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肾脏类器官研究
肾脏类器官研究
1. 肾脏类器官
肾脏是中断中胚层(intermediate mesoderm，IM)通 过 I M来源的后肾间质 ( metanephrim mesenchyme，MM)和成形的输尿管芽(ureteric bud，UB)相互作用分化而成。MM来源的肾祖细胞是肾单位的前体，而IM自身则源于后部原条(posterior primitive streak)1。将经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞上培养的人hESCs铺板于包被有Matrigel的96孔培养板中，待过夜培养后加入含Activin A和BMP-4，或只含CHIR 99021的无血清培养基，然后培养在含有FGF-9和肝素的培养基中诱导IM细胞的形成。这些细胞随后在含有FGF-9，BMP-7和维甲酸(前面用Activin A/BMP-4诱导的细胞)或者含有FGF-9和肝素(前面只用CHIR 99021诱导的细胞)的培养基中培养。诱导肾脏类器官时，将人hESCs来源的肾脏细胞分离成单个细胞，离心形成细胞沉淀，然后铺于覆有IV型胶原蛋白的滤膜上，并使滤膜悬浮在培养基中。该研究在化学成分明确的培养条件下，利用参与正常胚胎发育的生长因子，成功地使hESC分化生成UB和MM，并最终在体外自组形成含有肾单位的3D结构2。
人肾脏培养基
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培养基
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图片 |
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STEMdiff™肾脏类器官试剂盒（货号#05160） 设计用于21天从hPSCs生成肾小管类器官，可模拟发育中的肾单位和相关上皮发生。配方基于下述文章研发： Freedman et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications volume 6, Article number: 8715 (2015). 这些hPSC衍生的肾脏类器官具有发育中肾单位的结构和细胞分群。 |
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肾脏类器官其它培养方法
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Kidney肾 |
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细胞来源 |
相关细胞因子 |
相关培养基 |
文献 |
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PSC |
Advanced RPMI1640 |
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PSC |
Advacned RPMI1640 |
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PSC |
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Fetal tissue-derived cells |
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参考文献
1. Stoker AW, Streuli CH, Martins-Green M et al. Designer microenvironments for the analysis of cell and tissue function.
Curr Opin Cell Biol 1990; 2: 864–874.
2. Lancaster MA, and Knoblich JA, Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science, 2014 345:1247125.
2. 如何将人多能干细胞高效率、高通量分化为肾脏类器官
慢性肾脏疾病(CKD)是一个重要的全球健康问题，这与我们的医疗系统的高经济成本有关。 CKD是肾单位不可逆损害导致肾功能逐渐丧失，该疾病影响到全世界约10%的成年人口。 将人胚胎干(ES)和诱导多能干(iPS)细胞分化为功能性肾组织的能力为开发减缓肾脏疾病进展的新治疗方法提供了新的工具。 此外，肾脏类器官的发现，是自组织形成的三维结构，包含类似于体内对应的某些功能的肾细胞类型，克服了在普通单层培养系统中细胞相互作用，导致建模不足的局限性。 肾脏类器官为模拟患者特异性肾脏疾病、研究肾脏发育和进行肾毒性复合药物筛查提供了新的机会。
近年来，几个研究小组建立了肾脏类器官直接分化流程，通过诱导人多能干细胞(hPSCs)，分化成晚期原始条纹、中间中胚层和后肾中胚层，从而产生管状前聚集体，然后形成肾脏类器官（图1）。 然而，许多方案要求分化培养物被解离成单细胞悬液，并在分化过程中重新聚集，这可能导致效率下降，肾脏类器官样产量降低，以及更高的实验变异性。 为了标准化肾脏类器官的生成，我们开发了STEMdiff™肾脏类器官生成试剂盒。该试剂盒成分明确，不含血清，可以使hPSCs高效、可重复地分化为肾脏类器官类，用来模拟由足细胞、近端和远端小管及其相关内皮组成的肾单元发育。 此外，我们最小化了细胞培养操作，实现了一个简单的两步分化系统，这与在96孔和384孔培养中进行表型高通量筛选相兼容。
图1. 在哺乳动物中，肾单位发育原理图
(A)在哺乳动物中，肾单位是由中胚层细胞依次分化成后中间中胚层、肾后中胚层、前管状聚集体(PTA)和肾小泡(RV)，肾小泡进一步分化为足细胞(P)、近端小管(PT)、肾环(LoH)和远端小管(DT)的谱系顺序产生的。 中间中胚层也产生其他肾细胞类型，即肾间质、血管祖细胞和输尿管芽(UB)。 后者形成收集管(CD)。每个发展阶段的典型标记在圆圈中突出显示。 (B)肾上腺素凝结在输尿管芽尖端周围，形成(C)囊前集合体，其次是肾小泡，其解剖阶段为(D)逗号状体，(E)S形体，发育为(F)功能性肾单位。
肾脏类器官建立操作流程
1.第 -3天：在Matrigel包被的96孔板中，接种人ES和iPS细胞系，用mTeSR™1培养。
2.第 -2 天：用另外的一层Matrigel覆盖贴壁细胞，在接下来的48小时hPSC形成空化的PSC球体，并在每天进行全换液。
3.第 0-1.5 天：将mTeSR™1培养基更换为STEMdiff™肾脏类器官第1阶段分化培养基，空化的PSC球体开始分化。
4.第 1.5-18 天：将STEMdiff™肾脏类器官第1阶段分化培养基更换为STEMdiff™肾脏类器官第2阶段分化培养基，每2-3天进行全换液，共培养18天。在这18天的分化过程中，hPSC细胞通过晚期原始条纹、后中间中胚层和肾后中胚层的阶段，产生由内皮细胞、足细胞和近端和远端小管组成的肾脏类器官。
图2.STEMdiff™肾类器官生成试剂盒分化过程中形态学变化及两步方案原理图
实验结果
图3. 使用Corning Matrigel覆盖单细胞接种的hPSCs有效地产生未分化的、空化的PSC球体
(A)(i)在单细胞悬液接种24小时后，(ii)用Corning Matrigel 覆盖细胞，在mTeSR1中维持2天,和(iii)利用(B)明场显微镜(标尺450µm)和(C)免疫细胞化学分析未分化细胞的OCT4和SOX2的共表达情况。 在多个人ES细胞系(H9，H1)和iPS细胞系(WLS-1C，STIPS-M001)上观察到空化PSC球体的有效和健壮形成，它们均匀地表达未分化干细胞的标记OCT4和SOX2(标尺50µm)。（D）用抗OCT4和SOX2抗体同时染色生物学对照，用细胞免疫荧光进行分析。 在Corning Matrigel上维持，没有覆盖另外一层Matrigel的情况下的H9 ES细胞，同时保留了OCT4和SOX2（顶部图像）的高表达。 H9 ES细胞系在STEMdiff肠类器官生成试剂盒后形成的中/后肠培养物作为阴性对照，该培养物OCT4和SOX2的表达均完全缺失(底部图像，标尺50 µm)。
图4. 人多能干细胞向自组织肾类器官的有效分化
(A)由WLS-1C iPS细胞系或H9 ES细胞系衍生的第18天肾类器官的明场显微镜图片(标尺200 µm)。 (B)分化第15天不同ES细胞系(H9，H1)和iPS细胞系(WLS-1C，STIPS-M001)来源的肾类器的较低放大倍率图片(标尺450µm)。 (C)在第18天，使用STEMdiff肾类器官生成试剂盒或Freed man等人发表的自制培养基对多个ES细胞系(H9，H1)和iPS细胞系(WLS-1C，STIPS-M001)在96孔培养板中平均每孔(0.32cm2生长面积)形成的肾类器官进行量化。 (平均±SD，n>2，如图所示)。 所有四种细胞系均能高效分化为自组织的肾类器官，形成管状结构。
图5.hPSC衍生的肾类器官表达关键肾标记物
(A)免疫荧光标记肾类器官与简化的肾单位组成的示意图比较。分析第18天形成的类器官，产生自组织的肾脏类器官，形成卷曲的管状结构，具有典型的肾单位样分割，并表达足细胞(podocalyxin或PODXL)、近端(lotus tetragonolobus lectin或LTL)和远端小管(E-cadherin或ECAD)标记。 (B)分化18天的H9 ES和STIPS-M001i PS细胞，免疫荧光分析表达足细胞、近端和远端小管特异性标记物PODXL、LTL、ECAD、(C)内皮标记物CD31（血小板内皮细胞粘附分子）、Metanephricmesenchyme/足细胞标记物WT1(Wilms肿瘤蛋白1)和(D)基质标记物ME IS1/2/3(Meis homeobox 1/2/3) 和VIM（波形蛋白）。
图6. STEMdiff™肾脏类器官生成试剂盒可高效筛选表型肾毒性化合物
(A)H9 ES、H1 ES和WLS-1C iPS细胞分化18天形成的肾脏类器官，用PODXL、LTL、ECAD、DAPI或(B)CD31、LTL、DAPI进行荧光标记。 (C-F)公布了Czerniecki等人的数据。 描述了一个重要的应用，使用STEMdiff™肾脏类器官生成试剂盒，基于微孔板形成类器官的技术。 (C)cis-diammineplatinum (II) dichloride (cisplatin) 处理后对肾脏类器官特异性细胞毒性的评估，明场显微镜观察到，该处理会对肾小管造成损害(D)使用定量的、基于发光的活力测定，该药以剂量依赖性的方式降低细胞存活率。cisplatin处理后， (E)免疫荧光或（F）ELISA分析(所有标尺100µm)人PSC衍生的肾脏类器官，该类器官表达肾脏损伤分子-1(KIM-1)，这是一种在受损小管中表达的特异性生物标志物。
相关文献
1. Stefan M. Czerniecki, et al. High-Throughput Screening Enhances Kidney Organoid Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells and Enables Automated Multidimensional Phenotyping.Cell Stem Cell, 2018, 22, 929–940
2. Benjamin S. Freedman，et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutantkidney organoids derived from human pluripotentepiblast spheroids.Nature communaciation. 2015; 6: 8715
3. Chu KH,et al. Acute renal impairment in coronavirus-associated severe acute respiratory syndrome.Kidney Int. 2005 Feb;67(2):698-705.
4. Hao Xu,et al.High expression of ACE2 receptor of 2019-nCoV on the epithelial cells of oral mucosa. Int J Oral Sci. 2020; 12: 8.
5. Wenhui Li,et al. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus.Nature,2003, 426,450–454.
3. 肾脏类器官生成流程图
肾脏类器官是自体组织的三维结构，包含类似于体内对应物功能的肾细胞。 通过诱导人胚胎干(ES)或诱导多能干(iPS)细胞逐步通过晚期原始条纹、中间中胚层和后肾中胚层，再形成前管状聚集体，然后形成肾脏类器管的肾囊泡，最终形成类器官1-3。由于肾脏类器官重现肾发育过程中肾元的细胞成分和结构，因此能够克服单层培养系统的局限性，包括细胞间相互作用导致的建模不足。肾脏类器官为模拟病人的特定肾脏疾病，研究肾脏发育和进行肾毒性化合物筛选提供了新的机会。
STEMdiff™肾脏类器官生成试剂盒1基于Freed man等人发表的流程开发了，并进行了近一步优化，使人多能干细胞(hPSCs)在由足细胞、近端和远端小管以及相关的内皮和间充质组成的肾脏类器官分化过程实现标准化。这些肾脏类器官特别适合使用96孔板或384孔板进行高通量筛选试验。
hPSC分化为肾脏类器官的实验流程，说明了分化的关键阶段。在mTeSR™1中培养的人ES和iPS细胞系，被接种在Corning Matrigel包被的96孔板中。24小时后，贴壁细胞被另外的一层Corning Matrigel覆盖，这导致在接下来的48小时内形成空化的PSC球体。第二天（第0天），将mTeSR™1培养基更换为STEMdiff™肾脏类器官生成培养基，启动空化PSC球体的分化。在接下来18天的分化过程中，细胞通过晚期原始条纹、后中间中胚层和肾后中胚层的阶段，产生由内皮细胞、足细胞和近端和远端小管组成的肾脏类器官。
文献
1. Freedman BS et al. (2015) Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived fromhuman pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications 6: 8715.
2. Morizane R et al. (2015) Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidneydevelopment and injury. Nature Biotechnology 33(11): 1193–200.
3. Takasato M et al. (2015) Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and modelhuman nephrogenesis. Nature 526(7574): 564–8.
4. 试剂材料和设备
2.0 试剂和材料设备
2.1 STEMdiff™ 肾脏类器官生成试剂盒
下面组分只能作为 STEMdiff™ 肾脏类器官生成试剂盒的组分，不能单独订购。参考STEMdiff™ 肾脏类器官生成试剂盒的说明书查看各组分的保存温度和稳定性信息。
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名称（货号） |
组分 |
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STEMdiff™肾脏类器官生成基础培养基, 100 mL |
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STEMdiff™肾脏类器官生成分化添加物 SG (100X), 200 mL |
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STEMdiff™肾脏类器官生成分化添加物DM (50X), 1.6 mL |
2.2 其它试剂和材料
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货号 |
名称 |
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mTeSR1 |
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38002 |
96孔板 |
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Corning, #352070 |
50 mL离心管 |
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Ibidi 89626 |
µ-Plate 96-well, black* |
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27250 |
37 µm可翻转细胞筛，大 |
*如果需要高质量的成像采集和分析，请使用此板。
2.3 设备
- 生物安全柜
- CO2 培养箱
- 低速离心机
- 血清学移液管
- 多通道移液器
- 血细胞计数器
- 倒置显微镜
- 冻存盒
- -20℃冷冻设备
- 冰箱（2-8℃）
5. 包被培养皿
4.0 Corning Matrigel包被培养皿
1) 将一份分装后的 Matrigel 从-70℃取出，置于冰上解冻。
2) 用预冷的DMEM/F-12+15 mM HEPES稀释Matrigel，使蛋白浓度达到0.5 mg/mL。并置于冰上。 例如对于蛋白浓度为10mg/mL的Matrigel，将2.5 µL Matrigel加入到47.5 µL MEM/F-12+15mM HEPES中。
3) 迅速将50 µL稀释好的Matrigel加入96孔板的个培养孔中（25 µg蛋白/孔）。转动培养皿，使基质胶均匀包被培养孔。
4) 室温（15-25℃）孵育至少1小时。请勿让培养皿上包被的Matrigel溶液变干。
注意：如果不立即使用，培养皿必须第5步前，至少提前半30分钟将培养板取出，使其达到室温（15-25℃）。
5) 使用前，轻轻将培养板倾斜一侧，收集多余的Mareigel溶液。 用血清学移液管除去多余的溶液 。确保包被的表面不被划伤。
6. hPSC分化为肾脏类器官
5.0 hPSC分化为肾脏类器官
5.1 单细胞接种的hPSC形成空化的球体
下面的流程是从6孔板到96孔板(第-3天)以单细胞接种高质量的hPSC，接着形成空化的PSC球体(第-2到第0天)。在第1天即可看见空化的PSC球体。
第 -3 天
1) 通过显微镜观察并鉴定已分化的区域。用马克笔或透镜标志器在培养板底部标记这些区域。
2) 用移液枪或移液管去除标记区域内分化的部分。用D-PBS（2 mL/孔）洗涤培养孔。
注意：高质量的hPSC非常关键。去除分化的细胞将提高类器官生成效率。
3) 从培养孔中吸出D-PBS，并在每孔中加入0.5 mL Accutase，37℃孵育10分钟。
4) 孵育过程中，按照2 mL/孔量在50 mL离心管中加入 DMEM-F12。
5) 孵育完后，用1 mL移液管将细胞转移至上述预先添加DMEM-F12的离心管中。
6) 通过上下吹打3-4次，将克隆打成单细胞悬液。
7) 300 x g离心5分钟。
8) 吸出上清液，收获的每孔加入1 mL mTeSR™1+10 µM Y-27632。
9) 通过37 µm的可翻转滤网过滤细胞悬液，留下通过滤液。
10) 血细胞计数器计数细胞数量。
11) 将细胞悬液加入无菌试剂槽中。使用多通道移液枪将1000-7000个细胞（大约20-140 µL细胞悬液）接种到Matrigel包被的96孔板的每孔中（4.0节准备）。如果接种后总体积<200 µL，使用mTeSR™1+10 µM Y-27632补充体积至200 µL。每孔接种细胞悬液的最大体积为200 µL。
注意：建议进行预实验，以确定所使用的细胞系的最佳单细胞接种密度。接种系列单细胞密度(例如，1000、3000、5000和7000细胞/孔)，并在同一天开始每个密度的分化。
12) 通过多通道吸管上下吹打几次，确保细胞均匀分布。 混匀后，将细胞在安全柜内静置5-10分钟，不要扰动细胞。
13) 将培养板置于37°C，5%CO2和95%湿度的培养箱中培养过夜。代表图片见图1。
图1.单细胞接种hPSC（第-2天）
第-2天的H1(WA01)、H9(WA09)ES细胞系和WLS-1C、STIPS-M001 iPS细胞系。H1、H9和STIPS-M001细胞系接种密度3000个细胞/孔；WLS- 1C细胞系接种密度为5000个细胞/孔。标尺：450 µm
第 -2 天 hPSC形成空化球体
14) 按照下面操作步骤，使用Matrigel进行全换液。
a. 冰上解冻分装的Matrigel。
b. 将Matrigel添加到预冷的(2-8°C) mTeS R™1(不含Y-27632)中，使蛋白质浓度达到0.25 mg/mL。例如对于蛋白浓度10 mg/mL的Matrigel，将2.5 µL Matrigel加入到97.5 µL mTeSR1中。
c. 立即移除培养孔中的培养基，然后加入100 µL预冷的m TeSR™1+Matrigel(25 µg蛋白/孔)。
注意：在这一步，预冷的mTeSR™1+Matrigel 应直接添加到细胞中，以防Matrigel成胶。可以使用多通道移液器更换培养基。确保枪头不碰触到培养孔底部。然后丢弃在废液槽中。
d. 37℃孵育24 h。
第 -1 天
15) 用100 µL/孔mTeSR™1（室温）进行全huanye 。在37°C孵育1天。
注意：在第0天，hPSC集落应开始形成圆形、空化的PSC球体。代表性图像见图2。
16) 进行5.2节肾脏类器官分化的第1阶段。
图2. 在第0天，ES细胞系(H1和H9)和iPS细胞系(W LS-1C和STIPS-M001)
Corning Matrigel覆盖hPSCs（单细胞接种），有效地形成空化的PSCs。标尺：450 µm。
5.2 肾脏类器官分化第1阶段
在开始分化后（下面的步骤1-2)，最佳的孵育时间为36小时(最多可接受40小时孵育）。第0天结束时进行以下操作，取决于想到达36-40小时孵育的时间点（第 1.5天，第5.3节）
第 0 天（开始类器官的分化）
1) 使用无菌技术准备第1阶段的培养基(STEMdiff™肾脏类器官生成基础培养基+ STEMdiff™肾脏类器官生成添加物SG)。下面的例子是准备200 µL培养基（96孔板的1孔）。 如果准备其它体积，进行相应调整。
a. 室温（15-25℃）或2-8℃过夜解冻STEMdiff™肾脏类器官生成基础培养基。混匀。
注意：如不立即使用，2-8℃存储，2个月内用完。或者分装储存于-20°C。不要超过有效期。分装好的的培养基解冻后，应立即使用或2-8℃存储，2周内用完。避免反复冻融。
b. 冰上解冻STEMdiff™肾脏类器官生成添加物SG。混匀。
注意：如不立即使用分装储存于-20°C。不要超过有效期。分装好的的添加物解冻后，应立即使用或2-8℃存储，2周内用完。避免反复冻融。
c. 对于96孔板的1孔，在198 µL基础培养基中添加2 µL添加物SG。 完全混合。 使用前预热至室温(15-25°C)。
2) 小心将第5.1节96孔培养板1孔中的培养基移除。每孔加入200 µL第1阶段培养基（室温）。 37°C下孵育36-40小时。
3) 进行5.3节类器官分化的第2阶段。
5.3 肾脏类器官分化第2阶段
在诱导晚期原始条纹后36小时细胞的代表性图像见图3（第1.5天）
图3. 第1.5天的ES细胞系（H1和H9）和iPS细胞系（WLS-1C和STIPS-M001）
在分化的第1阶段（第0-1.5天），生成晚期原始条纹。细胞将经历一个严重的细胞死亡数量，这将导致部分细胞脱离培养孔和集落减小。标尺：450µm。
第 1.5 天（开始分化后的36小时）
1) 使用无菌技术制备第2阶段的培养基(STEMdiff™肾脏类器官生成基础培养基+ STEMdiff™肾脏类器官生成添加物DM)。 下面的例子是准备500 µL培养基（足够96孔板的1孔换液4-5次）。如果准备其它体积，进行相应调整。
a. 室温（15-25℃）解冻STEMdiff™肾脏类器官生成添加物DM。混匀。
注意：如果不立即使用，分装储存于-20°C。不要超过有效期。分装好的的培养基解冻后，应立即使用或2-8℃存储，2周内用完。避免反复冻融。
b. 对于96孔板的1孔，在490 µL基础培养基中添加10 µL添加物DM。 完全混合。使用前预热至室温(15-25°C)。
注意：该体积足够96孔板的1孔换液4-5次。如果肾小管类器官在第8-10天开始形成单层，则继续分化，并准备借来用的培养基。
2) 用200 µL/孔第2阶段培养基（室温）对96孔培养板每孔进行全换液。37°C下孵育2天。
注意：小心移除第1阶段培养基，然后稍微倾斜板，沿培养孔壁逐滴加入第2阶段培养基。在这个阶段，细胞很脆弱，很容易漂起来。
3) 2-8℃存储剩下的第2阶段培养基，2周内用完。
第 4 天
4) 用100 µL/孔第2阶段培养基（室温）对96孔培养板每孔进行全换液。37°C下孵育2-3天。
注意：第4天的代表性图片见图4。
图4. 第四天，分化的培养物开始形成融合的单层
与第一阶段结束时相比，到第4天时ES 细胞系 (H1 and H9) 和 iPS细胞系 (WLS-1C and STiPS-M001) 衍生的培养的恢复率和扩增均有所增加。细胞开始形成融合的单层，细胞密度高度依赖于不同细胞系之间的内在差异。标尺：450 µm。
第 6-18 天
1) 每2-3天用100 µL/孔 第2阶段培养基（室温）进行全换液，直到Day18。37℃，孵育。
注意：推荐在每周的周一、周三和周五进行全换液。到第8-10天，如果没有观察到管状肾脏类器官样结构（见图5），应该重新开始培养，因为没有肾脏类器官的发育。
2) 图5和图6是di8tian和第15天的典型图片，第18天，将完全建立管状肾脏类器官，可以通过标准方法检测或者收集用于流式分析。肾脏类器官在18天以后最多可再培养1周，并在每2-3天进行全换液。然而，却不会再观察到类器官的发育。
3) 对于肾脏类器官的固定和免疫染色，进行第6.0节。
图5 第8天的早期管状肾脏类器官
ES细胞系(H1和H9)和iPS细胞系(W LS-1C和STIPS-M001)衍生的早期类器官结构。自体组织的曲状管状类器官结构产生于单层培养物底层。标尺：450µm。
7. 肾脏类器官的固定和染色
6.0 肾脏类器官的固定和染色
6.1 所需试剂
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名称 |
货号 |
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D-PBS （不含 Ca++ 和 Mg++） |
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多聚甲醛 |
e.g. Affymetrix 19943 1 LT |
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Triton™ X-100 |
e.g. Millipore Sigma X100-100ML |
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驴血清 |
Millipore Sigma D9663-10ML |
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DAPI |
6.2 试剂准备
开始6.3节之前准备以下试剂。
4%多聚甲醛
用D-PBS准备4%的多聚甲醛溶液。混匀，2-8℃存储。
PBS-T（破膜液）
用D-PBS稀释Triton™ X-100 使其终浓度达到0.2%。混匀。
注意：每次试验准备新鲜试剂。
封闭液
PBS-T稀释驴血清使其终浓度达到10%。混匀。使用时置于冰上或2-8℃操作。
注意：每次试验准备新鲜试剂。
DAPI 溶液
封闭液中加入DAPI，使其终浓度达到1 µg/mL。混匀。
6.3 固定和染色流程
以下流程用于96孔板的1孔。如果是其它培养皿，适当调整。
1) 将含有肾脏类器官培养孔中的培养基吸出。小心加入200 µLD-PBS。然后移除D-PBS。
2) 每孔加入85 µL 4%的多聚甲醛溶液进行固定。室温（15-25℃）孵育15分钟。移除多聚甲醛溶液。
3) 用200 µL D-PBS清洗培养孔3次。移除D-PBS。
注意：如果暂时不染色，将200 µL D-PBS留在培养空中，用Parafilm®封口并在2-8℃存储。
4) 移出DPBS，加入200 µL/孔 PBS-T溶液。室温（15-25℃）孵育15分钟。移除多PBS-T溶液。
5) 加入200 µL/孔封闭液。室温(15-25℃)孵育至少30分钟。
6) 在培养孵育封闭缓冲液时，通过用封闭液稀释一抗，准备一抗混合物。推荐一抗、抗体稀释比例和使用量和抗体参见表1。
7) 吸去培养孔中的封闭液，按照一抗说明书推荐食用量加入一抗。2-8℃过夜（至少16小时以上）震荡孵育。移除一抗。
8) 通过用封闭液+DAPI（终浓度1 µg/mL ）稀释二抗。
9) 每孔加入200 µL D-PBS，室温(15-25°C)孵育5分钟。移除D-PBS。重复此洗涤步骤5次，一共洗涤6次。
10) 按照二抗说明书推荐食用量加入二抗。推荐抗体参见表1。避光，室温(15-25℃ )过夜震荡孵育。移除二抗。
11) 每孔加入200 µL D-PBS，室温(15-25°C)孵育5分钟。移除D-PBS。重复此洗涤步骤5次，一共洗涤6次。
12) 染色后的细胞中加入200 µL D-PBS。现在可在荧光显微镜下观察成像。
注意：如果不是立即观察成像，可用Parafilm®封口并在2-8℃避光存储。
表1 肾脏类器官免疫荧光染色推荐的一抗和二抗
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一抗 |
货号 |
使用量 |
二抗名称 |
二抗货号 |
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PODXL |
39-3800 |
2 µg/mL |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 |
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ECAD |
13-1700 |
1 µg/mL |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 |
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WT1 |
MA5-32215 |
1:50-1:200 |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
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VIM |
MA5-16409 |
1:1000 |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647 |
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CD31 |
MA5-13188 |
1:10-1:100 |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
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NPHS1 |
PA5-20330 |
10 µg/mL |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
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PAX8 |
MA1-117 |
1:50 - 1:200 |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 488 |
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SIX2 |
PA5-84322 |
0.25-2 µg/mL |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
8. 肾脏类器官生成常见问题和解决办法
7.0问题和解决办法
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存在的问题 |
引起问题的原因分析 |
解决办法 |
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肾脏类器官形成效率低 |
l 起始hPSC的质量低 l 没有优化接种密度 |
- 通过去除自发分化的细胞，确保接种高质量、未分化的hPSC - 通过测试接种密度范围（例如 96孔板的每孔分别接种1000,3000,5000和70000）， 从而确定最佳的细胞接种密度 |
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第1阶段分化后，下包完全脱离 |
l 单细胞接种密度太低 l Matrigel包被培养皿不充分或覆盖的Matrigel过量 |
- 开始分化时采用更高的单细胞接种密度 - 根据4.0节第2步和5.1节第14步的例子，计算最佳的Matrigel浓度。操作小心、 快速避免Matrigel成胶 |
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肾脏类器官在培养孔中分布不均 |
ES/iPS细胞接种不均匀 |
- 接种之前，确保使用多通道移液器上下吹打多次产生均已的单细胞悬液。混匀单细胞悬液， 将培养板置于培养箱5-10分钟，切勿扰动（5.1节第12步） - 小心将培养板转移至37℃、5%CO2、95%湿度的培养箱中过夜培养 |