组织巨噬细胞源自于单核细胞。从血液中分离细胞并在含血清的培养基中培养，贴壁的单核细胞就会分化为巨噬细胞。在巨噬细胞培养中，我们建议您加入 M-CSF 。加入 IL-4、IL-10 或 TGF-β 等其他细胞因子有助于提高细胞存活。以下方案适用于 T25 或 T75 烧瓶，但可等比例缩小到 100 mm 培养皿或培养板。

巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，也称为CSF-1，是一种四-α-螺旋束细胞因子，是巨噬细胞存活、增殖和分化的主要调节因子。M-CSF是单通膜蛋白，通过二硫键连接的同型二聚体或异二聚体。M-CSF对破骨细胞祖细胞的存活和增殖也是必需的。M-CSF还可以促进和增强巨噬细胞对肿瘤细胞和微生物的杀伤，诱导巨噬细胞释放细胞因子和其他炎症调节因子，并刺激细胞吞噬作用。

材料

• 带透气盖的 T25 或 T75 无菌烧瓶（#156367）
• RPMI 1640 培养基（#609043）
• 胎牛血清（#FBS141）
• L-谷氨酰胺（#201054）
• 可选：青霉素-链霉素（#213010）
• M-CSF 纯化蛋白（#300-25）
• 可选：IL-4 纯化蛋白（#200-04）
• 磷酸盐缓冲液（#201054）
• EDTA（例如 UltraPure 0.5M EDTA，pH 8.0，货号：15575020）
• 50 mL 锥形管（#339652）
• 流式染色缓冲液（#222026）

步骤

1. 在无菌条件，从全血中分离 PBMC（见流式样本制备）。
2. RPMI 1640 完全培养基的配制：加入胎牛血清（最终浓度达 10%）和 2 mM 左旋谷氨酰胺到 RPMI 1640 培养基 。使培养基的温度达到 37°C。可选：添加 1% 的青霉素-链霉素（5000 单位/mL）。
3. 重悬细胞于 RPMI 1640 完全培养基中，使细胞浓度达 2 x 10⁶ 个细胞/mL。
4. 将细胞溶液转移到细胞培养皿中。
5. 在37°C 、 5% CO₂ 的培养箱中培养 24 小时，使单核细胞贴壁。
6. 在无菌锥形管中，制备含40-50 ng/mL M-CSF 的RPMI 1640 完全培养基。可选：加入 20 ng/mL 的 IL-4。
7. 用含 M-CSF 和 IL-4（如添加）的培养基替换培养皿中的培养基。
8. 在 37°C 、 5% CO₂ 的培养箱中培养细胞 6 天。在这 6 天内，每隔 3–4 天，补充 含40–50 ng/mL M-CSF 的 RPMI 1640 完全培养基（可选：加入 20 ng/mL 的 IL-4 ）。用显微镜检查细胞健康和生长密度。
9. 当细胞质中出现很多颗粒，且细胞略有伸长时，就可以收集细胞。此外，大量的细胞应贴附于培养板上。当收集细胞时，丢弃旧培养基，用 1X PBS 冲洗培养皿两次，每次冲洗后都丢弃 PBS。
10. 向每个培养皿加入 10 mL 10 mM EDTA，在室温静置 10 分钟或直到细胞不再贴附于培养皿。
11. 将细胞收集在 50 mL 锥形管中，在室温下 300–400 x g 离心 4-5 分钟。
12. 丢弃上清液，并用 1X PBS 冲洗细胞。
13. 300–400 x g 离心 4-5 分钟。
14. 丢弃上清液，用流式染色缓冲液或培养基重悬细胞。

细胞刺激剂佛波醇 12-十四酸酯 13-乙酸酯（PMA）、离子霉素、布雷菲德菌素 A 和莫能菌素可促进转录因子活化，以实现细胞内信号传递，并使多种不同免疫细胞产生细胞因子。需要使用布雷菲德菌素 A 溶液来确保细胞内保留信号蛋白和细胞因子。布雷菲德菌素 A 是一种细胞内蛋白转运抑制剂。使用布雷菲德菌素 A 对正在培养的细胞进行培养，会阻碍向高尔基复合体（GC）的蛋白转运，并导致内质网（ER）中的蛋白积聚。在细胞体外活化的最后几小时中加入布雷菲德菌素 A，会增强细胞内细胞因子的检测。如果对分泌蛋白进行免疫检测（例如 ELISA、蛋白免疫印迹或多重蛋白检测），则无需使用布雷菲德菌素 A 对细胞进行处理。

材料

 

• 带通气盖的 T25 或 T75 无菌烧瓶（#156367）
• RPMI 1640 培养基（#609043）
• 胎牛血清（#FBS141）
• 细胞刺激混合试剂：佛波醇 12-十四酸酯 13-乙酸酯（PMA）、离子霉素、布雷菲德菌素 A 和莫能菌素（#00-4975-93 或 00-4970-93）
• 布雷菲德菌素 A 溶液（#00-4506-51）
• 细胞刮刀（#179693）

 

细胞因子产生实验步骤

 

1. 在无菌条件下使用无菌技术，从全血（流式样本制备）或制备的淋巴组织（流式样本制备）中分离 PBMC。
2. 在制备 RPMI 1640 完全培养基时，用胎牛血清（最终浓度达 10%）补充 RPMI 1640 培养基。使培养基的温度达到 37°C。
3. 进行重悬，使 RPMI 1640 完全培养基中的细胞浓度达 3 x 10⁶ 个细胞/mL。根据将使用的烧瓶（T25 或 T75）尺寸，制备所需体积。
4. 准备两个培养瓶：一个贴有“已刺激”（已活化）标签，另一个贴有“未刺激”（未活化）标签。
5. 将细胞溶液（在步骤 3 中制备）均匀分至两个准备好的烧瓶中。
6. 向已刺激（已活化）烧瓶中加入浓度为 1X 2 µL/mL 的细胞刺激混合物。
7. 向已刺激烧瓶和未刺激烧瓶中各加入浓度为 1X 3 µL/mL 的布雷菲德菌素 A 溶液。
8. 用通气过滤盖盖住两个烧瓶，并在 37°C 下，在 5% CO₂ 培养箱中培养 5 小时。
9. 用细胞刮刀收集细胞。
10. 方案提示：在流式细胞术应用中，使用现成 固定缓冲液有助于改善细胞因子和转录因子检测。

 

T细胞体外扩增需要通过αβ-T细胞受体（TCR复合物）激活T细胞。使用功能级的单克隆抗CD3 抗体和抗 CD28 抗体刺激 T 细胞，产生共刺激信号，可与TCR共同促进抗原诱导的活化。下文所提供的T细胞活化实验方法（包括添加生长因子或不添加生长因子的方法），采用功能性抗体对T细胞进行活化，是一种更加经济的T 细胞扩增方法。此外，用于 T 细胞扩增和活化的 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 也可用于活化和扩增人 T 细胞。PMA 或伴刀豆球蛋白 A 能在短时间内促进细胞表达转录因子和细胞因子，然后进行用于流式细胞术分析和免疫检测。

材料

 

• HapCult™HumanT cell Expansion Medium/ HapCult™人T细胞扩增培养基（#661350）
• FlowCyto™Mouse anti-human CD3， Functional Grade/FlowCyto™人CD3功能抗体（#AH1003110）
• FlowCyto™Mouse anti-human CD28，Functional Grade/FlowCyto™人CD28功能抗体（#AH1028110）
• Human IL-2 Recombinant Protein/重组人IL-2( #200-02-10)
• HapCult™PBS(#201054)
• 经无菌细胞培养处理的 6 孔板（#140675）
• 15 mL离心管（#339650）

 

抗体包被微孔板

 

1. 用无菌 PBS 稀释 Anti-human CD3 功能抗体 (PBM#AH1003110)包被抗体，浓度为 5~10 µg/mL。
2. 向 96 孔板中加入抗体包被，每孔 50 μL。对照孔加 50 μL 无菌 PBS。
3. 盖上微孔板盖，放置于 37℃恒温培养箱，孵育 2 小时或放置 4℃过夜包被。
4. 在接种细胞之前，吸出微孔板中的液体，然后加入 200 μL 无菌 PBS 洗涤微孔 2 次（注意不要刮划包被的微孔板底部），同时防止微孔干燥。

 

扩增培养 T 细胞

 

1. 制备人 PBMC 或 T 单细胞悬液。
2. 进行细胞计数，300×g 离心 10 分钟洗涤细胞。
3. 去除上清后用 T 细胞扩增培养基重悬细胞，加入适量的培养基调整细胞浓度至 10⁶/mL。
4. 向细胞悬液中加入 hIL-2(Peprotech #200-02-10)至终浓度 50 ng/mL，Anti-human CD28 功能抗体(PBM#AH1028110)至终浓度 2 µg/mL 进行共刺激。
5. 接种细胞到包被好的微孔板中，每孔接种细胞悬液 200 μL，37℃, 5% CO₂孵育培养。
6. 培养 2~4 天。可收集细胞或每两天进行一次半量换液继续培养。
注：6-8 天，T 细胞处理静止期，可再次刺激继续培养扩增。