文章目录
组织切片
组织切片
1.组织切片试剂盒选择指南
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名称 |
货号 |
规格 |
价格 |
应用或组份 |
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切片样本处理 |
Cryosection preparation kit (1) |
研究应用 |
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Cryosection preparation kit (2) |
组织活检 |
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Paraffin section preparation kit |
研究和组织活检 |
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包埋剂 |
SCEM（Super Cryoembedding Medium） |
C-EM001 |
260mL |
630 |
硬组织（骨或者硬质样品） |
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SCEM-L1 |
C-EM002 |
260mL |
630 |
硬组织或软组织（脂肪组织、眼球、脑等） |
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粘附膜 |
Cryofilm type 2C(9) |
C-FP092 |
1.5 cm in width |
1260 |
研究或组织活检 |
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C-FP093 |
2.0 cm in width |
1260 |
研究或组织活检 |
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C-FP094 |
2.5 cm in width |
1260 |
研究或组织活检 |
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C-FP095 |
3.5 cm in width |
1260 |
研究或组织活检 |
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C-FP096 |
4.5 cm in width |
1260 |
研究或组织活检 |
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Cryofilm type 2C(10) |
C-FS102 |
1.5 cm in width |
1260 |
研究应用 |
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C-FS103 |
2.0 cm in width |
1260 |
研究应用 |
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C-FS104 |
2.5 cm in width |
1260 |
研究应用 |
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C-FS105 |
3.5 cm in width |
1260 |
研究应用 |
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C-FS106 |
4.5 cm in width |
1260 |
研究应用 |
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Cryofilm type 3C(16UF) |
C-FUF302 |
1.5 cm in width |
1440 |
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C-FUF303 |
2.0 cm in width |
1440 |
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C-FUF304 |
2.5 cm in width |
1440 |
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C-FUF305 |
3.5 cm in width |
1440 |
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C-FUF306 |
4.5 cm in width |
1440 |
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Transfer film |
C-FT003 |
20mm in width |
1260 |
用于组织切片转移 |
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C-FT004 |
25mm in width |
1260 |
用于组织切片转移 |
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C-FT005 |
35mm in width |
1260 |
用于组织切片转移 |
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C-FT006 |
45mm in width |
1260 |
用于组织切片转移 |
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LMD(激光显微切割) film |
用于LMD (Laser microdisection technique) |
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Paraffin transfer film (fine) |
用于准备Paraffin 切片 |
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Paraffin transfer film (rapid) |
用于准备Paraffin 切片 |
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刀片架 |
Disposable blade holder |
用于SL系列刀片 |
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刀片 |
SL series° Tungsten carbide blade Size: 8.0 cm in length |
SL-25° （Cutting angle: 25°） |
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SL-30° （Cutting angle: 30°） |
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SL-35° （Cutting angle: 35°） |
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SL-40° （Cutting angle: 40°） |
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封片剂 |
SCMM-G1 |
C-MM001 |
260mL |
450 |
H.E染色 |
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SCMM-R1 |
C-MM002 |
30mL |
270 |
免疫组化、酶-组织化学等 |
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SCMM-R2 |
C-MM003 |
30mL |
540 |
H.E染色、免疫组织化学荧光等 |
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SCMM-R3 |
C-MM004 |
30mL |
540 |
甲苯胺蓝染色Toluidine blue staining |
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UV Polymerizer |
UV Quick Cryosection Mounter |
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for polymerizing the SCMM-R2 & R3 |
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染液 |
Eosin |
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Hematoxilin |
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其它产品 |
Quick section washer |
切片水洗 |
2.硬组织切片处理流程
Kawamoto膜技术的是由Tadafumi Kawamoto博士于1981年创建，用于从硬组织和大型标本中生成非常薄的完整切片以便观察。
技术优势：
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1）制备硬组织和大样本组织薄切片（2μm）。 2）几乎完全保留所有组织成分。 3）组织切片无变形。 4）可用于组织学、组织化学和免疫组织化学等多种研究。 5）无需固定和脱钙即可进行免疫染色。 |
6）切片可用SCMM-R2或R3永久保存。 7）迅速：所有步骤（包埋，切片，染色，封片）在20分钟内完成。 8）用LMD薄膜制备的切片应用于LMD技术。 9）无需特殊的技术和训练。 10）适用于多种物种：如实验动物、鱼类、昆虫和植物等。 |
实验流程：
1）冰冻-包埋
2）冰冻-切片
3）染色-封片
3.脑类器官的冷冻切片和荧光染色
脑类器官为中枢神经系统的研究提供了一种模拟人体生理环境的模型。这类三维（3D）体外培养的类器官能够帮助研究正常和疾病状态下人脑的发育过程，在诸如自闭症，精神分裂症或因病毒感染导致的脑缺陷研究中具有重要的应用。
使用人多能干细胞（hPSCs）建立脑类器官的主要优势在于重现发育中人脑的3D结构。脑类器官中的中枢神经组织形成分层结构和伪脑室，与在生物体内观察到的大脑结构相似。为了分析研究这种特殊的细胞结构，需要专业的组织学方法。
在处理具有复杂结构的大型三维组织（如脑类器官）时，有着许多技术上的技巧。除了实验上的小心操作，这些类器官还需要足够的透膜（penetration），固定（fixation），抗冻保护（cryoprotection）来保持其组织形态。这些实验流程可能会影响蛋白表面的抗原结构，使得抗体无法识别抗原表位，继而影响实验结果。
实验过程
培养脑类器官
本操作流程使用STEMdiffTM脑类器官试剂盒（产品号 #08570）培养脑类器官。
固定
1. 使用1 mL（p1000）移液枪头，将类器官转移到50 mL离心管中。
注：可以剪掉枪头尖，以免损伤类器官。
2. 吸出培养基。D-PBS清洗三次，每次10分钟。移除D-PBS。
3. 加入4% PFA溶液。在2-8℃过夜孵育(16小时)。
注：为了正确以及彻底地固定样本。我们推荐使用新鲜配制的4% PFA溶液。
4. 吸出PFA。PBS-T清洗类器官三次，每次10分钟。
5. 将类器官保存在2-8℃ PBS-T中（最长可保存一周）。
抗冻保护（Cryoprotection）
将类器官孵育在30%蔗糖溶液中，防止在冻存不善带来的冰晶破坏蛋白结构所形成的伪影。
6. 吸出PBS-T，加入5 mL 30%蔗糖溶液。
7. 2 - 8℃孵育过夜。
注：类器官的孵育时间可以根据样本的大小和密度做出调整。当类器官不再浮于溶液中，则可以停止孵育并进行下一步实验。
包埋（Embedding）
8. 水浴中将明胶溶液温热至37℃。
9. 移除离心管中的蔗糖溶液，加入明胶溶液至完全浸没类器官。
10. 37℃孵育1个小时。使明胶可以渗透 Corning® Matrigel® droplet并完全覆盖类器官。
11. 取出类器官，转移到包埋模具中。
注：明胶在室温下会开始聚合并硬化；必须快速将类器官转移到包埋模具中。
速冻（Snap freezing）
速冻有助于防止类器官中冰晶的形成，并有助于维持样本的天然细胞结构。
12. 将干冰加入100%乙醇中制备干冰/乙醇浆液。
13. 混合液停止沸腾后，加入包埋的样本。
14. 将样本置于冷冻浆液中直至完全冷冻，然后将样本转移至-80℃冰箱长期保存。
冷冻切片
15. 从-80℃冰箱中取出冻块，在低温恒温箱中加热30分钟至切片所需温度。
注：明胶包埋类器官的最佳切片温度为-26℃至-30℃。
16. 切片厚度可以根据后期选择的成像系统（imaging system）调整。常用的厚度为10-20 μm。
注：多个连续切片能在不同区域观察不同的标志物。
17. 从冰箱中取出切片载玻片，并使其在室温下干燥。
18. 用PAP笔勾勒出切片轮廓。笔蜡完全干燥后，进行下一步。
19. 如有必要，可进行抗原恢复，或直接进行步骤20。
（可选）抗原修复
PFA固定所形成的共价交联（Cross-linkages）可能会干扰或占据抗原表位 (reviewed by Shi et al. 1997)4。因此，在一抗结合前，有些样本需要额外的抗原修复。
封闭
20. PBS-T清洗载玻片10分钟，清除明胶。
21. 将载玻片平放，并滴上足够的封闭缓冲液。笔蜡的轮廓会将封闭缓冲液保持在组织切片上。
22. 室温下于加湿箱中孵育1小时。
一抗
23. 制备一抗稀释液。推荐的稀释比例参照表2。
24. 倒掉封闭缓冲液，替换为一抗稀释液。
25. 室温下于加湿箱中过夜孵育（16小时）。
二抗
26. 在PBS-T中准备二抗稀释液。推荐的稀释比例参照表3。
注：Alexa Fluor®抗体非常稳定，但也应注意不要将抗体长时间暴露在直射光下。
27. 倒掉一抗稀释液，将载玻片放入切片盒中，PBS-T清洗载玻片三次。
28. 将载玻片平放，并滴上足够的二抗稀释液，室温下于加湿箱中孵育2小时。
盖玻片
30. 倒掉二抗稀释液，将载玻片放入切片盒中。
31. PBS清洗载玻片三次，每次30分钟。
32. 晾干5分钟。
33. 在载玻片上滴上PermaFluorTM，盖上盖玻片。在镜下观察前保存在2-8℃中。
预期结果
下图是使用上述操作流程处理的第40天脑类器官切片的荧光图像，切片厚度为16 μm，放大倍数为20倍。
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图1. 对类器官组织进行免疫荧光染色，CTIP2（绿色），PAX6（品红色），III类β-微管蛋白/ TUJ1（蓝色）和DAPI（灰色）。 伪脑室（pseudo-ventricle，虚线部分）周围放射状分布PAX6+神经祖细胞，此为皮层区，这些神经祖细胞可进一步分化为皮 质板神经元（表达CTIP2和TUJ1）。比例尺= 500 μm。 |
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图2. 对类器官组织进行免疫荧光染色，TBR2（中间前体，绿色）和磷酸化vimentin（PVIM，分裂中的细胞，品红色）。 细胞在伪脑室（pseudo-ventricle，虚线部分）周围的皮质区边界处活跃分裂，一部分分裂细胞表达TBR2，并向祖细胞区 向中央（箭头）迁移以形成中间祖细胞（intermediate progenitors）。比例尺= 100 μm。 |
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图3. 对类器官组织进行免疫荧光染色，CTIP2（绿色），TBR1（5/6 皮层神经元，品红色）和DAPI（白色）。假定祖细 胞区域（presumptive progenitor zones）（白色）内部中心处的细胞以及类器官外表面的细胞表达深层神经元标志物 （CTIP2和TBR1）。比例尺= 100 μm。 |
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图4. 对类器官组织进行免疫荧光染色，FOXG1（前脑细胞，绿色）或SOX2（神经祖细胞，品红色）。由STEMdiffTM脑 类器官试剂盒所培养脑类器官能够生成前脑型组织（forebrain-type tissue，表达FOXG1）。SOX2+神经祖细胞在假性脑 室区域（虚线）周围呈放射状排列。比例尺= 100 μm。 |
讨论
中枢神经系统结构复杂，需要灵敏的组织学技术，才能在显微镜观察下真实重现这种结构。本操作流程帮助使用者在对组织结构损坏最小的情况下，对三维培养的类器官进行冰冻切片。三维脑类器官切片在显微镜下的照片可以呈现出在二维（2D）图像下无法观察到的表型结构。例如，使用常规二维培养无法观察皮质分层中的缺陷。
从干细胞分化培养神经类器官的技术已成为科学家研究人类神经组织及其结构的重要手段，这些技术使科学家能够对神经系统功能性的研究提出新的问题和假设。皮质分层缺陷与精神疾病如精神分裂症有关。另外，在Rett Syndrome的小鼠模型中，V层神经元中的树突棘密度受到很大影响。从患者处取得的细胞样本，衍生为相应的类器官并对其进行研究的手段，可以更快更有效地为患者设计治疗方案，应用于临床研究。
另外，如果要观察组织样本特别是类器官内部3D构建和基因表达的时空分布和相互调节关系，还可以借助组织透明技术和荧光染色技术，保证给予您意向不要的3D分布图，无需担心组织切片的三维重构而丢失关键信息。