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胰腺类器官研究
类器官是自我组织形成的三维（3D）细胞培养物，包含所代表器官的一些细胞类型和关键特征。由于维持了干细胞和祖细胞的增殖能力，上皮类器官在培养物中维持培养远远优于离体原代细胞的培养。由于它们能在体外进行有效生长并与胰腺上皮细胞直接相关，可以使用胰腺外分泌类器官来补充或替代许多胰腺研究实验方法。
1. 胰腺类器官
胰腺是分解淀粉、蛋白质和脂肪，以及平衡体内葡萄糖的消化和内分泌器官。尽管过去几十年，对胰腺癌的研究非常普遍而且重要，胰腺外分泌腺组织的体外长期维持方法近期才被报导1, 2。在该系统中，分离的胰腺导管在添加有适当的生长因子和细胞外基质的培养环境中，形成胰腺外分泌类器官。类器官是自我组织形成的三维（3D）细胞培养物，包含所代表器官的一些细胞类型和关键特征。由于维持了干细胞和祖细胞的增殖能力，上皮类器官在培养物中维持培养远远优于离体原代细胞的培养。由于它们能在体外进行有效生长并与胰腺上皮细胞直接相关，可以使用胰腺外分泌类器官来补充或替代许多胰腺研究实验方法。与其他常见模型系统相比，类器官可来源于健康和特定疾病组织的细胞。从小鼠原代肿瘤和转移瘤中分离的组织可以构建出肿瘤源性的类器官，为胰腺癌和胰腺导管腺癌的研究提供模型3。这些类器官保留了肿瘤的关键特征，包括基因表型和细胞表型，这为体外实验提供了一个方便的模型系统。
PancreaCult™类器官生长培养基（小鼠）适用于来源于胰腺导管、导管小段、单个细胞或冻存的类器官的胰腺外分泌类器官的生长。胰腺类器官的维持可以通过长期传代或冷冻保存，为实验提供稳定的细胞来源。通常情况下，在原代培养物中，2天内便可观察到类器官，并且在约 3-6天后可进行传代。生长在PancreaCult™类器官生长培养基（小鼠）中的胰腺外分泌类器官表达胰腺祖细胞（例如 Pdx1，Axin2）和导管细胞（例如 Krt19，Muc1）标志物。
小鼠胰腺类器官完全培养基
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培养基 |
图片
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PancreaCult™类器官生长培养基（货号#06040）是一款无血清，成份明确的，用于建立和培养小鼠胰腺外分泌器官的培养基。这些器官，或者叫“迷你胰腺”为研究胰腺细胞生物学、疾病建模和胰腺癌提供了体外类器官培养系统。 PancreaCult™中生长的类器官具有表达胰腺干细胞基因（LGR5）、祖细胞(PDX1, SOX9)和导管细胞(CAR2, MUC1, KRT19)的上皮细胞特性。胰腺类器官可以每隔3-6天传代一次的进行长期维持，也可以冷冻保存。 PancreaCult™类器官培养基（小鼠）可使研究人员能够从新鲜分离的胰管片段或单个细胞中建立胰腺外分泌类器官样培养体系，并在熟悉的Matrigel®穹顶中培养胰腺类器官，或在稀释的Matrigel®混悬液中培养来进行大规模扩增。
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来源于胰腺癌组织的类器官可在PancreaCult™类器官生长培养基（小鼠）中进行培养。从KPC小鼠（Kras+/LSL-G12D；Trp53+/LSL-R172H；Pdx1-Cre）分离胰管并将其在PancreaCult™类器官生长培养基（小鼠）中培养。生成的类器官在（A）原代培养的第4天和（B）第一次传代后的第三天进行成像。类器官于培养期间保留激活的KRAS基因表型。数据来源于David Tuveson博士，经许可后使用。 |
胰腺类器官培养方法
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Pancreas胰腺
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细胞来源 |
相关细胞因子和小分子 |
相关培养基 |
文献 |
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Adult mouse |
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Adult human |
Sylvia F Boj, Chang-Il Hwang, Lindsey A Baker, et al.,Cell. 2015 |
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参考文献
1. Huch M, et al. (2013) Unlimited in vitro expansion of adultbi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. EMBO J.32(20): 2708-21.
2. Broutier L., et al. (2016) Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11(9): 1724-43.
3. Boj SF, et al. (2015) Organoid Models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160(1-2): 324-38.
2. 小鼠胰腺类器官稀释的Matrigel悬浮培养操作流程
除了能以Matrigel dome的方法培养外，类器官还可以稀释的Matrigel悬浮方法培养。当采用悬浮培养方法时，Matrigel形成类似于“云”状的半固体，一种松散的囊状类器官。相比Matrigel dome培养方法，悬浮培养方法扩大了培养的规模。这种培养方法，由于减少了培养基的更换次数，降低了对Matrigel物理稳定性的依赖，因此更适合高通量培养。与 Matrigel dome 方法培养的类器官相比，稀释的Matrigel悬浮方法培养的类器官通常在较早的时间内就能传代，通常在3-6天内，并可通过传代进行维持培养，或者冻存起来，未以后实验做准备。
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Matrigel Dome培养 |
稀释的Matrigel悬浮培养 |
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以组织或类器官碎片进行 |
以单细胞进行 |
以组织或类器官碎片进行 |
以单细胞进行 |
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从新鲜的胰腺组织进行原代培养 |
小鼠胰腺类器管Matrigel dome培养“A节” |
小鼠胰腺类器管Matrigel dome培养“2.1节” |
小鼠胰腺类器管稀释的Matrigel悬浮培养“3.1节” |
小鼠胰腺类器管Matrigel dome培养“2.1节” |
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传代已经建立的类器官 |
小鼠胰腺类器管Matrigel dome培养“B节” |
小鼠胰腺类器管Matrigel dome培养“2.1节” |
小鼠胰腺类器管稀释的Matrigel悬浮培养“3.2节” |
小鼠胰腺类器管稀释的Matrigel悬浮培养“3.2节” |
试剂材料
主要试剂
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名称（货号） |
组份 |
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PancreaCult™类器官生长培养试剂盒（#06040） |
PancreaCult™类器官生长基础培养基（#06041） |
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PancreaCult™类器官生长添加物（#06042） |
其它试剂和材料
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货号 |
名称 |
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DMEM/F-12+ 15 mM HEPES |
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抗黏附缓冲液 |
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IV 型胶原酶, 100 mL |
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Dispase 1U/mL, 100 mL |
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CryoStor CS10冻存液 |
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38045 |
未经组织处理过的100 mm 培养皿 |
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不含Ca2+& Mg2+的D-PBS |
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37 µm 可翻转滤网 |
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红细胞裂解液 |
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Corning,#3737 |
未经组织处理过的12孔培养板 |
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Corning 356231* |
Corning Matrigel |
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Corning，#352070 |
50 mL离心管 |
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Corning，#352196 |
15 mL离心管 |
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croning,#3526 |
TC-treated 24孔细胞培养板 |
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croning,#3516 |
TC-treated 6孔细胞培养板 |
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Thermo Fisher,#12634010 |
Advanced DMEM/F-12 |
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ThermoFisher,#12605010 |
TrypLE™酶 |
1 胰腺类器官培养的通用流程
1.1 预先湿润培养器皿
与胰腺组织接触的锥形离心管（下文中简称“离心管”）和血清移液管 应预先润湿，因为组织经常粘附在其表面上，从而大大降低了类器官 的产量。实验当天将离心管和移液管预先湿润。 对15 mL离心管进行预湿润：首先向该管添加5 mL Anti-Adherence Rinsing Solution（产品号 #07010），摇晃以彻底润洗。将Rinsing Solution倒入下一离心管，重复进行，直到所有离心管都被预先湿润。 用相同体积的Advanced DMEM/F-12（Thermo Fisher #12634010）重 复这些润洗步骤。对50 mL离心管进行预湿润：使用以上步骤，更改 溶液为30 mL。预湿润后的离心管，将盖子拧紧，可在室温（15 - 25℃）下保存直至使用。对移液管和枪头进行预湿润：首先在一个 15 mL离心管中加入10 mL Anti-Adherence Rinsing Solution，并在第 二个15 mL管中添加10 mL Advanced DMEM/F-12。使用移液管或枪 头前，依次用两种溶液润洗。
1.2 推荐的接种密度
为了获得最佳结果，从一个胰脏（参见PIS）收集的胰腺组织片段按照 团块接种的方式接种到4个孔中（每孔一个30 μL Matrigel® dome）， 若按照单细胞接种的方式，则接种至8个孔中（参照2.1部分）。类器官 体系建立后（p1以后），每30 μL Matrigel® dome中接种200个类器官 片段（PIS Section B）或5,000 - 10,000单个细胞（下文第2.2节）。 重要的是不要接种过多类器官培养物。如果Matrigel® dome中接种 了太多的起始细胞，类器官将无法正常生长，并且会损害基质的结构 稳定性。
1.3 胰腺外分泌类器官的传代时间
原代培养体系（p0）建构的类器官，每4 - 7天即可进行传代，经一次 传代后（p1+），一般3 - 5天需要进行一次传代。传代的最佳时间为类 器官内腔开始变暗，不同的培养体系传代时间可能会有所差别，也会 因接种的起始密度和组织来源而不同。如果大部分的类器官中心腔清 晰、小于100 μm，则将培养物放回培养箱中再培养一天。 如果大部分的类器官中心腔变暗或开始塌陷（图1C和2C），仍然有机 会通过传代使培养物恢复。在进行传代时，只对类器官片段进行计 数，不计入单个细胞（图3），每孔接种200个类器官片段。发暗及塌陷 的类器官培养物也可能通过单细胞传代（下文第2.2节）恢复，由于单 细胞传代可以选择性扩增健康的干细胞群。
1.4 机械研磨和收集类器官片段
长大后的类器官在传代过程中被机械研磨，得到小于100 μm的类器 官片段（图3A）。如果大部分片段大于100 μm（图3B），在收集类器官 片段前继续进行研磨。当进行类器官片段计数时，仅对小于100 μm的 片段计数，不计入单个细胞（图3C）。
图1. 使用PancreaCult™类器官生长培养基（小鼠），在Matrigel® Domes中生长的胰腺外分泌类器官
（A）大多数胰腺外分泌类器官的直径仍小于100 μm，内腔清晰，无需传代。 （B）大多数类器官大于100 μm，少数类器官的内腔变暗，适宜传代。 （C）过度生长的类器官培养体系，大多数类器官内腔变暗，甚至塌陷。
图2 以稀释的Matrigel悬液方法在 PancreaCult™ 类器官样生长培养基中培养类器官
（A）大多数胰腺类器官直径仍小于100μm，显示出清晰的管腔，尚未准备好传代。（B）大多数类器官直径大于100 μm，其中一些类器官的管腔变暗。这些培养物已经可以传代了。（C）类器官已经超过最佳传代时间，大部分类器官的官腔变暗，许多类器官已经塌陷。
图3 胰腺类器官以100 μm的碎片进行传代
（A）在传代过程中，机械解离类器官应形成直径在30-100 μm之间的碎片。（B）直径大于100 µm的类器官碎片应该继续解离，直至其直径达到30-100 µm。(C)在解离期间，计数直径为30-100 µm碎片(见圆圈标记)，忽略单个细胞
2.0 将原代的胰腺组织和培养的胰腺外分泌类器官解离为单个细胞
2.1 将原代的胰腺组织织解离为单个细胞
1) 准备 PancreaCult™类器官生长培养基。本流程中需在 PancreaCult™类器官生长培养基中加入Y-27632使其终浓度达到10 µM。（见“胰腺类器管生长培养基”节）
2) 准备DNase I + TrypLE™溶液（见“组织解离液”节）。
3) 如A节步骤1-14所述，用单个小鼠胰腺分离胰腺导管。以下操作用于处理1/4收获的胰腺组织，在4.1.1节步骤14时将悬液合并。
4) 290 x g离心5分钟。尽可能多的吸去上清，而不扰动沉淀物，在管中留下约5-10 µL液体。
5) 在沉淀物中加入1 mL DNaseⅠ+TrypLE™溶液。用润洗的10 mL移液管，轻轻上下吹打5-10次重悬细胞团。加入另外的DNaseⅠ+TrypLE™溶液，使总体积为4 mL。置于37℃，水浴10分钟将收集的组织碎片消化成单细胞。
6) 使用润洗的5 mL移液管，上下吹打悬液5次。在试管中加入8 mL Adanced DMEM/F-12。
7) 290 x g离心5分钟。尽可能多的吸去上清，而不扰动沉淀物，在管中留约5-10 µL上清液。
8) 使用润洗的10 mL移液管，在试管中加入5 mL Adanced DMEM/F-12上下吹打5次重悬细胞团。
9) 将细胞悬液通过一个置于15 mL离心管的37 µm的可翻转滤网，收集滤液。用2.5 mL Adanced DMEM/F-12清洗含有悬液的离心管，然后再将悬液通过滤网，并再次收集滤液。弃去滤网。
10) 进行细胞计数，评估悬液中细胞数量。
11) 在润洗的5支离心管中，每支加入5000个细胞，每支离心管中预先添加了1 mLAdanced DMEM/F-12。仔细稀释细胞很重要，不要过度接种。
12) 290 x g离心5分钟。在不扰动细胞团的情况下，尽可能多的吸去上清液，离心管中留下约5-10 µL上清液并将其置于冰上。
13) 按照A节步骤20-29以Matrigel-dome培养，或以稀释的Matrigel悬浮培养(见“小鼠胰腺类器官稀释的Matrigel悬浮培养”）接种胰腺祖细胞。
2.2 将在Matrigel® Domes中培养的胰腺外分泌类器官解离为单细胞
1) 按照"小鼠胰腺类器官Matrigel dome培养操作流程"步骤B.1 - 8处理Matrigel® domes。
2) 290 x g，离心5分钟。吸出尽可能多的上清液，不要干扰沉淀，在 管中留下约5 - 10 μL液体。置于冰上。
3) 加入500 μL温和细胞解离试剂（Gentle Cell Dissociation Reagent，GCDR，产品号 #07174），轻轻上下吹打5 - 10次。放置 在37℃水浴中10分钟，以将收集到的类器官片段解离成单个细 胞。
4) 加入500 μL Advanced DMEM/F-12。
5) 290 x g，离心5分钟。吸出尽可能多的上清液，不要干扰沉淀，在 管中留下约5 - 10 μL液体。
6) 加入1 mL冷的Advanced DMEM/F-12重悬沉淀。使用细胞计数 板进行细胞计数。
7) 由于每孔需接种5,000 - 10,000个细胞，将对应数量的细胞加 入相应的15 mL离心管中，每管预先加入1 mL冷的Advanced DMEM/F-12。小心分装细胞，注意不要过量接种细胞（参见上面 的1.2节）。
8) 290 x g，离心5分钟。吸出尽可能多的上清液，不要干扰沉淀，在 管中留下约5 - 10 μL液体。置于冰上。 注意：沉淀通常很难看到。
9) 接下来的传代流程请参考"小鼠胰腺类器官Matrigel dome培养操作流程"的步骤A.20 - 29。
3.0 对使用Dilute Matrigel® Suspension方法培养的胰腺外分泌类器官类器官的构建和传代
除了在Matrigel® dome中培养外，还可以在稀释的Matrigel®悬浮液 （Dilute Matrigel® suspension）中培养胰腺外分泌类器官。当悬浮 培养时，Matrigel®会形成半固态的“云”状体，松散地包裹正在生长的 类器官。悬浮培养方法使培养的规模得以扩大，超出了在Matrigel® dome中进行接种的实验通量。扩大的原因是由于减少了培养基换液 的步骤，减少了对Matrigel®物理稳定性的依赖，以及使用了更适合于 高通量的实验流程。与在Matrigel® domes中生长的类器官相比，在 dilute Matrigel® suspension中生长的类器官通常可以更早地传代，通 常在3 - 6天之内即可进行传代，也可以对培养物进行冻存，留待后续 实验使用。
3.1 使用Dilute Matrigel® Suspension方法建立类器官培养体系
1)将用于悬浮培养的已包被好的12孔板置于2-8°C下至少10分钟。将无菌1000 µL和200 µL枪头置于2-8°C。
2)冰上融化500-1000 µL Matrigel。
3)准备完全的PancreaCult™胰腺类器官生长培养基并置于冰上（见小鼠胰腺类器官Matrigel dome培养3.1节）。
4)准备组织润洗解离液（见小鼠胰腺类器官Matrigel dome培养3.2节）。升温至室温（15-25℃）。
5)如“小鼠胰腺类器官Matrigel dome培养”A节步骤4-21所述将小鼠胰腺组织加工成导管碎片，或按照上述2.1节将原代胰腺组织分离成单细胞。
6)使用预冷的枪头，在添加了900 µL预冷PancreaCult™胰腺类器官生长培养基的15 mL离心管中加入100 µL解冻的Matrigel用以接种1个培养孔（如果接种10孔，离心管应该包含9 mL的PancreaCult™胰腺类器官生长培养基+1 mL Matrigel）。充分混合并置于冰上。
7)将冷却的12孔板置于冰上，并将950 µL Matrigel+PancreaCult™类器官生长培养基的混合物添加到每个孔中进行接种。
8)如下所述，一次处理一个来自“小鼠胰腺类器官Matrigel dome培养”A节步骤19的离心管/细胞团。将Matrigel添加到细胞团，快速操作，以确保Matrigel不凝固。
9)使用带有预冷的200 µL枪头的移液枪，在细胞团顶部加入50 µL Matrigel+PancreaCult™胰腺类器官生长培养基的混合物（3.1.6中制备）。
10)上下吹打5-8次，轻轻混匀，避免产生气泡。
11)将整个悬浮液转移至含有950 µL Matrigel+PancreaCult™类器官生长培养基的混合物的12孔板的1个孔中（3.1.7中制7）。轻轻搅拌培养板混合培养物。
12)对于其余试管重复步骤9-11，将50 µL Matrigel+PancreaCult™类器官生长培养基的细胞悬液加入已经含有950 µL Matrigel+PancreaCult™类器官生长培养基的混合物的新培养孔中。
13)盖好培养板，并将培养板置于5%CO2、37°C培养箱中的定轨摇床上，转速设置为80 rpm。
14)接种后10分钟，显微镜2X镜观察图像(第0天图像)。然后将培养皿小心放回培养箱。
注：一旦培养物被放置在了37°C的定轨摇床上，那么每个培养孔中的Matrigel通常会形成一个半固态的“云”，将碎片封在其中。
15)每隔一天或在所需的时间点拍摄培养孔的照片，以监测类器官的生长，直到它们传代。期间无需更换培养基。
3.2 对使用Dilute Matrigel® Suspension培养的胰腺外分泌类器官进行传代
1)将用于悬浮培养的包被好的12孔板置于2-8°C下至少10分钟。将无菌1000 µL和200 µL枪头置于2-8°C。
2)在冰上解冻Matrigel（约110 µL/孔，用于接种）。
3)制备完整的PancreaCult™类器官生长培养基（见小鼠胰腺类器官Matrigel dome培养3.1节）。置于冰上。
4)使用1000 µL移液枪，粗略估计每个培养孔中培养物的体积，将移液器设置为该体积，并大力上下吹打混匀30次，尽量减少气泡的产生。
注：这会导致胰腺类器官和Matrigel被机械地分解成30-100 µm的较小碎片。用光显微镜检查碎片大小；如果大部分碎片大于100 µm，继续吹打直到它们都变成≤100 µm。
注：扩增的类器官在传代过程中被机械粉碎，所产生的类器官碎片应小于100 µm(图2A)。如果大部分碎片大于100 µm (图2B)，继续粉碎碎片。在计算用于接种的类器官碎片时，只计算小于100 µm的碎片。注意不要计数单个细胞(图2C)。
5)如果传代多个培养孔，将所有培养孔的内容物合并在一个15 mL的离心管中。如果传代单个培养孔，将整个培养孔的体积转移到一个15 mL的离心管中。
6)将类器官按照细胞团块方式接种，请参考PIS步骤中的B.9 - 12。如需 对传代细胞进行单细胞接种，请参考下述步骤2.2.2 - 2.2.8。
7)传代过程中的剩余步骤，请参考上面所述的3.1.6 - 3.1.15节。
注：每日监测胰腺祖细胞类器官。带有200个碎片的类器官通常需要每隔3-6天传代一次；初始传代后，在后续传代中使用1：10到1：30的比例进行分配。
4.0 对胰腺外分泌类器官进行冻存
A.冻存
1)将 Advanced DMEM/F-12和CryoStor CS10置于冰上，放入生物安全柜。
2)使用前标记2.0 mL冻存管，使用前将冻存管置于冰上，放入生物安全柜。
3)若要制备用于冷冻保存的器官碎片，请参阅“小鼠胰腺类器官Matrigel dome培养”步骤中的B.4 - 11。使用“小鼠胰腺类器官Matrigel dome培养”步骤中的 B.11描述的计算方法，计计算冻存800个类细胞器碎片/冻存管所需的类器官碎片悬液总体积。把这个总体积添加到一个含有1 mL Advanced DMEM/F-12的15 mL离心管中。
4)290 × g离心5分钟。尽可能多的吸去上清液而扰动细胞团，留5-10 µL上清液在离心管中(细胞团通常不可见)。将离心管置于冰上。
5)未盖住的2.0 mL冻存管置于冰上。
6)在1 mL预冷的CryoStor CS 10中，轻轻地重新细胞团5-8次。
7)将另外的1 mL预冷的CryoStor CS10添加到每根冻存管中。轻轻上下吹打5-8次，混匀。
8)使用1000µL移液枪，将“1 mL”这种CryoStor/片段悬浮液转移至标记并冷却的2.0 mL的冻存管中，转移前将总体积在离心管中混匀1-2次，以确保碎片均匀分布，然后再进行转移 。
9)立即盖上冻存管盖，并将所有含有碎片的冻存管转移到可控制速率的细胞冻存盒中。将细胞冻存盒置于-80°C的条件下。
10)将细胞冻存盒置于-80℃冰箱24-48小时后，将细胞冻存管转移至液氮（-135℃）中进行长期的储存。
注： 操作迅速，尽量缩短未冻存的类器官与CryoStor CS10的接触时间。
B.复苏
注：用抗粘附冲洗液润洗任何枪头或离心管至关重要，这样操作可以尽量减少类器官碎片在塑料器皿上的黏附。
1)从液氮中取出类器官冻存管，立即将冻存管放入37°C水浴中复苏2.0-2.5分钟。
2)密切观察解冻过程，当冻存液全部变成液体后视为复苏完全。
3)从水浴锅中取出冻存管，然后用70%酒精或异丙醇擦拭进行消毒。
4)使用1 mL血清移液管，将1 mL DMEM/F-12+ 15 mM HEPES+BSA加入冻存管。用移液管上下吹打4次混匀。迅速将冻存管中的类器官转移至预先添加了2 mL DMEM/F-12+ 15 mM HEPES+BSA的15 mL离心管中。
5)用1mLDMEM/F-12+ 15 mM HEPES+BSA清洗冻存管，清洗2次。将清洗后的溶液转移到15 mL离心管中（步骤4）。
6)290 × g离心5分钟。如果表面出现气泡，现将气泡吸走，然后再吸去剩余其它上清液。
7)培养箱中取出第一个24孔培养板，从冰箱中取出200 µL的枪头，放在生物安全柜中。
8)如下所述，操作细胞团。快速操作以确保Matrigel不凝固。
a.使用带有预冷的200 µL枪头的移液枪，在离心管（步骤6）中加入62 µL解冻的Matrigel，上下吹打5-8次，轻轻混匀导管-Matrigel悬浮液，避免产生气泡。
b.将移液枪体积设为30 µL。将30 µL导管-Matrigel悬浮液加入24孔板中心的1个培养孔中形成一个dome，一共加2孔。分配时，逐渐将移液枪向上移动，使导管分布均匀。分配时只加在移液枪的第一次停顿处，避免产生气泡。
注：24孔板中心的8孔最适合dome培养，因为它们的表面是最平的。培养板边缘的培养孔通常有点倾斜，导致dome 会与培养孔的孔壁接触而变平。
9)盖好培养板，将培养板放入37℃和5%CO2的培养箱中孵育10分钟，使dome凝固。
10)从培养箱中取出培养板，放在生物安全柜中。在不扰动dome的情况下，沿着培养孔壁，将750 µL室温(15-25℃)的PancreaCult™类器官生长培养基加入dome培养孔，不要将培养基直接加在dome上。
11)将无菌的PBS添加到任何未使用的培养孔中。盖好培养板。
12)使用明场显微镜2X镜观察图像(第0天图像)。37°C和5%CO2孵育。
注：为了监测类器官的生长，每2-3天拍摄一次相同视野的照片，直到它们传代。
13)在室温(15-25°C)下，每2-3天通过加入750 µL新鲜的PancreaCult™类器官生长培养基进行一次全换液，培养一周以上。
注：如果Matrigel dome松散，则从培养孔中移除250 µL培养基，然后添加500 µL的新鲜培养基。
注：为了避免周末换液，可在周一、周三和周五进行换液。
14)冻存或进行下游实验之前传代2-3次。
3. 小鼠胰腺类器官Matrigel dome培养操作流程
1.0 简介
胰腺是分解淀粉、蛋白质和脂肪，以及平衡体内葡萄糖的消化和内分泌器官。尽管过去几十年，对胰腺癌的研究非常普遍而且重要，胰腺外分泌腺组织的体外长期维持方法近期才被报导1, 2。在该系统中，分离的胰腺导管在添加有适当的生长因子和细胞外基质的培养环境中，形成胰腺外分泌类器官。
类器官是自我组织形成的三维（3D）细胞培养物，包含所代表器官的一些细胞类型和关键特征。由于维持了干细胞和祖细胞的增殖能力，上皮类器官在培养物中维持培养远远优于离体原代细胞的培养。由于它们能在体外进行有效生长并与胰腺上皮细胞直接相关，可以使用胰腺外分泌类器官来补充或替代许多胰腺研究实验方法。与其他常见模型系统相比，类器官可来源于健康和特定疾病组织的细胞。从小鼠原代肿瘤和转移瘤中分离的组织可以构建出肿瘤源性的类器官，为胰腺癌和胰腺导管腺癌的研究提供模型3。这些类器官保留了肿瘤的关键特征，包括基因表型和细胞表型，这为体外实验提供了一个方便的模型系统。
PancreaCult™类器官生长培养基（小鼠）适用于来源于胰腺导管、导管小段、单个细胞或冻存的类器官的胰腺外分泌类器官的生长。胰腺类器官的可以通过长期传代或冷冻保存，为后续实验提供稳定的细胞来源。通常情况下，在原代培养物中，2天内便可观察到类器官，并且在约3-6天后可进行传代。生长在PancreaCult™类器官生长培养基（小鼠）中的胰腺外分泌类器官表达胰腺祖细胞（例如Pdx1，Axin2）和导管细胞（例如Krt19，Muc1）标志物。
PancreaCult™类器官生长培养基（小鼠）支持小鼠胰腺类器官两种方法培养， Matrigel®domes 培养方法，或稀释的Matrigel®悬浮培养方法。
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Matrigel Dome培养 |
稀释的Matrigel悬浮培养 |
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以组织或类器官碎片进行 |
以单细胞进行 |
以组织或类器官碎片进行 |
以单细胞进行 |
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从新鲜的胰腺组织进行原代培养 |
小鼠胰腺类器管Matrigel dome培养“A节” |
小鼠胰腺类器管Matrigel dome培养“2.1节” |
小鼠胰腺类器管稀释的Matrigel悬浮培养“3.1节” |
小鼠胰腺类器管Matrigel dome培养“2.1节” |
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传代已经建立的类器官 |
小鼠胰腺类器管Matrigel dome培养“B节” |
小鼠胰腺类器管Matrigel dome培养“2.1节” |
小鼠胰腺类器管稀释的Matrigel悬浮培养“3.2节” |
小鼠胰腺类器管稀释的Matrigel悬浮培养“3.2节” |
试剂材料
主要试剂
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名称（货号） |
组份 |
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PancreaCult™类器官生长培养试剂盒（#06040） |
PancreaCult™类器官生长基础培养基（#06041） |
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PancreaCult™类器官生长添加物（#06042） |
其它试剂和材料
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货号 |
名称 |
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DMEM/F-12+ 15 mM HEPES |
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DNase I 溶液（1 mg/mL） |
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Y27632 |
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抗黏附缓冲液 |
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IV 型胶原酶, 100 mL |
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Dispase 1U/mL, 100 mL |
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CryoStor CS10冻存液 |
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38045 |
未经组织处理过的100 mm 培养皿 |
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不含Ca2+& Mg2+的D-PBS |
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27250 |
37 µm 可翻转滤网 |
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红细胞裂解液 |
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Corning,#3737 |
未经组织处理过的12孔培养板 |
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Corning 356231* |
Corning Matrigel |
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Corning，#352070 |
50 mL离心管 |
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Corning，#352196 |
15 mL离心管 |
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croning,#3526 |
TC-treated 24孔细胞培养板 |
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croning,#3516 |
TC-treated 6孔细胞培养板 |
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Thermo Fisher,#12634010 |
Advanced DMEM/F-12 |
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ThermoFisher,#12605010 |
TrypLE™酶 |
*推荐使用蛋白含量大于 8 mg/mL的 Matrigel，低蛋白浓度可能影响类器官的生成。
准备试剂和材料
胰腺类器管生长培养基
用无菌技术准备PancreaCult™类器官生长培养基(基础培养基+添加物+抗生素)。下面的例子是准备100 mL完全培养基。如果准备其它体积，进行相应调整。当使用单细胞进行初始培养或传代时，在完全的PancreaCult™类器官生长培养基中添加Y-27632使其终浓度为10 µM。
1) 2-8℃过夜解冻添加物，完全混匀。
注：一旦解冻，应立即使用或分装置于-20℃。不要超过保质期。分装的添加物再解冻后，应立即使用。切勿反复冻融。
2) 将5 mL添加物加入95 mL 基础培养基中。
3) 加入抗生素（例如50 g/mL庆大霉素）。完全混合。使用前升温至室温（15-25°C）。
注：如不立即使用，将PancreaCult™类器官生长培养基可在2-8℃存储，1个月内用完。
组织解离液
1) 用无菌技术准备30 mL组织解离液(足够解离一只小鼠的胰腺)：
- 3.75 mL胶原酶IV
- 3.75 mL Dispase分散酶
- 300 µL DNase I溶液（1 mg/mL）
- 22.2 mL DMEM/F-12+15 Mm HEPES
混合均匀。
注：如不立即使用，可在2-8℃存储，1个月内用完。
2) 使用前，升温至室温（15-25°C）。
润洗离心管和移液管
与胰腺组织接触的离心管和移液管需先润洗，因为胰腺组织经常粘附在上面，显著降低类器官产量。实验当天润洗离心管和移液管。
润洗离心管
对于每个要处理的胰腺，按照下面的方法润洗12支15 mL离心管和3支50 mL离心管。
1) 在15 mL离心管中加入5 mL抗粘附冲洗液，旋涂管子。
2) 将第一支离心管中的冲洗液倒入第二支15 mL离心管。重复以上操作，直到所有15 mL离心管都被冲洗液包被。
3) 从包被的离心管中吸去用过的抗黏附冲洗溶液。
4) 使用Advanced DMEM/F12代替抗黏附冲洗液重复步骤1-2。从已包被好的15 mL离心管中吸去任何残留的Advanced DMEM/F-12。
5) 根据步骤1-4，用30 mL防粘冲洗液和30 mL Advanced DMEM/F-12润洗1支50 mL离心管。
6) 使用之前，盖好管盖，将包被好的离心管储存于室温（15-25°C）。
润洗1支10 mL移液管
a. 在一支50 mL离心管中加入25 mL抗粘附冲洗液，在另一支50 mL离心管中加入25 mL Advanced DMEM/F-12。置于室温（15-25°C）。
b. 使用前，先用用抗粘附冲洗液包被移液管，随后再用Advanced DMEM/F-12包被移液管。
4.0 胰腺类器官的Matrigel dome培养
操作之前阅读整个操作流程。使用无菌技术进行以下操作。
A.建立胰腺类器官
B. 传代胰腺外分泌类器官
A 建立类器官
以下方案用于从一只小鼠的胰腺导管片段来诱导胰腺祖细胞类器官，并以Matrigel dome培养。
建立类器官
1) 将2个24孔组织处理过的培养板置于37℃培养箱中孵育至少1小时。一盒200 µL的枪头置于2-8°C。
2) 冰上解冻450-500 µL Matrigel。
注：冰上解冻和处理MatrIgel防止其成胶。
3) 准备PancreaCult™类器官生长培养基和组织解离液（见3.1节和3.2节）。升温至室温（15-25°C）。
4) 在100 mm培养皿中加入30 mL15 mM HEPES+DMEM/F-12，共2个培养皿，置于冰上。将2支50 mL离心管也置于冰上。
分离胰腺导管
5) 根据批准的操作指南处死小鼠。把小鼠置于冰上直到解剖。
6) 在处死2小时内，分离小鼠胰腺并将其转移到含有预冷的DMEM/F-12的培养皿中（见步骤4）。清洗培养皿中的胰腺。使用镊子将胰腺转移到含有预冷的DMEM/F-12的第二个培养皿中。将胰腺浸没在DMEM/F-12中，然后切成约3 mm的小块。
7) 使用25 mL的移液管，将胰腺碎片和DMEM/F-12一起转移到一支置于冰上的50 mL离心管中(见步骤4)。
8) 在冰上，胰腺碎片依靠自重下沉2分钟。吸去上清液。
9) 然后在离心管中加入5 mL室温（15-25℃）的解离液(见3.2节)。37℃水浴20分钟。
10) 将离心管从水浴锅中取出。用10 mL润洗的移液管，中等力量上下吹打胰腺碎片7次。
11) 使胰腺碎片依靠自重下沉1分钟。
12) 用10 mL的移液管吸去上清液(包含悬浮在上清液中的被消化成的细胞)。
注：消化上清液仅在第一次消化周期内被丢弃。在剩余的消化循环中，保留上清液。
13) 重复步骤9-11(第二个消化循环)。用10 mL的移液管收集上清液，并加入到一支新的预冷的50 mL离心管(见步骤4)中。置于冰上。
14) 重复步骤9-11共4次（第3-6个消化循环），每次消化后，将上清液收集到置于冰上的50 mL的离心管中(步骤13)。
注：每次成功的消化，胰腺导管都会释放在上清液中。来自于消化循环2-6的上清液共大约25 mL。
15) 将70 µm的细胞筛置于50 mL离心管上。用5 mL抗黏附缓冲液以及5 mLAdvanced DMEM/F-12依次润洗细胞筛。
16) 使用润洗的25 mL移液管，将合并的上清液（来自步骤14）通过细胞筛。扔掉滤液。
17) 翻转滤网将其置于一支新的润洗的50 mL离心管上。使用10 mL移液管，小心将依次将12 mL预冷的Advanced DMEM/F-12加入到可翻转滤网，共加2次，将组织碎片和导管冲洗到离心管中。
注：当整个底部表面被彻底冲洗时，确保移液管的尖端接触过滤器的表面。如果碎片仍然留在表面，使用移液管轻轻刮擦，并转移到离心管中。
18) 使用润洗的10 mL移液管，上下吹打胰腺导管(步骤17)3-5次形成均匀的悬浮液。立即在12支15 mL润洗离心管（见制备部分）中转移等体积胰腺导管悬浮液。
19) 290 x g离心12支离心管5分钟。尽可能多地吸去上清液而不扰动沉淀的导管，在每个试管中留下约5-10 µL悬液（细胞团经常看不到）。将离心管置于冰上。
类器官形成
20) 从培养箱中取出第一个24孔培养板，从冰箱中取出200 µL的枪头，放在生物安全柜中。
21) 如下所述，一次处理一支离心管/细胞团。快速操作以确保Matrigel不凝固。
注：24孔板中心的8孔最适合dome培养，因为它们的表面是最平的。培养板边缘的培养孔通常有点倾斜，导致dome 会与培养孔的孔壁接触而变平。
a. 使用带有预冷的200 µL枪头的移液枪，在12支离心管（步骤19）中各加入35 µL解冻的Matrigel。上下吹打5-8次，轻轻混匀导管-Matrigel悬浮液，避免产生气泡。
b. 将移液枪体积设为50 µL。将1支离心管中的所有导管-Matrigel悬浮液加入24孔板中心的1个培养孔中形成一个dome。分配时，逐渐将移液枪向上移动，使导管分布均匀。分配时只加在移液枪的第一次停顿处，避免产生气泡。
22) 重复步骤21进行其它7个细胞团的接种。
23) 从培养箱中取出第二个24孔培养板，对剩下的4支离心管重复步骤21。
24) 盖好培养板，将培养板放入37℃和5%CO2的培养箱中孵育10分钟，使dome凝固。
25) 从培养箱中取出培养板，放在生物安全柜中。在不扰动dome的情况下，沿着培养孔壁，将750 µL室温(15-25℃)的PancreaCult™类器官生长培养基加入dome培养孔，不要将培养基直接加在dome上。
26) 将无菌的PBS添加到任何未使用的培养孔中。盖好培养板。
27) 使用明场显微镜2X镜观察图像(第0天图像)。37°C和5%CO2孵育。
注：为了监测类器官的生长，每2-3天拍摄一次相同视野的照片，直到它们传代。
28) 在室温(15-25°C)下，每2-3天通过加入750 µL新鲜的PancreaCult™类器官生长培养基进行一次全换液，培养一周以上。
注：如果Matrigel dome松散，则从培养孔中移除250 µL培养基，然后添加500 µL的新鲜培养基。
注：为了避免周末换液，可在周一、周三和周五进行换液。
29) 每天监视类器官。在内腔变黑和塌陷之前，应该进行传代。这通常发生在第3-6天。
注：加入没有出现类器官或者仅有又小又少的类器官出现，进行4.1.2节1-9。290 x g离心12支离心管5分钟。尽可能多地吸去上清液而不扰动沉淀的导管，在每个试管中留下约5-10 µL悬液（细胞团经常看不到）。将离心管置于冰上。进行4.1.1节20-28。
B. 胰腺外分泌类器官传代
以下流程用于通过碎片编号传代胰腺外分泌类器官以Matrigel dome方法培养。单细胞传代见4.2节，稀释的Matrigel悬浮培养见“小鼠胰腺类器官稀释的Matrigel悬浮培养”。
1) 24孔板置于37℃培养箱中至少1小时。200 µL无菌枪头置于2-8℃。
2) 冰上解冻Matrigel（传代1孔需要40 µL）。并将Advanced DMEM/F-12也置于冰上。
3) 准备PancreaCult™类器官生长培养基，并将其升温至室温（15-25°C）。
4) 检查要传代的Matrigel dome是否完整。如果dome完好，则进行步骤5。如果dome松散，加入预冷的Advanced DMEM/F-12，使每孔总体积增加至1 mL至少保持1分钟然后进行步骤7。
5) 在不接触dome的情况下，将每个培养孔中的培养基吸去并进行传代。
6) 使用1 mL移液枪，用力向每个dome中心添加1 mL预冷的Advanced DMEM/F-12，并静置1分钟。
7) 用 1 mL移液枪，用力上下吹打15次，避免产生气泡。
注：这种机械操作将导致类器官+Matrigel形成30-100 µm大小的碎片，显微镜下观察；如果大多数碎片大于100 µm，继续操作，直到直径都≤100 µm。
8) 如果传代多孔，将所有培养孔中的培养物混合在一支15 mL的离心管中。如果传代一孔，将该孔中的培养物加入15 mL离心管。
9) 将类器官碎片通过一个70 µm细胞筛，收集滤液。弃掉细胞筛。
10) 以中等速度轻轻涡旋含有器官碎片的离心管5秒。立即将3 个 10 µL碎片悬浮液转移到6孔板的培养孔中，形成3个单独的培养孔。将剩余的碎片悬浮液置于冰上。
11) 按以下方法，确定悬浮液中类器官碎片的平均数量：
a. 显微镜下计数每10 μL悬滴中的胰腺类器官碎片数量，并测定10 µL的平均数。仅计数30-100 µm大小的碎片。
注：如果碎片的密度太高而难以计数，则用Advanced DMEM/F-12稀释悬液。重复步骤9。
b. 计算传代200个碎片/孔所需的体积。对于每个新接种的Matrigel dome，将此体积添加到含有1 mL Advanced DMEM/F-12的15 mL离心管中。 例如：
- 3 x 10 µL碎片计数=35, 40, 42碎片
- 每10 µL悬液中的碎片大约39个。
- 接种200个碎片，就需要51 µL悬液。
12) 290 x g离心含有200个碎片(见步骤11b)的离心管5分钟。尽可能多的吸去上清液，而不扰动细胞团。在离心管内留下5-10 µL上清液。把离心管置于冰上。
13) 对于传代的后续步骤，请参阅4.1.1节步骤20-28。
注：每日监测胰腺祖细胞类器官。接种200个碎片的类器官通常需要每3-6天传代一次；在初始传代后，使用1：10到1：30的分配比例。
图1 以Matrigel Domes方式在 PancreaCult™类器官生长培养基中培养胰腺类器官
（A）大多数胰腺类器官直径仍小于100 μm，显示出清晰的管腔，此时尚不宜传代。（B）大多数类器官直径大于100 μm，其中一些类器官的管腔变暗。此时的培养物已经可以进行传代。（C）类器官已经超过最佳传代时间，大部分类器官的官腔变暗，许多类器官已经塌陷。