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肺类器官研究
肺类器官研究
1.肺类器官
近年来，干细胞和祖细胞谱系的识别以及这些细胞在成人体内的活动的相关研究发展很快。相对而言，分子水平的信号通路对细胞行为的调控方面的研究发展缓慢。 普遍认为，个体发育过程中使用的主要分子信号通路在肺部细胞修复过程中被激活而发挥着重要作用，但是这些观点需要进一步在生理或临床相关实验模型上测试证明。近几年流行起来的体外类器官培养（支气管类器官和肺泡类器官）系统为解决呼吸干/祖细胞领域的问题以及进行囊性纤维化等疾病造模、药物筛查提供了最佳的技术支撑和研究平台。
人体呼吸道可分为传导区和呼吸区。传导区包括鼻腔通道、气管、主支气管、肺内支气管和细支气管，具有加温、湿润、过滤等保护功能，不参与换气流程。呼吸区是肺腔内吸入的空气与肺毛细血管中的血液进行换气（经肺通气进入人肺泡的新鲜空气与血液进行气体交换，氧气从肺泡顺着分压差扩散到静脉血，而静脉血中的二氧化碳，则向肺泡扩散）的场所1,2。
虽然呼吸道各主要部位均可以建模，但是肺泡细胞的体外培养由于组织结构的复杂程度及难获得性目前尚未有成熟的培养方法。临床和基础科学应用将主要精力集中在支气管上皮细胞，这可能是因为很多病症均是因为此部位的细胞遭到破坏，例如哮喘及囊性纤维病变（Cystic Fibrosis），并且研究人员能够很容易地通过鼻毛刷法或支气管镜获取此部位的原代细胞样本。呼吸道上皮细胞的体外培养对离体研究呼吸道的生理功能， 呼吸道疾病的致病机制以及诊疗都具有重要意义。
体外扩增
呼吸道上皮细胞分离后接种在细胞培养皿里，在专门的上皮细胞扩增培养基里， 基底干细胞会贴付存活并快速增殖传代。早期传代（P1-5）的基底细胞具有分化能力， 如果接种到分化培养体系里可以分化产生纤毛细胞、杯状细胞、基底细胞等多种细胞， 并由细胞分泌的粘液覆盖， 产生类似于体内生理结构和功能的假复层粘液纤毛柱状上皮组织。
气液界面培养（Air-Liquid Interface, ALI）
在此模型中，从鼻腔或支气管刷上获取人体的支气管上皮细胞，或是从供体组织上分离出上皮细胞，经传代扩增后接种到0.4μm Transwell培养皿中。诱导细胞分化的过程，首先需要让通透膜上培养的细胞增殖直至其完全融合，然后移去增殖培养基，只在底层小室换上分化培养基，这样顶层小室的细胞表面暴露在空气中，细胞底部通过多孔通透膜接触分化培养基，继续培养直至其完全分化成假复层粘液纤毛柱状上皮细胞（与原生人体呼吸道相似），整个分化维持过程大约需要21-28天。此模型系统适用于吸入毒理学，药物筛选以及基础研究等一系列应用3。和活体动物实验比较，使用此类模型的好处是费用低廉、易于操作。
肺类器官培养
将分离出的呼吸道上皮细胞种在半固体Matrigel®基质中培养成三维球状形态。在此模型中，单个细胞可以克隆增殖生长成为三维球状形态，被称之为支气管类器官培养2，4-6。类器官培养可以不依赖Transwell™通透性培养皿， 所以可以成为大规模高效筛选的极具吸引力的备选系统。
| 培养基 | 图片 |
| PneumaCult™-Ex, catalog（货号 #05008）不依赖饲养层，不含血清及牛垂体提取物（BPE）的培养基，从而彻底解决了这个问题：在扩增培养期间，研究人员可以扩增细胞至更高的代数，并且在随后的气-液 界面（ALI）培养期间，保持黏膜纤毛分化的潜能。PneumaCult™-ALI Medium（货号#05001）成份明确，不含血清及牛脑垂体提取物（BPE）的培养基，用于在气液界面下培养人气道上皮细胞。培养在 PneumaCult™-ALI 中的气道上皮细胞经历纤毛分化从而形成类似于人体内形态和功能的假复层上皮。 PneumaCult™-ALI培养基在3D培养系统中支持分化不同的气道上皮细胞 |  |
肺类器官培养其它试剂
| Lung肺 | |||
| 细胞来源 | 相关细胞因子 | 相关培养基 | 文献 |
| PSC | Activin A, FGF-4, FGF basic, Noggin, SHH | RPMI1640, Advanced DMEM/F12 | Dye, BR., et al., Elife. 2015 |
| PSC | FGF basic | Advanced DMEM/F12 | Wilkinson, DC., et al., Stem Cells Translational Medicine. 2016 |
参考文献
1. Berube K, et al. Altern Lab Anim 37: 89-141, 2009
2. Crystal RG, et al Proc Am Thorac Soc 5: 772-777, 2008
3. Barkauskas CE, et al. J Clin Invest 123: 3025-3036, 2013
4. Borok Z, et al. Proc Am Thorac Soc 8: 215-222, 2011
5. Hogan BL, et al. Cell Stem Cell 15: 123-138, 2014
6. Kotton DN and Morrisey EE. Nat Med 20: 822-832, 2014
2.人hPSC生成肺类器官和芽尖祖细胞类器官
肺上皮来源于内胚层，它经历了一系列复杂的内胚层-中胚层介导的信号反应，从而最终形成气道（支气管，细支气管）和气体交换单位(肺泡）的网状分支。这些阶段包括内胚层诱导、前后和背腹模式、肺分化、肺芽、分支形态发生，最后是成熟。
本文介绍了Alyssa J. Miller在“Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro ”一文中提到的一个分化流程，它重述了其中的几个里程碑，以便将人多能干细胞(HPSCs)分化为腹侧-前肠球体，并进一步分化为两个不同类型的类器官：人肺类器官和芽尖祖细胞类器管。
由此产生的人肺类器官具有类似于正在发育的人支气管/气道支气管细胞类型和结构，周围是肺间充质和表达肺泡细胞标记物的细胞。芽尖祖细胞类器官具有高度增殖的多能细胞群，具有体外多系分化潜能和体内移植潜能。人肺类器官可在50-85d从hPSCs形成，芽尖祖细胞类器官可在22d形成。本文提出的两种hPSC衍生模型已经参照用胎儿组织样本，并被发现代表人胎儿样组织。
因此，芽尖祖细胞类器官是探索上皮命运决定的理想选择，而人肺类器官可用于模拟人肺发育过程中的上皮-间充质转换。除了在发育生物学中的应用外，人肺类器官和芽尖祖细胞类器官可能在再生医学、组织工程和药物安全性和有效性测试中得到实现。
操作指示图
具体操作流程
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hPSC培养（步骤1-10）30-60分钟 |
操作流程参见：多能干细胞 |
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内胚层和前肠球体的定向分化（步骤11-14） 第9-12d：4d确定内胚层分化，4-5d前肠内胚层分化 |
11.在开启动流程之前，细胞45-75%融合时传代。 这可能需要在传代1-2天后。 12.添加定型内胚层培养基4天。（ 每天，通过移除现有培养基并将其替换为新鲜培养基，24孔板每孔0.5mL）。 13.培养的第5天，用前肠内胚层定向分化培养基替换现有培养基。第6、7、8和9天更换培养基。在第5-9天，每天更换培养基。 14.在第8天和第9天左右开始形成漂浮的球体。 |
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收集漂浮的前肠球体（步骤15-19） 15-60分钟 |
15. 在第8或第9天，将Matrigel（货号#354234）放在冰上的无菌安全柜。 16. 用无菌剪刀或手术刀切掉无菌p200移液管尖端大约5 mm，并将一支空的1.5mL带管盖的管子和一个新的（未包被的）24孔板放入有解剖显微镜的生物安全柜中。 17.将含有前肠球体的24孔培养板放置在解剖显微镜下。 在显微镜下观察以识别自由漂浮的球体。不要扰动单层，用一支切掉管尖的的p200吸管，轻轻地吸取自由浮动球体，将它们转移到一个空的1.5带盖管中。 多个培养孔的球体可以汇集在一支管子里。 通常将一个完整的24孔板汇集成一个1.5mL管。允许5-10分钟的球体沉降。尽管球体应该在重力作用下沉降下来，但是如果有必要可以在微离心机中低速离心10秒。 18.将球体接种于Matrigel胶(8.0mg/mL蛋白浓度)。 为了做到这一点，使用新鲜的p200，在解剖显微镜下轻轻地从管子中取出尽可能多的培养基。一旦移除培养基，立刻将一新的P200移液管管尖减掉。吸取200µLMatrigel。将Matrigel与球体一起放在管中，轻轻地上下吹打几次，将Matrigel与球体混合。操作要快速，以防成胶。 小心操作，以防产生气泡。将25µLMatrigel和球体混合物加入24孔板的单个培养孔中心。 200µL的起始混合物将足以使8个单独的培养孔均形成一个包含球体的Matrigel液滴。 19.将培养板放入培养箱10分钟，使Matrigel液滴凝固。一旦液滴凝固，加入0.5mL的所需培养基，从而产生人肺类器官或上皮芽尖祖细胞类器官。 |
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形成人肺来器官（步骤20A） 50天 |
20A.维持培养人肺类器官 具有周围被间质细胞包围的气道状结构需要50天生长，最佳的在第50-85天，因为这时类器官具有最大数量的气道样结构。需要每2-3周重新嵌入新鲜的Matrigel。 i. 前肠分化基础培养基中加入 1% FBS 和500 ng/mL FGF10。在包含球体的每孔中加入 500 µL 培养基, 确保培养基完全覆盖Matrigel液滴。每3-5天换液一次。 ii. 再次嵌入类器官。每 2–3周或者更快，如果类器官出现在腔中积累细胞碎片，或者下沉到Matrigel液滴的底部，将p1000移液管管尖切掉，并轻轻刮擦培养孔底，以解离含有类器官的Matrigel。 iii. 用吸管尖将整个液滴和周围的培养基一起吸出并转移到培养皿。在无菌环境中下解剖显微镜下，使用手术刀和27号钝针头轻轻切除并移除旧的Matrigel。小心不要切到组织。一旦完成，将现在的新的类器官转移至一支1.5mL带盖管中，并移除任何培养基。 iv. 切掉p200吸管管尖，并将200µL新鲜的Matrigel（保持在冰上）转移到含类器官的管子里；混合并将吸上所有Matrigel。连续将50µL Matrigel类器官混合物放入新鲜的24孔板的每孔中。目的是在每个液滴中植入1-3个类器官。 v. 将培养板置于培养箱10分钟，或者直到Matrigel液滴凝固。一旦液滴凝固，加入500µL 培养基。 vi. 在所需的时间内维持类器官，每2-3周重新植入类器官重复步骤20A(ii-v)。 一旦前肠球被放置在Matrigel中，大约需要50天才能获得含有基底细胞、粘液产生细胞和纤毛细胞，以及肺间充质细胞类型和原始肺泡细胞类型包围的假复层上皮结构。类器官可维持100天以上，但随着时间的推移，上皮逐渐丢失，60~85天之间是最佳的。 |
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产生芽尖祖细胞（步骤20B） 14-120天：开始生长14d，维持和连续传代120d |
20B.产生芽尖祖细胞 使用无菌针头传代，产生和维持芽尖祖细胞类器官。上皮cysts将在~2周后形成，并将包含一个几乎均质的芽尖祖细胞群体。如果培养物不均质，有明显上皮crysts结构的类器官可以在这个时间点（2周）进行手动分离。这种上皮类器官群可以通过无菌针传代培养120天来维持和扩增。
i. 使用当天，在DMEM/F12 + N-2添加物 + B27添加物+ 1× L-谷氨酰胺 + 1× 青链双抗组成的基础培养基中加入50 µg/mL L-抗坏血酸, 0.04 µL/mL monothioglycerol, 10 ng/mL FGF7, 50 nM ATRA和3 µM CHIR-99021 制成芽尖祖细胞类器官完全培养基。使用500 µL 完全培养基培养前肠球体。 ii. 每3-5天换液一次。 iii. 针头传代。在2-3周后或者更早，如果类器官在腔内出现细胞碎片积累或下沉到Matrigel液滴的底部，则使用P1000吸管尖端来去除含有类器官的Matrigel液滴。 将脱落的液滴放在一起，放入一个1.5mL带盖管中。 iv. 使用1mL注射器和27号钝针头，将Matrigel和细胞吸入注射器，并将内容物强行推回管中。 重复2-3次。 v. 在台式微型离心机中旋转管子中的内容物(例如，ThermoFisher mySPIN6微型离心机，货号# 75004061)全速（6300g）3-5秒。4℃，300g下旋转细胞3分钟也是可以接受的。上皮碎片将沉降到底部，Matrigel将继续悬浮在培养基中。 vi. 在无菌生物安全柜的解剖显微镜下，使用针头和注射器从管中取出培养基和Matrigel，留下细胞团。 vii. 用剪掉管尖的p200吸管将200µL新鲜的预冷Matrigel加入管中。混合细胞和Matrigel，避免气泡。将所有Matrigel混合物吸入，并连续将25µL的混合物加入24孔板的每孔。 viii. 将培养板置于培养箱10分钟或者知道Matrigel液滴凝固。加入750 µL芽尖祖细胞类器官完全培养基。 vx. 每2-3天按照步骤20B（iii-viii）重复针头传代，或在任何时间点挑选芽尖祖细胞群。 |
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形成芽状、典型的肺类器官（步骤20C） 6周 |
20C.过通量传代获得芽尖祖细胞类器官 上皮cysts将在~2周后形成，并将包含一个几乎均质的芽尖祖细胞群体。为了产生具有离散芽尖和气道样肺类器官，在传代过程中保持其结构完整。如果不使用针头传代芽尖芽尖祖细胞类器官，培养6周后将有助于芽上皮结构和，近端-远端模式的元素的产生，以及结构内部的功能性粘液细胞产生。 注意：不通过针头传代的芽尖祖细胞类器官将分泌粘液到腔，引起致密的外观，导致细胞死亡增加；因此，这些类器官必须定期清除。 i. 使用当天，在DMEM/F12 + N-2添加物 + B27添加物+ 1× L-谷氨酰胺 + 1× 青链双抗组成的基础培养基中加入50 µg/mL L-抗坏血酸, 0.04 µL/mL monothioglycerol, 10 ng/mL FGF7, 50 nM ATRA和3 µM CHIR-99021 制成芽尖祖细胞类器官完全培养基。使用500 µL 完全培养基培养前肠球体。 ii. 每3-5天换液一次。 iii. 不用针传代芽尖类器官。在2-3周后或者更早，如果类器官在腔内出现细胞碎片积累或下沉到Matrigel液滴的底部，则使用P1000吸管尖端来去除含有类器官的Matrigel液滴，并培养基和Matrigel液滴一起转入培养皿。 iv. 使用手术刀和27号钝针头轻轻切除并移除旧的Matrigel。小心不要切到组织。按照步骤20A（ii-v）重新嵌入新的Matrigel液滴。这些类器官含有芽尖祖细胞，在类器官周围的芽尖结构中，内部区域将主要显示SOX2气道状结构，可分化谓粘液分泌细胞。这些可以按照步骤20B（iii-viii）使用针头传代，并在任何时候挑选芽尖祖细胞群。 v. 清除来自于非针头传代类器官的粘液分。粘液或细胞碎片通常会聚集在类器官的腔中，并会以光学致密、黑暗和颗粒化的形式出现 在培养物不传代的2周后。为了清除这些碎片，乣一把无菌手术刀、干净的27号钝针头、一支1mL注射器和一支新鲜分装的预热DMEM/F12。将Matrigel和类器官转移添加了余人的DMEM/F12的培养皿中，并将其转移到放了解剖显微镜的无菌生物安全柜中。 vi. 在显微镜下，用无菌手术刀将器官切成两半。 使用1mL注射器与27号钝针头，吸满干净的预热的DMEM/F12。 轻轻推出培养基冲走类器官中的粘液细胞。 |
培养基
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培养基 |
定型内培养, 第1天 |
定型内培养, 第2天 |
定型内培养, 第3天 |
定型内培养, 第4天 |
前肠内胚层 第5-9天 |
人肺类器官培养 |
芽尖祖细胞类器官培养 |
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基础培养基 |
RPMI 1640 0.2% (vol/ vol) FBS |
RPMI 1640 2% (vol/vol) FBS |
RPMI 1640 2% (vol/vol) FBS |
(前肠基础培养基) Advanced DMEM/F12, 1× N-2, 1× B27, 10 mM HEPES buffer, 1× L-glutamine (2 mM), 1× penicillin– streptomycin (5,000 U/mL) |
(前肠基础培养基) Advanced DMEM/F12, 1× N-2, 1× B27, 10 mM HEPES buffer, 1× L-glutamine (2 mM), 1× penicillin– streptomycin (5,000 U/mL) |
(芽尖基础培养基) DMEM F12, 1× N-2, 1× B27, 1× L-glutamine (200 mM), 1× penicillin– streptomycin (5,000 U/mL), 0.05% (vol/vol) BSA |
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培养当天加入 |
100 ng/mL |
Activin A, 100 ng/mL |
Activin A, 100 ng/mL |
Activin A, 100 ng/mL
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10 µM SB431542, 200 ng/mL Noggin, 1 µM SAG, 500 ng/mL FGF4, 2 µM CHIR-99021 |
500 ng/mL FGF10, 1% (vol/ vol) FBS |
0.4 µM monothioglycerol, 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL FGF7, 50 nM ATRA, 3 µM CHIR-99021 |
3.对在Transwell中培养的上皮细胞进行荧光染色
实验过程
实验材料
- 正常血清（Normal serum，使用与二抗相同的物种）| ICC可以在ALI培养分化阶段的任何阶段进行，若要检测分化成熟的细胞，建议在ALI培养完全成熟后进行。有关人支气管上皮细胞（HBECs）、人小气道上皮细胞(HSAECs)或人肠道细胞分化的相关信息，请分别参考,PneumaCult™-ALI培养基、PneumaCult™-ALI-S培养基或IntestiCult™类器官分化培养基（人）。 |
操作流程
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| 组分 | 数量 | 添加后溶液中的最终浓度 |
| PBS | 97.85 mL | -- |
| Normal serum* | 2 mL | 2 % |
| BSA | 1 g | 1 % |
| Cold fish skin gelatin | 100 mg | 0.1 % |
| Triton™ X-100 | 100 μL | 0.1 % |
| TWEEN® 20 | 50 μL | 0.05 % |
| Sodium azide** | 50 mg | 0.05 % |
** Sodium azide是一种抗菌剂，添加的目的是为了防止缓冲液在存放较长时间后染菌。它的毒性很强，如果快速使用（几天内），可以不添加。2. 准备100 mL一抗缓冲液，按表2所列顺序混合各组分。加入各组分后彻底混合溶液。在2 - 8℃下储存一抗缓冲液。表2. 一抗缓冲液的制备
| 所含组分 | 数量 | 添加后溶液中的最终浓度 |
| PBS | 100 mL | -- |
| BSA | 1 g | 1 % |
| Cold fish skin gelatin | 100 mg | 0.1 % |
| Sodium azide** | 50 mg | 0.05 % |
| 组分 | 数量 |
| PBS | 100 mL |
| Sodium azide** | 50 mg |
| 组分 | 数量 |
| PBS | 1 mL |
| DAPI | 5 mg |
- DAPI染色母液的最终浓度为5 mg/mL。
- 在-20℃下储存DAPI染色母液。
准备培养板
1. 将在Transwell® inserts上培养的ALI培养物从培养箱中拿出。
封闭
1. 用浸泡过PBS的Kimwipe™轻轻擦拭每个Transwell®插件的底部。
一抗孵育
1. 在进行一抗添加之前，用PBS洗涤每个插件3次，每遍5分钟。
二抗孵育
1. PBS清洗插件三次，每次5分钟。
表5. 推荐的气道上皮细胞染色抗体
| 产品名称 | 货号 | 培养物类型 |
| Acetyl-alpha Tubulin (Lys40) Monoclonal Antibody (6-11B-1) | e.g.Invitrogen,#32-2700 | 大、小气道ALI培养 |
| MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | e.g.Invitrogen,#MA5-12178 | 大气道ALI培养 |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | e.g.Invitrogen,#40-2200 | 大气道ALI培养 |
| CC10 Antibody (SCGB1A1) | e.g. Santa Cruz Biotechnology, #sc-365992 | 小气道ALI培养 |
| Anti-SCGB3A2 Antibody | e.g. Abcam, #ab181853 | 小气道ALI培养 |
表6. 肠道单层染色推荐抗体
| 产品名称 | 货号 |
| CD326 (EpCAM) Monoclonal Antibody (1B7) | e.g.eBioscience,#14-9326-82 |
| Chromogranin A Monoclonal Antibody (LK2H10) | e.g.Invitrogen,#MA5-13096 |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15), FITC | e.g.eBioscience,#11-5698-82 |
| Lysozyme Polyclonal Antibody | e.g. Invitrogen, #PA1-29680 |
| CD324 (E-Cadherin) Monoclonal Antibody (DECMA-1) | e.g. eBioscience, #14-3249-82 |
封片和观察
1. PBS清洗插件三次，每次5分钟。
图1. Transwell® 插件的hanger和弯曲的膜边缘
6. 使用Pasteur pipette，添加一滴防褪色溶液或液体封片剂到显微镜载玻片上进行封片。实验数据
图2. 气-液界面培养的HBECs和HSAECs表达ACE2
ALI培养物的共聚焦图像（A）在PneumaCult™-ALI培养基中培养的HBECs和（B）在PneumaCult™-ALI-S培养基中培养的HSAECs，P2代培养物。ALI培养物使用用纤毛细胞（AC-tubulin；绿色）、SARS-CoV-2受体（ACE2；洋红）和紧密连接蛋白（ZO1；红色）的抗体进行染色。细胞核用DAPI（蓝色）复染。在早期培养物（≤P6，HBECs；≤P4，HSAECs）中，（A）大气道和（B）小气道培养体系中都检测到了ACE2。在使用ALI分化之前，HBECs和HSAECs都使用PneumaCult™-Ex Plus培养基扩增。
图3. 肠单层和ALI培养物表达关键的分化标志物
有类器官来源的单层培养体系（淹没培养）（第7天）或在ALI培养体系（第14天），均使用IntestiCult™类器官分化培养基（人），表达特异性的分化标志物。单层培养体系（淹没培养）的细胞表达肠上皮细胞（KRT20，绿色）和紧密连接蛋白（ZO-1;红色），ALI培养体系中杯状细胞（MUC2;绿色）的表达水平上升，说明分泌细胞的表达量升高。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺= 500 μm。
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