2)冰上解冻添加物并一直置于冰上直到与基础培养基混合。混合均匀。
注：如果不立即使用，分装并储存于-20°C。不要超过添加物的效期。分装好的添加物解冻后，应立即使用。避免反复冻融。
3)1.94 mL预冷的肠类器官生长基础培养基中加入40 µL类器官生长添加物和20 µL L-谷氨酰胺，完全混匀。储存于2-8℃在2周内用完。使用前升温至室温 (15 - 25°C)。
B.Matrigel Domes中嵌入Spheroids
1)在冰上解冻足够体积的Matrigel（培养一个dome需要50 μL的Matrigel）。将一盒无菌的100μL枪头置于-20°C。
2)当所有球体（见6.2.2节）都固定在离心管的底部，仔细吸去上清液。
3)在球体中加入1mL的DMEM/F-12+15 Mm HEPES。室温（15-25°C），300×g离心5分钟。
4)用1 mL枪头小心吸去上清液。
注：尽可能多的吸去上清液至关重要。
5)从冰箱中取出100 μL枪头，置于生物安全柜中。
6)使用带有预冷的100 μL枪头的移液枪，在离心管中加入50 μL的冷（2-8°C）Matrigel。上下吹打5次，将球体轻轻地分配到Matrigel中。
注：不要完全清空枪头，因为这可能会引入气泡。
7)使用相同的枪头，轻轻地将嵌入的球体转移到Nunclone Delta表面处理的24孔组织培养皿的一个培养孔的中心，按如下所示操作：
a.移液枪在培养孔中心上方，保持垂直。将枪头靠近但不与培养孔底接触。
b.轻压移液枪，直到在枪头的末端看到液滴为止。
c.缓慢放下移液枪，直到液滴接触培养孔的底面。
d.轻轻将剩余的体积分配（只到吸管上的第一站）到其它培养孔，同时把移液枪从培养孔里拿开。
e.盖上培养皿。
注：快速工作以防止Matrigel成胶。但是过快地加入Matrigel也会使dome变平。
8)在室温（15-25°C）下孵育25分钟，使Matrigel固化。
9)将足够体积的STEMdiffTM肠类器官生长培养基（0.5 mL/孔）升温至（15-25°C）。将剩余的培养基储存在2-8°C。
10)小心沿培养孔孔壁加入0.5 mL的STEMdiffTM肠类器官生长培养基（避免扰动dome）。盖好培养皿。37°C，5%CO2、95%湿度条件下孵育。
11)每3-4天更换一次培养基，如步骤9-10所述，吸去旧培养基，添加新鲜培养基。37°C、5%CO2、95%湿度条件下孵育。
12)孵育7-10天后，进行第五部分（2）节。
（2）人肠类器官传代
图2 使用STEMdiff™肠类器官试剂盒生成人肠类器官
嵌入的中/后肠球体在STEMdiffTM肠类器官生长培养基中培养，每7-10天传代一次，成熟为肠类器官。每幅图下面显示了传代次数和嵌入后的天数。放大倍数：2X。
1)准备足以接种4个培养孔（2 mL/孔）的STEMdiffTM肠类器官生长培养基（见第五部分（1）A节）。
2)在冰上解冻足够体积的Matrigel（培养一个dome需要50 μL的Matrigel）。将一盒无菌的100 μL枪头置于-20°C。将DMEM/F-12+15 mM HEPES置于冰上。
3)按照下列方法润洗15 mL离心管（每个dome一根）：
a.在试管中加入1-2 mL抗粘附冲洗液，旋转包被管子。从管中吸去冲洗液。
b.在管中加入5 mL D-PBS（不含Ca2+和Mg2+）。旋转冲洗管子。
c.尽可能多地吸去管中液体。
d.将所有被包被的管子盖紧，并在室温（15-25°C）下储存，直到需要为止。
4)从dome培养物中吸去培养基。使用1mL的吸管，在含有类器官的dome上加入1 mL预冷的DMEM/F-12。直接吹打dome几次，直到dome破碎分离。
5)使用1mL的吸管，将悬浮液转移到润洗的15 mL离心管中..
注：通过在显微镜下对培养孔进行检查，确认成功收获类器官。如果培养孔中有残留的类器官，重复步骤4-5。
6)摇动离心管，然后再冰上孵育5分钟。
注：可能需要更长的孵育时间，以确保所有的类器官碎片都已沉淀到离心管底部。
7)弃去上清液。
8)加入1mL预冷DMEM/F-12。使用1 mL移液管，上下吹打分解类器官，直到产生均匀的器官碎片悬浮液（碎片大小100-500 μm）。
注：通常上下吹打5-10次会产生所需大小的类器官碎片.
注：如果类器官长得很大，可能需要一个200 μL的移液枪进一步分解类器官。类器官碎片应通过200μL枪头。避免继续吹打，将器官分解成成单细胞悬液。
图3 类器官传代
传代类器官典型代表图片。传代数、嵌入后的天数和分配比例显示在每张图下面。放大倍数：2X。
9)期望的类器官密度由碎片计数或分配比决定。将多余的类器官悬浮液分配到另一个润洗的15 mL离心管中或丢弃。
注：每个器官碎片都可以产生一个新的肠道类器官。每个dome培养物接种40-80肠器官碎片是最佳接种密度的。
10)室温（15-25°C）200×g离心5分钟。小心弃去上清液。
注：尽可能多的吸去上清液至关重要。
11)将100 μL枪头从冰箱取出，置于生物安全柜中。
12)使用带有冷的100 μL枪头的移液枪，将50 μL预冷的（2-8°C）Matrigel加入类器官中。通过上下轻轻吹打，将器官碎片分配到Matrigel中。
注：不要完全清空移液枪，因为这可能会引入气泡。
13)使用相同的枪头，轻轻地将嵌入的球体转移到Nunclone Delta表面处理的24孔组织培养皿的一个培养孔的中心，如下所示：
a.将移液枪在培养孔中心上方，保持垂直。将枪头靠近但不与培养孔底接触。
b.轻压移液枪，直到在枪头的末端看到液滴为止。
c.缓慢放下移液枪，直到液滴接触培养孔的底面。
d.轻轻将剩余的体积分配（只到吸管上的第一站）到其它培养孔，同时把移液枪从培养孔里拿开。
e.盖上培养皿。
注：快速工作以防止Matrigel成胶。但是过快地加入Matrigel又会使dome变平。
14)在室温（15-25°C）下孵育25分钟，使Matrigel成胶。
15)将足够体积的STEMdiffTM肠类器官生长培养基（0.5 mL/孔）升温至室温（15-25°C）。将剩余的培养基储存在2-8°C。
16)小心沿培养孔壁加入0.5 mL的STEMdiffTM肠类器官生长培养基（避免扰动dome）。盖好培养皿。37°C下孵育，5%CO2和95%湿度条件下孵育。
17)每3-4天更换一次培养基，如步骤15-16所述，吸去旧培养基，添加新鲜培养基。
18)每7-10天传代一次。传代时间依赖于类器官接种密度、大小和形态。
第六部分 人PSC源肠类器官冻存和复苏
人PSC-源性肠类器官一旦完全建立并成熟，就可以在早在传代3代的时候进行冻存。为了取得最佳效果，在冻存前，应在STEMdiff™肠道类器官生长培养基中培养至少培养7天，但不超过10天。而且为了保证冻存和复苏效果，需要使用高质量的类器官。如果类器官已经解冻，则应在重新冻存前至少传代2次。
（1）类器官冻存
注：用防粘连冲洗液润洗任何枪头或移液管至关重要，这样操作可以最大限度地减少因黏附而造成的类器官碎片的损失。
1)从dome培养物中吸去培养基。使用1 mL移液管，在含有类器官的dome上加入1 mL预冷的DMEM/F-12。直接在dome上吹打几次，直到dome破碎分离。
2)使用1 mL移液管，收集所有培养孔中的悬液在一支润洗的15 mL离心管中。
注：在显微镜下对器官培养进行检查，确认成功收获类器官。如果培养孔中有残留的类器官，重复步骤1-2。
3)摇动离心管，置于冰上孵育5-10分钟。
注：为了确保所有的类器官碎片已全部沉到管底可能需要更长的孵育时间。
4)弃去上清。
5)加入1 mL预冷的DMEM/F-12重复步骤3-4。
6)每收获一个24孔板加入1 mL预冷的DMEM/F-12。使用1mL移液管，上下吹打解离类器官，直到产生均匀的类器官碎片悬浮液（碎片大小100-500 μm）。避免形成单细胞悬液。
注：上下吹打5-10次通常就会产生所需大小的类器官碎片。
注：如果类器官长得很大，可能需要一个200 μL的移液枪进一步破碎类器官。类器官碎片应正好通过200 μL枪头。避免继续吹打，将器官解离成单细胞悬液。
7)将5 μL类器官碎片悬液转移到一个平底96孔板的1孔中，培养孔中预先添加了50 μL D-PBS（不含Ca2+和Mg2+）。计数培养孔内类器官碎片总数。将含类器官悬液的15 mL离心管置于冰上。
8)计算悬液中类器官碎片的总量，从而确定类器官冻存密度。我们建议每支冻存管冻存2000-8000个类器官团块，以达到最佳的长期储存和复苏效果。
9)在新的润洗的15 mL离心管中加入适当体积的类器官团块悬浮液。
10)室温（15-25°C），200×g离心5分钟。小心弃去上清液。
11)对于每支要用的冻存管，用1 mL的预冷的CryostorCS10冻存液重悬类器官碎片。通过轻轻上下吹打，将类器官碎片分配到Cryo StorCS10中。
12)使用1 mL的移液管，将1 mL类器官碎片悬浮液转移到预先标记好的冻存管中。将冻存管放入冷冻容器中。
注：需要不断摇动15 mL离心管，从而使类器官碎片均匀分布在冻存管内。
13)将冻存管转移到长期液氮储存（-135°C）前，将冷冻容器转移到-80°C冰箱至少冻存24小时。
（2）类器官复苏
注：用抗粘附冲洗液润洗任何枪头或离心管至关重要，这样操作可以尽可能减少类器官碎片在塑料器皿上的黏附。
1)从液氮中取出类器官冻存管，立即将冻存管放入37°C水浴中。
2)密切观察解冻过程，并在器官碎片完全解冻前从水浴锅中取出冻存管。
注：解冻过程不应超过1分钟。
3)使用2 mL移液管，吸取2 mL DMEM/F-12仔细清洗类器官碎片，使类器官碎片悬液完全解冻。
4)将清洗后的类器官碎片转移到15 mL离心管中。200×g离心5分钟。
5)小心弃去上清液，用2 mL DMEM/F-12重悬类器官碎片。
注：切勿一直吹打，避免将碎片吹打成单细胞悬液。
6)将类器官碎片悬液分装在15 mL离心管中，使每支离心管都包含预期要嵌入的类器官碎片数量。我们推荐嵌入250 - 1000个碎片。
注：接种高密度的碎片要比接种地密度碎片传代时间早。
7)200 x g离心5分钟。尽可能多的弃去上清液。
8)进行第五部分第（2）节步骤1-3和11-17类器官碎片嵌入和维持培养。
9)嵌入后每天评估类器官，以确定是否需要传代。复苏后的类器官比未被冻存过的类器官显得小。类器官变暗说明已经可以传代了。通常，这将发生再嵌入后4-7天。
10)在传代复苏后的类器官时，根据类器官密度、大小和形态，传代时间将恢复到每7-10天一次。
第七部分 不同分化培养物的表征
（1）内胚层细胞表征
用下列抗体标记后，可用流式细胞仪测定内胚层细胞的纯度：
|
标记 |
推荐抗体 |
货号 |
|
FOXA2 |
PE Mouse anti-Human FoxA2 Clone N17-280 (RUO) |
BD,#561589 |
|
Sox17 |
Alexa Fluor® 488 Mouse anti-Human Sox17 Clone P7-969 (RUO) |
BD,#562205 |
|
CD184 |
ANTI-HUMAN CD184 (CXCR4)(12G5) APC 25 TES |
eBioscience,#17-9999-41 |
|
CD117 |
ANTI-HUMAN CD117 (YB5.B8) APC 100 TE |
eBioscience,17-1179-42 |
用下列抗体标记后，也可通过免疫细胞化学来评估细胞：
|
标记 |
推荐抗体 |
货号 |
|
FOXA2 |
FOXA2 Polyclonal Antibody |
Invitrogen,#PA5-35033 |
|
Sox17 |
SOX17 Monoclonal Antibody (OTI3B10) |
Invitrogen,#MA5-24885 |
注：结果可能因使用的细胞系而不同。相关的荧光二抗请参考网站：
http://www.nwbiotec.com/index.php?g=&m=article&a=new_nav_list&newid=170
（2）中/后肠细胞的表征
用下列抗体标记后，可用流式细胞仪测定中/后肠的纯度：
|
标记 |
推荐抗体 |
货号 |
|
CDX2 |
Alexa Fluor® 647 Mouse anti-CDX-2 Clone M39-711 (RUO) |
BD,#560395 |
|
SOX2 |
PE Mouse Anti-Sox2, clone 245610 |
BD,#560291 |
用下列抗体标记后，也可通过免疫细胞化学来评估细胞：
|
标记 |
推荐抗体 |
货号 |
|
CDX2 |
CDX2 Monoclonal Antibody (EPR2764Y) |
Invitrogen,#MA5-14494 |
|
E-Cadherin |
Purified Mouse Anti-E-Cadherin, clone 36/E-Cadherin |
BD,#610182 |
|
Vimentin |
Vimentin Monoclonal Antibody (V9) |
Invitrogen,#MA5-11883 |
注：结果可能因使用的细胞系而不同。相关的荧光二抗请参考网站：
http://www.nwbiotec.com/index.php?g=&m=article&a=new_nav_list&newid=170
（3）肠类器官表征
用下列抗体标记后，可用免疫细胞化学测定肠类器官的纯度：
|
标记 |
推荐抗体 |
货号 |
|
CDX2 |
CDX2 Monoclonal Antibody (EPR2764Y) |
Invitrogen,#MA5-14494 |
|
E-Cadherin |
Purified Mouse Anti-E-Cadherin, clone 36/E-Cadherin |
BD,#610182 |
|
EpCAM/TROP-1 |
Human EpCAM/TROP-1 Antibody |
RD,#AF960 |
|
MUC2 |
MUC2 Monoclonal Antibody (996/1) |
Invitrogen,#MA5-12345 |
|
Cytokeratin 20 |
Cytokeratin 20 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (SA35-03) |
Invitrogen,#MA5-31979 |
|
Vimentin |
Vimentin Monoclonal Antibody (V9) |
Invitrogen,#MA5-11883 |
|
Desmin |
Desmin Monoclonal Antibody (D33) |
Invitrogen,#MA5-13259 |
|
Villin |
Villin Polyclonal Antibody |
Invitrogen,#PA5-22072 |
|
KLF5 |
KLF5 Polyclonal Antibody |
Invitrogen,#PA5-27876 |
|
SOX9 |
SOX9 Polyclonal Antibody |
Invitrogen,#PA5-81966 |
|
CHGA |
Chromogranin A Monoclonal Antibody (LK2H10) |
Invitrogen,#MA5-13096 |
第八部分 常见问题及解决方法
|
问题 |
可能的原因 |
解决办法 |
|
定性内胚层有道效率低 |
hPSC质量低 |
通过去除维持培养（第5.1节步骤3-4）中所自发分化的hPSC， 确保接种高质量的未分化的hPSC |
|
定型内胚层分化时细胞漂起 |
第0天，细胞接种密度太高 |
最佳细胞密度为85-90%，定性内胚层分化出现更早 |
|
更换培养基时间超过24小时。 |
在定型内胚层诱导的头3天，每≤24小时更换一次培养基 |
|
|
中/后肠分化阶段没有形成球体 |
第3天细胞密度太低 |
接种3个不同的细胞碎片密度（4000，5000，和6000），并在 同一天开始定型内胚层诱导所有三个播种密度在同一天，一旦一 个密度的融合率达到85%-90%。继续内胚层单层（第3天）中/后 肠诱导，此时细胞密度最紧致和拥挤。在内胚层诱导（第3天）停止 没有融合成单层的细胞培养。 |
|
中/后肠诱导期间培养孔上中形成不均匀球体 |
ES/iPS细胞接种不均匀 |
培养皿在培养箱中时前后左右摇动培养皿确保细胞碎片均匀散落在 培养皿中（5.1节步骤12） |
|
接种培养皿之后Matrigel dome碎裂 |
塑料培养皿不适合培养Matrigel dome |
推荐使用Nunclone Delta表面处理的24孔组织培养皿进行类器官dome 培养 |
|
Matrigel蛋白含量低 |
使用最低蛋白质含量为8mg/mL的批次Matrige |
|
|
残留的培养基稀释Matrigel |
从球球体中尽可能多的吸去残留培养基（第7.1.2节步骤4） |
|
|
球体沉到塑料培养皿底部，并在嵌入Matrigel期间附着在皿底 |
残留的培养基稀释Matrigel |
从球球体中尽可能多的吸去残留培养基（第7.1.2节步骤4） |
|
球簇聚集在Matrigel dome上 |
Matrigel®/spheroid 悬液没有充分混匀 |
在形成Matrigel dome之前，通过上下几次吹打彻底混合Matrigel/球体 悬浮液（第7.1.2节，步骤6） |
|
类器官传代后不能复苏，或生长缓慢 |
类器官被破碎太散 |
通过上下吹打，形成较大的类器官碎片，最佳大小在100-500μm （第7.2节，步骤8） |
|
碎片接种密度太低 |
接种更多的碎片 |
|
|
分化的肠道细胞类型数量少 |
类器官收获太早 |
维持类器官的培养2周而不传代。每3-4天使用0.5mL新鲜STEMdiffTM 肠类器官生长培养基进行换液。延长类器官培养将富集分化的肠道细胞谱系。 |
第九部分 参考文献
1. Spence JR et al. (2011) Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature 470(7332):105–9.
2. Tsai YH et al. (2017). In vitro patterning of pluripotent stem cell-derived intestine recapitulates in vivo human development. Development 144(6):1045–55.
附录 试剂、材料和设备
主要试剂
|
名称 |
组分 |
|
STEMdiff™ 肠类器官培养试剂盒（货号#05140） |
STEMdiff™内胚层分化基础培养基 |
|
STEMdiff™定型内胚层分化添加物 CJ (100X) |
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|
STEMdiff™中/后肠分化添加物PK |
|
|
STEMdiff™中/后肠分化添加物 UB |
|
|
STEMdiff™ 肠类器官培养基础培养基 |
|
|
STEMdiff™ 肠类器官培养添加物 |
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|
STEMdiff™ 肠类器官生长培养基（货号#05145） |
STEMdiff™ 肠类器官培养基础培养基 |
|
STEMdiff™ 肠类器官培养添加物 |
其它试剂和材料
|
货号 |
名称 |
|
mTeSR1 |
|
|
Corning，#356231 |
Corning Matrigel |
|
GCDR |
|
|
Corning，#3526 |
TC-treated 24孔细胞培养板 |
|
Corning，#353075 |
TC-treated 96孔培养板 |
|
Thermo,#142475 |
Nunc™ 经细胞培养处理的24孔培养皿 |
|
抗黏附缓冲液 |
|
|
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES |
|
|
不含Ca2+和Mg2+的D-PBS |
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|
Corning，#353086 |
细胞刮 |
|
Corning，#352070 |
50 mL离心管 |
|
Corning，#352196 |
15 mL离心管 |
|
Cryostor CS10细胞冻存液 |
8. 使用IntestiCult™类器官生长培养基（人） 培养结肠癌组织来源的肠类器官
癌症是全球主要的死亡原因之一，而大肠癌是最常见的癌症类型之一。尽管肿瘤细胞系和动物模型已经揭示了许多有关肠道癌的信息，但从癌症样本来源的肠道类器官可以更真实地重现起源肿瘤的组织结构、细胞异质性和形态1。因此，癌症来源的类器官被证明是可以用于研究癌症生物学的有用实验模型，包括疾病进展以及受影响的信号通路和肿瘤微环境2。癌症样本来源的类器官还可以实现更多的转化医学应用，例如激活和扩增肿瘤反应性T细胞群体，预测患者特定的治疗结果，并筛选潜在的治疗药物3，4。
本篇描述了如何使用IntestiCult™类器官生长培养基 （人）（IntestiCult™ OGMH；货号 #06010）培养Wnt-independent （不依赖于Wnt）的癌症样本来源的肠类器官。
试剂和材料
|
名称 |
货号 |
|
GCDR细胞解离试剂 |
07174 |
|
TC-treated 24孔细胞培养板 |
Corning,#3526 |
试验数据
图1. 在IntestiCult™ OGMH中生长的癌症样本来源的类器官 使用发表文献中的培养基1建立源于结肠癌活检样本的类器官，后转换至IntestiCult™ OGMH（P0），详细描述参下。癌症样本来源的类器官在IntestiCult™ OGMH中表现出强劲的生长速率，且不受传代影响。实验数据来源于Hubrecht Organoid Technology，经许可后使用。
图2. IntestiCult™类器官生长培养基（人）支持从多个患者样本来源的类器官的生长
使用发表文献中的培养基1 建立源于结肠癌活检样本的类器官，经上述方法传代后转换 至IntestiCult™ OGMH。类器官在IntestiCult™传代2次后，在第2代结束时进行成像（第 6-12天）。实验数据来源于Hubrecht Organoid Technology，经许可后使用。
试验步骤
下述操作流程与Hubrecht Organoid Technology合作开发，用于在 IntestiCult™ OGMH中培养Wnt-independent结肠癌样本来源的肠类器官。
本操作流程不适用于没有携带Wnt信号通路活化突变的肿瘤。
A. 培养基制备
以下为制备100 mL IntestiCult™ OGMH用于培养Wnt-independent癌症 样本来源的类器官（IntestiCult™ OGMH组分A + DMEM/F-12 with 15 mM HEPES。如需配置其他体积，请进行相应调整。
1. 室温（15 - 25℃）解冻IntestiCult™ OGMH组分A或过夜2 - 8℃解冻。混合均匀。立即使用或分装后于-20℃保存，3个月内用完。分装后的培养基重新解冻后，需马上使用。切忌反复冻融。
2. 混合50 mL IntestiCult™ OGMH组分A和50 mL DMEM/F-12 with 15 mM HEPES。混合均匀。如果不立即使用，可于2 - 8℃储存，一周内用完。
3. 使用前加入所需的抗生素（例如，50 μg/mL庆大霉素）。
B. 从肿瘤活检样本中分离组织
1. 冰上解冻100 μL Matrigel。
注：这足够4个培养domes（液滴）的用量。
2. 将下列试剂置于冰上：D-PBS（不含Ca2+和Mg2+），DMEM + 1% BSA。
3. 将经组织培养处理的（TC-treated）24孔板在37℃培养箱预热至少2小时。
4. 在15 mL离心管中，使用10 mL冰冷的PBS清洗组织样本。通过重力沉降组织（约5秒），吸弃上清液。
5. 重复第4步，管中保留1 mL上清液。
6. 使用1 mL枪头将组织和剩余的上清液转移至一个1.5 mL EP管中。
7. 使用无菌剪刀，将组织切碎成约5 mm的小块。使用1 mL枪头将组织 小块转移至新的15 mL离心管中。用PBS清洗EP管，一并转移至离心 管中。
8. 重力沉降组织小块（约5秒），吸弃上清液。
9. 加入10 mL温和细胞解离试剂。在中速（约40 rpm）的水平摇床上以 37℃孵育60分钟。
10. 以290 x g，离心5分钟。吸除上清液。
注：接下来的所有步骤，枪头需使用DMEM + 1% BSA预先湿润， 才可操作样本。这可避免隐窝黏附在枪头壁上造成样本流失。
11.加入1 mL冰冷的DMEM + 1% BSA。使用1 mL枪头剧烈上下吹打 20次。
注：避免枪头接触到管底。
12. 使用一个1 mL的枪头，将管中的样品通过70 μm细胞筛网转移至一 个新的15 mL离心管中。并使用1 mL DMEM + 1% BSA润洗细胞筛网。
C. 从分离的活检组织中进行类器官培养
有关如何将分离的组织接种成为类器官培养物的完整说明，请参考“人结肠隐窝分离和类器官传代”。当使用从癌症组织来源的样本时，使用本操作步骤A部分中配置的培养基，而不是完全培养基 IntestiCult™ OGMH。
生长培养基需每两天更换一次，培养体系每隔6 - 12天传代一次。有关传代流程的完整说明，请参考“人结肠隐窝分离和类器官传代”。当使用从癌症组织来源的样本时，使用本操作步骤A部分中配置的培养基，而不是完全培养 基IntestiCult™ OGMH。
参考文献
1. Sato T et al. (2011) Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141(5): 1762–72.
2. Fujii M et al. (2016) A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18(6): 827–38.
3. Dijkstra K et al. (2018) Generation of tumor-reactive T cells by co-culture of peripheral blood lymphocytes and tumor organoids. Cell. 174(6): 1586–98.
4. Vlachogiannis G et al. (2018) Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359(6378): 920–26.
9. Forskolin诱导培养于IntestiCult™中人肠类器官膨胀的操作流程
囊性纤维化（Cystic fibrosis，CF）是囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）的基因突变所导致的遗传性疾病。氯离子通道广泛存在于包括肠道上皮等多种器官的上皮组织。CFTR的缺陷导致离子通道的转运功能受损，器官粘液分泌能力降低，引发呼吸困难，肺部感染，消化不良等多种临床症状。肠类器官的培养为体外研究CFTR蛋白功能提供了一种全新的技术手段。欲建立肠类器官培养，可以取结直肠样本，扩增并长期维持培养于体外培养环境中。 这些类器官在体外培养下能够维持其亲本的基因型和表型，故而可以保留研究所需CFTR功能。
将肠类器官培养中加入forskolin会导致细胞cAMP（cyclic adenosine monophosphate）的水平急速上升，促进CFTR通道张开。当氯离子穿过通道进入内腔后，类器官将会由于水渗透量（osmosis）的增加而不断肿胀。 通过这个原理，可以对CFTR的活性的进行试验。类器官肿胀与CFTR 的活性有关，CFTR野生型的类器官在经过forskolin处理后体积将增大，而携带CFTR突变或使用CFTR抑制剂的类器官体积将不会变化。
试剂和材料
|
名称 |
货号 |
|
CFTRINH172 |
e.g. Cayman#15545 |
|
GlyH-101 |
e.g. Cayman#15772 |
|
DMSO |
|
|
Costar® 24 Well Flat-Bottom Plate, Tissue Culture-Treated |
Corning,#3526 |
|
Krebs-Ringer Solution, Bicarbonate-Buffered |
e.g. Alfa Aesar#J67591 |
试验数据
图1. 在IntestiCult™类器官生长培养基培养下，Forskolin诱导的肠类器官 膨胀实验使用10 μM的forskolin处理肠类器官12分钟，其内腔的面积增大。DMSO对照组面积无变化。
图2. Forskolin诱导的肠类器官膨胀百分比测量
类器官的膨胀程度采用明场显微镜检法（brightfield microscopy）测量。后续时间点面积变化的百分比系与初始时间（T=0）类器官平均面积的比值而得。在每个时间点，拍摄孔内所有类器官，计算三个复孔所有面积的平均值。数据代表了第3代正常供体类器官的 实验结果。
Forskolin诱导的肠类器官膨胀试验步骤
1. 根据“人结肠隐窝分离和类器官传代”建立类器官培养。在进行forskolin诱导实验之前，先将类器官转移至IntestiCult™ 类器官生长培养基（人）（货号 #06010）培养3-5天。
2. 吸出培养基，加入等体积Krebs-Ringer Bicarbonate buffer（KRB）， 使KRB与Corning Matrigel®的液滴在37℃充分融合30分钟。
注：Forskolin诱导的膨胀试验也可以在培养基中进行，不过在KRB中，其膨胀效果更明显。
3. 可选：如果选择设置CFTR抑制剂对照组（例，CFTRINH172或GlyH101），请在孔中加入适量抑制剂，37℃孵育3小时。如果未设置抑制剂对照组，请直接进行步骤4。
4. 由于类器官可能在加入forskolin后马上膨胀，请拍摄加入forskolin 前T=0的照片。
5. 吸出KRB，再加入新鲜的KRB。在其中添加阴性对照组试 剂，forskolin（10 μM），以及CFTR抑制剂（可选）。
6. 每隔固定时间拍摄一次孔内类器官，直到forskolin实验组膨胀完全停止（通常80-120分钟）。
7. 使用ImageJ，分析计算各时间点类器官的平均面积，与T=0时作比较，类器官膨胀的百分比。
参考文献
1.Dekkers, JF et. al (2012). A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat. Med. 19(7): 939–47.
2. Boj, SF et. al (2017). Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments. 120(e55159).
10.小鼠肠类器官培养操作流程
1.0 前言
三维立体（3D）培养系统愈发引人关注，这在很大程度上归功于它有助于促进多细胞生物机制和精确医学的基础研究，同时可以填补于药物开发过程中所使用的传统体外高通量筛选和体内研究二者之间的空白。人们越来越多地认识到与传统单层细胞培养技术相比，器官型培养可以提 供更具生理相关性的体外模型，这推动了3D培养系统的应用。在肠上 皮类器官培养系统中，肠干细胞重现了体内成熟肠道中可观察到的自我更新能力和分化能力。除了展示成熟肠上皮中存在的所有已知细胞类 型外，肠类器官另一特征是具有隐窝-绒毛结构、上皮极化、和具备功能性的腔，这些特点使得该培养系统成为研究肠道生物学的有力工具。肠类 器官在再生医学研究方面同样具备潜力，已经有研究发现类器官可以融入 到化学性损伤小鼠的结肠中形成结肠段，且在形态上与周围上皮细胞没有区别。肠类器官已成功与细菌和免疫细胞共培养，为研究上皮组织与免 疫系统的细胞间的相互作用提供了模型。同时，可以使用CRISPR-Cas系 统或逆转录病毒和慢病毒的感染对小鼠肠类器官进行基因操纵。
在进行小肠类器官培养时需要将整个隐窝结构或者Lgr5+干细胞嵌入到基质中，然后用无血清培养基Advanced DMEM/F12培养，培养基中添加三个必须的因子：R-Spondin-1，EGF和Noggin。其中R-Spondin-1是Wnt通路的激动剂，同时也是Lgr5的配体，在体外可以导致隐窝的大量增殖；EGF与受体结合可以促进小肠上皮细胞的增殖；Noggin是BMP通路的抑制剂，可以增加类器官中隐窝的数量。通过这种方法培养出来的类器官，可以得到上皮细胞紧密连接形成的中空管腔样结构，腔内是凋亡脱落的细胞。随着类器官的生长，干细胞通过出芽方式向外突出生长形成更多隐窝状结构。培养的类器官中含有各种肠道细胞，且各细胞比例与体内一致，penth细胞和分泌细胞也可以向腔内分泌物质。
本文主要阐述了如何使用Advanced DMEM/F-12和Corning®Matrigel®基质进行小鼠小肠和结肠隐窝的分离、培养、传代 和冷冻保存。
图1. 光学显微镜（10X）下培养5天的小鼠小肠类器官
2.0 试剂和耗材
2.1试剂
• Advanced DMEM/F-12（Thermo Fisher#12634010）
• HEPES (1 M)（PBM#200147）
• L-谷氨酰胺（200mM 100×）（PBM#214010）
• N-2 添加剂 (100X)（Thermo Fisher#17502048）
• B-27™添加剂 (50X),无血清（Thermo Fisher#17504044）
• 重组小鼠R-Spondin-1（PeproTech#315-32）
• 重组小鼠EGF（PeproTech#315-09）
• 重组小鼠Noggin（PeproTech#250-38）
• N-acetyl-L-Cysteine（PeproTech#6169116）
• 重组小鼠Wnt-3a（PeproTech#315-20）
• 温和细胞解离液（PBM#608010）
• PBS（PBM # 201053 ）
• 钙镁离子DPBS缓冲液（PBM#201050)
• 青霉素-链霉素 (5,000 U/mL), 100 X（ThermoFisher#15070063)
• 基质胶（Corning#356255）
• EDTA, 5mM（PBM# 205110)
• 澳洲胎牛血清FBS（Sigma#F8318）
• 无血清冻存液（PBM#210102）
• DAPI（PBM# 423010)
• Rapiclear(RC)透明试剂（SunJin Lab#RC149002、RC152002）
• iSpacer垫片（www.novobiotec.com）
2.2 耗材
• 50 mL离心管（Corning#352070）
• 15 mL离心管（Corning#352196）
• 10 mL移液管（ThermoFisher#170367N）
• 70 μm滤网（Corning#352350）
• 100 μm滤网（Corning#352360）
• 血细胞计数板（Brand#717805）
• 24孔细胞培养板（Corning#3526）
• 5 mL注射器（带钝针头）（PBM#303002）
2.3 设备
• 摇床
• CO2培养箱
• 液氮罐
• 共聚焦显微镜
3.0 培养基配置
|
组份 |
原浓度 |
工作液浓度 |
|
Advanced DMEM/F-12 |
1× |
|
|
HEPES |
1M |
10 mM |
|
L-谷氨酰胺 |
200 mM |
2 mM |
|
N-2 添加剂 |
100 X |
1 X |
|
B-27™添加剂 |
50 X |
1 X |
|
重组小鼠R-Spondin-1 |
200 ng/mL |
|
|
重组小鼠EGF |
100 ng/mL |
|
|
重组小鼠Noggin |
100 ng/mL |
|
|
N-acetyl-L-Cysteine |
1 mM |
注：对于结肠的培养，可以在培养基中添加终浓度为100 ng/mL的Wnt-3a。
4.0 小鼠肠类器官培养流程图
5.0小鼠肠类器官培养
5.1分离小肠隐窝
1) 将小鼠断颈处死后，收集自末端回肠起约15 cm肠段，置于预冷的D-PBS+抗生素(1 X)洗涤液中（含抗生素），使用无菌尖头镊子去除肠道外部的膜、血管和脂肪，用注射器从小肠一端注入预冷的D-PBS+抗生素(1 X)进行冲洗。
图1. 小鼠肠道的分离
A）去除小鼠肠道上的外膜和脂肪 B）去除外膜后的小鼠肠片段
2) 使用小剪刀，将肠段纵向切开，肠腔朝上打开。用预冷的D-PBS+抗生素(1 X)（2-8°C）轻轻洗涤切开的肠道片段，用无菌玻片刮出肠管内容物和绒毛结构，再次用预冷的D-PBS+抗生素(1 X)冲洗。
图2. 小鼠肠片段制备步骤
A）切开肠段 B）用1mL冷的PBS洗涤肠段
3) 向50 mL离心管加入15 mL预冷的D-PBS+抗生素(1 X)。用镊子夹住肠道一端，并悬在管口上。从肠道底部开始，用无菌剪刀将肠切成1-2 mm的小片，让这些碎片落入管内的缓冲液中。
4) 用D-PBS+抗生素(1 X)预先润湿10 mL移液管，加入15 mL预冷的D-PBS+抗生素(1 X)清洗肠道碎片5-10次，直至上清液变澄清（如图3）。
图3 小肠组织清洗澄清后的上清液
5) 除去上清液，将组织碎片重悬于25 mL小肠隐窝消化液（含2-5 mM EDTA的D-PBS+抗生素(1 X)缓冲液）中，置于冰上孵育20 分钟，冰盒置于20 rpm转速摇床上旋转30 分钟。
注：此步骤后可以让组织碎片自然沉降后去除上清，继续消化一次。
6) 让组织碎片通过重力自然沉降约1分钟。小心吸出并丢弃消化液，留下足够的液体以浸没过组织碎片。
7) 将组织碎片重悬于10 mL预冷的含10%FBS的D-PBS+抗生素(1 X)缓冲液，并用移液管上下吹打三次。静置直到大部分肠组织碎片沉降到底部（如图4）。
图4 吹打后的小肠上清液，含有小肠隐窝
8) 小心吸取上清液并用70 μm或者100 μm滤网过滤，将滤液收集于干净的50 mL离心管中。
9) 重复上述步骤7-8至少2次，获得的三份（甚至多份）过滤液混合。
10) 在2-8 ℃下将上述混合液以290×g离心5分钟（水平离心转子，非定角转子）。小心倒出并丢弃上清液。
11) 将沉淀重悬于10 mL D-PBS缓冲液中。200×g离心3分钟。轻轻倒出上清液。将肠隐窝沉淀留在管中。加入2 mL基础培养基（Advanced DMEM/F-12+10 mM Hepes+2 mM L-谷氨酰胺）重悬沉淀，如果单细胞过多，200×g离心2 分钟 收集上清以去除单细胞。
12) 计数：使用预先润湿的移液吸头，吸取10 μL置于血细胞计数器上。使用倒置显微镜，计数10 μL样本中的隐窝数量。不要计算单个细胞或大的多层组织碎片。
13) 计算含有大约750、1500、3000个隐窝的所选馏分的体积。将所需体积分别转移至三个做相应标记的15 mL锥形管中，并以200 x g和2-8℃离心5分钟。小心吸出并弃去上清液。
-
示例：馏分体积计算
每10 μL样本中所含的隐窝数量：15个
15×100=每毫升馏分约含1500个隐窝
计算步骤4中所需馏分的体积：
750个隐窝需要0.5 mL馏分
1500个隐窝需要1.0 mL馏分
3000个隐窝需要2.0 mL馏分
14) 将所需体积分别转移至三个做相应标记的15 mL离心管中，并以200 x g和2-8℃离心5分钟。小心吸出并弃去上清液。
15) 将150 μL于室温（15-25℃）的完全肠器官生长培养基加入每个离心管中。不要使用冷的培养基。
5.2小肠类器官培养
1) 在步骤15 的离心管中加入150 μL未稀释的预冷基质胶混合隐窝，小心地上下吹打十次以充分混匀，注意避免产生气泡。
2) 吸取50 μL悬液，加入到提前预温（室温或37℃）的24孔板每个孔的中心部位。样品应在每个孔的中心形成圆顶穹隆状结构。为了防止接种时出现气泡，枪头内液体不要全部打出。
注：可以根据具体实验对接种的隐窝数量进行优化，从而获得最优的类器官数量。
3) 将培养板放入37 °C培养箱静置10分钟以待基质胶完全凝固。将培养板转放入培养箱时，应注意不要破坏凝固后的穹隆状结构。
4) 然后将培养板小心翼翼拿出放入生物安全柜，使用移液器沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入500 μL室温（15-25℃）的类器官完全培养基。不要将培养基从圆顶上直接加入。
5) 向其它未接种的孔中加入无菌D-PBS以保证培养时的湿度。将培养板的盖子盖好，并在37 ℃、5％CO2下进行培养。
6) 观测类器官生长情况。通常，隐窝开始培养约3小时后开始陆续形成球状结构，通常在培养2-4天后，小肠类器官开始出芽，并且在第5-7天形成复杂的出芽状结构。
7) 隔天进行完全换液。换液时将移液吸头放在孔底边缘小心地将原有液体培养基吸出，并加入为500 μL新鲜的室温类器官完全培养基。
图5 基质胶接种入培养板后形成的液滴
图6 培养10天后的小肠类器官
6.0 小肠类器官的传代
1) 在成熟类器官的24孔板中，每孔加入约1 mL预冷的基础培养基，用1 mL吸头吹打板底的基质胶，直到基质胶全部打碎，收集每个孔中的悬液置于15 mL离心管中。
2) 将离心管置于冰上5-10分钟，使基质胶软化，用1 mL钝针头继续吹打30次左右，直至基质胶完全碎裂，此过程避免产生气泡（量程调到700 μL可避免气泡产生），可取适量的悬液观察，直至看不到大块的类器官团块全部碎裂，停止吹打。
注：此过程也可将全部打碎的基质胶悬液吸入注射器内，再将悬液通过注射器针头打出，通过机械力将类器官团块分离。
3) 传代时，若隐窝状态良好可进行1:3传代，若状态较差可进行1:1传代。全程可以维持约3个月的长期传代扩增，且类器官状态保持良好。
图7 小肠类器官传代在基质胶中培养3天 图8 小肠隐窝干细胞在基质胶中培养7天
7.0 小肠类器官的冻存与复苏
7.1 小肠类器官的冻存
1) 将需要冻存的类器官置于冰上5-10 分钟。
2) 收集类器官，同传代收集类器官一样。
3) 离心后弃上清，用1 mL的无血清冻存液重悬，将悬液移至冻存管中，放入冻存盒中于-80 ℃冰箱中保存24小时，如需长久保存，则24小时后转移至液氮罐保存。
注： 操作迅速，尽量缩短未冻存的类器官与无血清冻存液的接触时间。
7.2 小肠类器官的复苏
从液氮中取出冻存管后，立即放入37 ℃水浴中，使之迅速融解。等到冻存管中仅存一小片冰晶，迅速将细胞转移到含9 mL预冷的基础培养基中(先将之置于15 mL离心管中，放于冰上)。200xg 室温离心5 分钟，弃去上清，加入适量类器官完全培基重悬后与基质胶混合接种，待基质胶凝固后加入类器官培养基，将培养板放入培养箱。
8.0 小鼠肠类器官IF染色
8.1 试剂配制
· 封闭缓冲液 ：PBS+10% 山羊血清+ 1% Triton-X 100+ 0.2% 叠氮化钠，4℃短期存储，最多过夜。
· 抗体稀释液：PBS+1%山羊血清+0.2% Triton-X 100+0.2%叠氮化钠，4℃短期存储，最多过夜。
· 洗涤液：PBS+3% NaCl+0.2% Triton-X 100，4℃存储。
· DAPI：制备1mg/mL储存液，以1:2000稀释后备用。
8.2 操作流程
1) 使用温和细胞解离液从Matrigel中分离类器官。
2) 室温（15-25℃）用4%的PFA（多聚甲醛）固定类器官4-6 小时。
3) PBS洗涤三次，每次30分钟。
4) 室温（15-25℃），用2% PBST溶液（含2%Triton X-100的PBS）过夜进行类器官透化。
5) 加入封闭缓冲液，置于振荡器或摇床上4℃2天。
6) 吸去培养孔中的封闭液，按照说明书加入适量的一抗。置于振荡器或摇床上2-8℃，孵育4-5（4天可以）天。
注：具体孵育时间视类器官大小确定。
7) 室温（15-25℃）震荡洗涤2次，每次不少于1小时。
8) 根据说明书加入适量的荧光二抗，4℃震荡避光孵育2-3（3天可以）天。
9) 室温（15-25℃）震荡洗涤2次，每次不少于1小时。然后，将样本置于轨道摇床或摇床上的洗涤缓冲液中，4℃过夜。
注：洗涤步骤对免疫染色相当重要！
10) 加入DAPI，4℃摇床过夜。用PBS洗涤三次，30分钟/次。
11) 将样本转移到添加有5倍样本体积Rapiclear(RC)1.52透明试剂的24孔板上或2mL EP管中。在透明之前将Rapiclear(RC)1.52透明试剂预热至37℃，便于溶液渗透。
12) 将培养板放置在振荡器或摇床上，轻轻混合并将试样与Rapiclear(RC)1.52透明试剂浸泡不小于6小时。
13) 将iSpacer粘在载玻片或盖玻片上，将样本置于iSpacer孔内，加入新鲜透明试剂 ，盖上盖玻片。用无尘纸吸去iSpacer周围多余的液体。封片。
14) 用共聚焦显微镜或双光子显微镜观察。
表1 推荐的一抗和二抗
|
货号 |
名称 |
|
PA5-87974 |
LGR5 Polyclonal Antibody |
|
PA5-79702 |
MUC2 Polyclonal Antibody |
|
53-3249-82 |
CD324 (E-Cadherin) Monoclonal Antibody (DECMA-1), Alexa Fluor 488 |
|
MA5-32154 |
Lysozyme Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (ST50-02) |
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MA5-13096 |
Chromogranin A Monoclonal Antibody (LK2H10) |
|
A32731 |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 |
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A-21124 |
Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 |
|
PA5-29078 |
Villin Polyclonal Antibody |
|
PA5-32349 |
Chromogranin A Polyclonal Antibody |
|
31235 |
Rabbit IgG Isotype Control |
|
53-4301-80 |
Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), Alexa Fluor 488 |
|
14-4714-82 |
Mouse IgG1 kappa Isotype Control (P3.6.2.8.1), eBioscience™ |
9.0 小肠类器官培养注意事项
· 肠道外部的膜、血管和脂肪，尽量去除干净，否则后续得到的分馏会有很多杂细胞污染。
· 用注射器往肠腔内注入D-PBS，冲洗掉小肠内容物，可以减少后续洗涤时间。
· 用无菌的载玻片刮去小肠内绒毛组织，尽量去除干净，可以减少杂细胞的产生，另外可以有助于小肠组织的消化，得到更多的小肠隐窝。
· 小肠隐窝消化液用5 mM的EDTA，注意EDTA是否有析出，如析出太多会影响终浓度，有必要更换新的EDTA。因分离小肠隐窝需要时间较久，建议整个操作在低温进行，离心机调至4℃，D-PBS放冰上。试用移液器前用预冷的D-PBS润洗移液器枪头。
· 分离隐窝使用预冷的D-PBS+抗生素(1 X)洗涤液中（含抗生素），并在4°C下进行，会最大限度的降低对隐窝的损伤。
· 使用2mm的肠段在本操作流程中可进行有效的清洗和隐窝的分离。 较大的肠段可能需要更多次数的冲洗，且导致较低的隐窝回收率。
· EDTA消化后，小肠组织会变松散，在外界机械力作用下，小肠隐窝会从组织中分离出来，可以重复几次通过外界机械力作用得到不同的分馏组分，可以挑选隐窝含量较高，杂细胞较少的分馏组分种板培养。
· 接种的类器官为200个，生长的类器官的生长情况会比较好。
· 购买的基质胶在冰上融化后分装冻存，操作过程中基质胶一定要放在冰上，未用完的液体状基质胶可以冻存，若凝固后请弃去。
· 基质胶种板前需要将培养板放入培养箱预温30分钟，拿出培养板后尽快种板，以便形成更好的基质胶圆顶穹隆结构。
10.0 参考文献
1) Sato T et al. (2011) Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epitheliumGastroenterology 141(5): 1762–72.
2) Sato T et al. (2009) Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche Nature 459(7244): 262–5.
3) Jung P et al. (2011) Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells Nat Med 17(10): 1225–7.
4) Spence JR et al. (2011) Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro Nature 470(7332): 105–9
5) van de Wetering M et al. (2015) Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients Cell 161(4): 933–45
6) Watson CL, Mahe MM, Múnera J, et al. An in vivo model of human small intestine using pluripotent stem cells. Nat. Med. 2014; 20:1310-1314.
11. 小鼠肠类器官荧光染色操作流程
固定
注意: 合并2-3孔的几十个类器官最为理想，但也可只使用一个孔的类器官。
使用PFA固定和O.C.T包埋的实验流程
使用1.5 mL的EP管收集类器官，使用4% PFA溶液室温固定半小时。室温下用PBS清洗3次，每次5分钟。然后将样本转移至30% 蔗糖溶液4℃孵育过夜。第二天，移除蔗糖溶液，在O.C.T中孵育15分钟。将类器官转移至组织模具中，置于-20℃，继续在O.C.T中进行包埋。可于-80℃储存或进行冷冻切片。
使用福尔马林固定和琼脂糖包埋的实验流程
1. 从孔板中吸出培养基。加入1 mL的福尔马林。
2. 使用1 mL的枪头轻柔地重悬类器官和基质胶，将混合物转移至EP管中。将所需的所有孔的类器官加入同一EP管中。（也可以在孔板中进行固定，一起重悬）
3. 轻轻混合，放在冰上孵育至少一个小时。
4. 4℃，1500 rpm，离心5分钟。
5. 小心地吸出福尔马林。
6. 用冰冷的PBS清洗，4℃，1500 rpm，离心5分钟，小心吸出PBS。重复至少两次。（为了帮助去除Matrigel，也可加入Cell recovery medium，冰上孵育15-30分钟）
7. 使用冷的福尔马林重悬类器官，4℃孵育过夜。
注意：染色方面，类器官切片的处理方式与其他组织切片一样，使用一般脱蜡，补液，抗原修复等的常规步骤。
hPSC-Derived Intestinal Organoid, EPCAM (Green), KRT20 (Red), Desmin (White), DAPI (Blue)
8. 准备模具：准备1条8-strip PCR管，分成单个管，切掉管的下半部分，得到一个圆环作为模具。将模具放到培养皿中，使其与底部平齐，然后放在冰上。
9. 使用福尔马林轻柔的混合类器官，4℃，1500 rpm离心5分钟。轻轻吸出福尔马林，不要接触到沉淀的类器官。如果观测到成块的基质胶，可使用 cell recovery medium（Corning,#354253）冰上孵育30分钟。再次离心，尽量吸出所有的液体。
10. 使用无菌的PBS配制3% 低融点的琼脂糖。使用微波炉加热至完全融化。
11. 趁琼脂糖溶液还保持温热的液体状态时，使用75 µL的琼脂糖液体轻柔地重悬类器官。如果使用 200 µL或更小的枪头，剪掉枪头尾部，防止损伤类器官。
12. 立即将重悬后的类器官和琼脂糖液体转移入冰上放置的培养皿中的模具中。琼脂糖会立即固化。第11步和第12步一定要完成的越快越好（15秒以内），否则琼脂糖会在枪头中固化，造成样本的损失。避免引入气泡，但少量的气泡可能无法避免。
13. 在倒置显微镜检查琼脂糖包埋的类器官的数量，质量和位置。
14. 在4℃孵育1个小时以上，确保琼脂糖固化完成。
15. 从模具中取出，转移到组织盒中，使用70% 乙醇储存。
hPSC-Derived Hindgut Spheroid, EPCAM (Green), CDX2 (Red), E-Cad (white), DAPI (Blue)
补液，抗原修复和染色
补液（Rehydration）
1. 把切片放入接近沸腾的热水中加热11分钟。（切片应放入切片盒内，且保持干燥。）
2. 使用组织级别的二甲苯里清洗2分钟。重复4遍。
3. 使用100% 乙醇清洗5分钟。重复2遍。
4. 使用90% 乙醇清洗5分钟。
5. 使用70% 乙醇里清洗5分钟。
6. 使用dH2O清洗5分钟。
|
注意： - 免疫荧光染色（Immunofluorescent staining ）， 请继续进行第7-18 步- H&E 染色（H&E staining ）， 请继续进行第19-24步- 阿尔新蓝染色（ Alcian Blue staining）， 请继续进行第25-32步。 |
抗原修复
7. 将切片放入密封的切片盒中。使用微波炉将柠檬酸盐缓冲液（10 mM 柠檬酸钠，0.05% tween-20，pH 6.0）加热至沸腾。用缓冲液加满切片盒，没过所有的切片。
8. 将放有切片的切片盒和缓冲液置于蒸器中30分钟。（需要保持温度接近沸点，而不要到达沸点。）
9. 将切片从柠檬酸钠缓冲液中取出，短暂降温，然后用PBS缓冲液清洗2分钟。
染色（免疫荧光）
10. 晾干切片，使用免疫组化笔标出类器官切片的部分。
11. 使用适合的封闭缓冲液在室温封闭1小时（或按照常用的封闭方法进行封闭）。
12. 加一抗，室温孵育2小时，或在4度孵育过夜。
13. 用PBS清洗2次，每次2分钟。
14. 加二抗，室温孵育1小时。避光。
15. 用PBS清洗两遍，用dH2O清洗一遍。每次2分钟，晾干。
16. 在每个切片上加一滴含DAPI的ProLong® Gold防猝灭封固剂(Thermo,#P36941)，轻轻覆盖一片盖玻片。用一个200 µL枪头轻压盖玻片，压出气泡。静置10-15分钟。
17. 使用透明的指甲油封上载玻片，晾干15分钟。
18. 使用荧光显微镜观察。
染色（H&E）
19. 把类器官部分放在haematoxylin里5分钟，然后使用自来水清洗1分钟 。
20. 对类器官切片进行染色（如苏木精染色），可以用碳酸锂或“Scott’s tap water” 染色1分钟，然后用自来水清洗一分钟。
21. 将切片放在1% acid alcohol里30秒，用自来水清洗1分钟。
22. 把切片放入eosin（伊红）内染色5分钟，用自来水请洗1分钟。
23. 脱水：使用95% 乙醇脱水10分钟×2。使用100% 乙醇脱水3分钟×2。使用二甲苯脱水5分钟×3。
24. 使用封固剂将切片固定，用指甲油密封。
染色（阿尔新蓝）
a) 3% 醋酸溶液：冰醋酸 3 mL，dH2O 97 mL
b) 阿尔新蓝溶液 （Alcian Blue solution） pH 2.5：dH2O 97 mL，3% 醋酸溶液 3 mL，阿尔新蓝 （Alcian Blue）1 g，使用蒸馏水溶解染料，加酸搅匀。用醋酸溶液来调整pH，过滤*。避光保存。
*使用阿尔新蓝溶液（Alcian Blue） 前一定要过滤
c) 0.1% 核固红
25. 将切片放入3% 醋酸溶液3分钟（用来当媒染剂）。
26. 使用过滤后的阿尔新蓝溶液（Alcian Blue） pH 2.5室温染色30分钟。
27. 使用自来水清洗2分钟。
28. 用蒸馏水冲洗。
29. 使用0.1% 核固红复染2到5分钟。
30. 用自来水冲洗2分钟。
31. 使用二甲苯脱水，清洗
70% 乙醇 - 2分钟
95% 乙醇 - 2分钟×2
100% 乙醇 - 2分钟×2
二甲苯 - 3分钟×2
32. 使用合成永久性封固剂固定切片。这个步骤需在通风柜内完成。固定前，把切片置于二甲苯中。保持湿润。切片上有二甲苯有利于封固剂的固定。
注意：使用不同pH的阿尔新蓝（ Alcian Blue）可检测更酸性或更硫酸化粘蛋白（sulfated mucins）。但若要检测这些蛋白，需使用不同的酸进行溶解。
阿尔新蓝 （Alcian Blue）pH 1.0：使用90 mL的蒸馏水里和10 mL的1N盐酸（hydrochloric acid）溶解1g的阿尔新蓝（Alcian Blue）。
配制1N盐酸：蒸馏水 915 mL，浓盐酸（concentrated hydrochloric acid) 85 mL
阿尔新蓝 （Alcian Blue） pH 0.2：使用100 mL的10% 硫酸（sulphuric acid）溶解把1 g的阿尔新蓝（Alcian Blue）
配制10% 硫酸溶液：蒸馏水 90 mL，浓硫酸 10 mL
当使用强酸染料溶液时，将复染核固红之前的清洗改为排酸并用纸吸干。