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脑类器官研究
脑类器官研究
1. 类器官的血管化研究
类器官(Organoids)是将具有干性潜能的细胞在体外进行3D培养，形成多种特异性细胞类型集合的微器官团，能够体外再现真实器官的三维构造及生理功能。然而体外培养的类器官往往缺乏有效的血管，随着类器官体积的增加，缺氧及代谢废物累积导致细胞凋亡，最终致使组织坏死，因此目前培养的类器官无论是形态大小还是生理功能都无法做到完全模拟真实的组织器官，这也是类器官培养技术发展的重大瓶颈之一。类器官的血管化研究一直是类器官研究领域的热点与难点。
01 脑类器官血管化研究
有研究表明中枢神经系统在发育过程中不会产生血管祖细胞[1]，血管祖细胞的缺乏则阻碍了类器官的血管化进程。为了培养血管化的脑类器官，2018年Pham MT等[2]将同一患者来源的人诱导多能干细胞(iPSCs)衍生的血管内皮细胞(ECs)与脑类器官共培养，移植入免疫缺陷的小鼠脑内。移植当天免疫荧光检测结果显示CD31阳性细胞围绕在类器官周围，移植后随着脑类器官在体内的进一步发育成熟，切片染色结果显示新形成的人毛细血管强有力的向脑类器官干细胞核心区渗透，核心区外围则显示出典型的连续性内生化血管网络结构。未血管化的脑类器官在移植后则无法存活，然而该研究尚未涉及移植物类器官血管与宿主血管之间的相互作用。
脑类器官染色图，白色箭头为新生血管[2]
hCD31为血管细胞标志物；STEM121为人脑干细胞标志物；DAPI为细胞核染料。
2018年Mansour AA等[3]在体外将人胚胎干细胞(hESC)诱导分化为小型脑类器官后，直接移植入免疫缺陷小鼠软脑膜血管上。移植的类器官继续进行神经分化和成熟并与小鼠脑组织进行了很好的整合，双光子扫描成像结果显示小鼠血管侵入移植物并生长延伸，血管内血流活跃，移植物类器官功能性血管网络发展良好。
小鼠脑内脑类器官血流图[3]
人类ETS变体2(ETV2)转录因子与人血管内皮细胞的形成高度相关。2019年Cakir B等[4]设计了一种表达人类ETV2转录因子的hESCs细胞，诱导该细胞分化成为带血管蒂的人皮层脑类器官(vhCOs)。体外培养的vhCOs体积、神经细胞存活率均显著大于对照组。在vhCOs中部分特殊的内皮细胞还形成了神经周血管丛，并与脑内的神经血管紧密相连，十分类似于血脑屏障结构。将该vhCOs移植入免疫缺陷的小鼠腿内，FITC灌注结果显示ETV2诱导的内皮细胞支持功能性的血管系统形成。
2020年Shi Y等[5]则是将hESCs或iPSCs与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)共培养，定向诱导其分化为血管化的脑类器官。免疫荧光染色结果表明，HUVECs在脑类器官中相互连接，并形成具有通透能力的复杂血管系统，该血管系统可以在脑类器官中可稳定存在200天以上。研究者将血管化脑类器官植入免疫缺陷小鼠脑内S1皮质空洞中，免疫荧光检测结果显示在脑类器官移植物中HUVECs 与宿主小鼠血管内皮细胞发生了整合，并在脑类器官中形成了有血液流动的功能性血管网络系统，支持其成熟存活。
02 肝类器官血管化研究
2011年Baptista PM等[6]使用灌注洗涤剂去除肝脏组织的细胞成分，同时保留了完整的的血管网络。将hUVECs和人胎肝细胞(hFLCs)接种到脱细胞支架中，利用肝脏内部血管网络包括大血管及微血管网络结构，实现肝脏组织的血管化培养。
2013年Takebe T等[7]将iPSC诱导形成的肝内胚层细胞与HUVECs和人骨髓来源的间充质干细胞(hBMSCs)共培养，待其形成具有三维球状组织的肝芽(iPSC-LBs)，移植入免疫缺陷的小鼠中。移植48小时内免疫荧光检测结果显示移植的iPSC-LBs血管与宿主血管相互连接形成复杂的血管网络，实时成像结果确认了宿主血液灌注到新形成的人体功能性血管网络中。
03 小肠类器官血管化研究
Holloway EM等曾在小肠类器官的形成早期，检测到大量的内源性血管内皮细胞，然而随着培养时间的推移，血管内皮细胞(ECs)逐渐发生凋亡。2020年，他们在常规肠类器官培养方法的基础上，在培养体系中加入EGF, VEGF, BFGF和BMP-4等细胞因子，诱导内源性ECs共分化，从而形成血管化的小肠类器官(vHIOs)[8]。体外培养数周后，免疫荧光法检测结果显示vHIOs间质内存在大量CD31/CD144双阳ECs细胞，证实了内源性ECs的富集，ECs在培养体系中可长期存活2个月。
hPSC来源的小肠类器官(vHIO)及对照组染色图[8] ECAD为蛋白染色；CD144为EC细胞标志物。
04 肾脏类器官血管化研究
2019年Low JH等[9]通过动态调节WNT信号通路，控制近端肾小球和远端肾小管的比例，调节近端足细胞释放血管内皮生长因子A(VEGFA)的水平，进而诱导血管化的肾脏类器官分化形成。免疫荧光检测结果明确了肾脏发育的起始阶段存在内源性血管内皮祖细胞，血管内皮祖细胞的发育依赖于足细胞分泌的VEGFA，并且VEGFA的分泌量决定了血管网络的丰度。血管化的肾脏类器官移植入宿主小鼠后，继续发育成肾小球毛细血管簇，右旋糖酐灌注实验结果显示与野生型小鼠肾脏类似，移植的肾脏类器官具有初步的过滤和重吸收功能。
第24天，肾类器官免疫荧光染色图[9]
CD34为ECs表面标志物; CD31为ECs表面标志物; NPHS为肾足突细胞标志物; DAPI为细胞核染料。
目前仅有少数种类的类器官血管化培养成功，该研究仍任重而道远。诱导类器官血管形成的决定性因素尚不清楚。不同种类类器官血管化培养的条件也不尽相同。虽然血管化研究道阻且艰，但随着研究者的不断探索，或许在不久的将来，科学家们可以成功在体外构建具有血管可供移植的类器官，以造福人类。在科研的道路上迎难而上，终会破茧成蝶！
2. 脑类器官
几个世纪以来，人类大脑一直令科学家深深着迷。而认识人类大脑的全部功能是每一个神经生物学家的梦想；但是，由于现实情况和伦理道德方面的原因，想要获得实验使用的脑组织非常困难。因此，传统上使用某些动物（大多数情况为啮齿类）作为模式生物，用于神经科学研究，尤其是用于神经系统发育和疾病的研究。
不过，人和啮齿类动物的脑组织结构和发育毕竟有很大不同，因此，动物模型不能完全反映人类疾病的病理特征。幸好，现在研究人员可以通过分化人多能干细胞（hPSCs），包括诱导多能干细胞（iPS）和胚胎干细胞（ES），来获取人神经细胞。研究人员现在可以利用模拟人体生理环境的模型来开发新药、验证细胞疗法和研究神经疾病。而且由于现在可以生成患者特异性的分化细胞类型，iPS 细胞还可以用来弥补动物模型研究和临床研究之间的差距。
神经细胞培养形式
一直以来，成年和胚胎神经元细胞一直采用2D组织培养技术的传统方法进行培养。科学家们通过这种简化方法即可识别相对简单症候相关的关键机理路径。通过简化的富集神经元培养系统，为细胞生物学提供了重要及相关的知识。然而，由于动物组织（尤其是脑组织）是由细胞和细胞外基质组成的极为复杂的3D结构，2D细胞培养无法充分体现完整的组织结构。因此，仅用一个2D细胞培养体系无法解决某些特定的研究课题，如有关神经组织结构变化的课题。为更好地在体外模拟人类脑组织，研究者们已意识到有必要建立一个可重现大脑3D结构排列的模型。
需要注意的是，与已建立的2D细胞培养系统相比，3D细胞培养系统更加复杂，呈现出更强的异构性，很难掌握和分析。事实上，3D培养系统可能无法进行特定的实验，如高通量机理筛选。在未来，研究者们很有可能通过2D和3D细胞培养模型结合的方式来寻找研究课题的最佳答案。神经科学学家常用的简单3D细胞培养模型包括神经球和神经聚集体。
神经球： 神经球检测为最早的3D神经培养系统之一1。自推出以来，它被广泛应用于在中枢神经系统（CNS）中鉴定神经干细胞（NSCs）2-5。在该实验中，NSC和神经祖细胞（NPCs）在无黏附底物的培养条件下进行培养。单个细胞增殖而形成小细胞团，亦称为神经球，呈悬浮性生长。组成神经球的多能干细胞保留向CNS中主要神经细胞类型分化的潜能1。
神经聚集体： 神经球样的神经聚集体亦可通过多能干细胞形成，通常首先形成一个拟胚体（EB）6。EB为多能干细胞的三维聚集体，代表胚胎发育的早期阶段。无论是定向分化还是自发分化方案，从ES或iPS细胞克隆形成EB是目前一种常见的起点。在神经分化中，通过基于EB的神经诱导可从ES/iPS细胞中制备CNS类NPC；但是，越来越流行使用以基于单层细胞的神经诱导方案7。随后生成的NPC通常转移至2D培养，用于进一步分化为神经元或神经胶质细胞。
神经玫瑰花环： 常用神经诱导方案的一个显著特征为神经“玫瑰花环”的形成8。这些可通过形态学鉴定的含NPC结构，通常认为其代表神经管。在花环结构中，细胞围绕中央腔并在腔侧进行有丝分裂。虽然神经花环见于2D培养系统，其可很好地模拟早期神经形成。在神经花环结构中的NPC可被扩增或进一步分化为代表脑部不同区域表型的成熟细胞类型9-14。
神经球和神经聚集体是非常有用的 3D 细胞培养系统，可以解决简单的研究课题；但是，这两种系统完全由神经干细胞和祖细胞组成，缺少其他神经细胞类型，例如神经元和星形胶质细胞。要进一步完善 3D 培养系统，不仅需要开发包含大脑中所有相关神经细胞类型的系统，还需要让这些细胞的组织方式模拟体内大脑皮质的分层。皮质球体（Cortical spheroid）和脑类器官（cerebral organoid）是由 hPSC 培育而来的模型，已证实这些模型能够产生与大脑本身的组织方式相似的结构。细胞组织和组成的复杂性可通过添减外源模式因子（patterning factors）来调节。添加模式因子可获得特定脑区（例如中脑或前脑）的模型。而略去模式因子则可得到被称为“迷你大脑”或全脑类器官（whole-brain organoid）的模型，这种模型为具有多个区域的异质性结构，各区域代表了不同的脑区。
皮质球体： 由于引入了 3D 培养方法来产生球状体，iPS 体外细胞培养系统离体内环境又近了一步。Eiraku 等人建立了一种 ES 细胞的 3D 培养系统，并命名为 SFEBq，即无血清悬浮培养的快速重聚集的类胚体样的聚集体15。这是 Watanabe 等人开发的 SFEB 法的改良版本16。在 SFEBq 中，ES 聚集体分化而形成类似神经外胚层上皮，产生皮质神经元，然后皮质神经元以类似于早期大脑皮质生成的方式进行自我组织15。这种“皮质球”培养系统后来经进一步优化，可展示人新大脑皮质生成所特有的自我组织方式 17。后来，Sergiu Paşca 的实验室又取得了进一步的进展18。Paşca 等人在没有任何细胞外基质（ECM）的情况下，利用最少的模式因子从 iPS 细胞中培育出了被称为人皮质球体的神经结构。这些球状体包含深层皮质神经元和浅层皮质神经元。重要的是，这些神经元中夹杂着休眠星形胶质细胞。这是一种很难从体外获得的表型，在突触的形成中起着重要作用，并且对于神经系统的正常发育至关重要19-20。转录分析显示，经过 2.5 个月的培养，这些球状体与体内发育的人胎儿期大脑相似。
脑类器官或全脑类器官： 在Lancaster和Knoblich有关脑类器官（又名“迷你脑”模型）的文章21发表前，没有人创建出具有代表不同脑部区域的神经类器官。不同于皮质球体，培养脑类器官的环境促进自我组织和自我构建。这些细胞聚集体使用ECM，Corning® Matrigel®包被。ECM提高了神经组细胞层的极化和神经上皮的出芽。这些出芽不需要外源加入额外的模式因子，即可以自发性的发育为不同的脑区。这些区域包裹不同“层面”的神经元，可代表人脑早期的发育过程。Lancaster的方法进一步被应用于生成前脑类器官22。优化后的方法可以使用3D打印制作的一个微型的搅拌生物反应器23。与普通的生物反应器相比，这使得在小规模培养控制脑类器官成为了可能，如果培养体系较大，类器官的数量和大小都会出现不均一的情况。
脑类器官完全培养基
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培养基 |
图片 |
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STEMdiff™脑类器官试剂盒（货号 #08570）无血清培养系统，设计用于从hPSCs生成脑类器官，基于MA Lancaster和JA Knoblich发表的配方研发：Lancaster MA et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 2013 Sep 19;501(7467):373-9. 培养40天后，这些脑类器官具有层次分明的祖细胞群，并产生成熟神经元，与在早期发育中人脑皮质层的观察结果相符。 |
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脑类器官培养方法
将患者的皮肤成纤维细胞重编程为 iPSCs，然后置于添加了FGF-basic(碱性成纤维细胞生长因子)，CHIR 99021以及MEK抑制剂(PD 0325901)的培养基中培养21天。快速增长的克隆被挑出，并传代于经灭活处理的CF-1小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上生长。
随后，将单个细胞接种在添加了低浓度的FGF-basic和高浓度的ROCK抑制剂(Y 27632)的培养基中培养，形成神经上皮组织后转移至Matrigel胶滴(droplets)中，经过一段时间的静态生长，将这些组织胶滴转移到旋转生物反应器中，并加入含有维甲酸的分化培养基进行培养。通过分析这些患者的类器官，研究人员发现过早的神经元分化，这可能是导致疾病表型的原因21。
最近，一种小型的旋转生物反应器(SpinΩ)被研发出，用于由人iPSCs产生前脑特异性类器官。第1天，分离人iPSCs集落到6孔板上，用含A 83001的干细胞培养基培养；第5-6天，半量换液为含Wnt-3A、CHIR 99021和SB 431542(TGF-β的选择性抑制剂)的诱导培养基；第7天，将类器官置于Matrigel包被的组织培养皿，用诱导培养基继续培养6天以上；第14天，从Matrigel分离类器官，将10-20个类器官转移到12孔旋转生物反应器(Spin Ω)中，添加分化培养基继续培养；到第71天时，将分化培养基替换为含BDNF、GDNF和TGF-β的成熟培养基。这些类器官被用于研究寨卡病毒暴露对大脑的影响，将来可应用于药物测试。另外，该平台也可以用于诱导人iPSCs分化为中脑和下丘脑类器官23。
| Brain脑 | |||
| 细胞来源 | 相关细胞因子 | 相关培养基 | 文献 |
| PSC | FGF2 | DMEM/F12, Neurobasal | Lancaster, M.A., et al. Nature. 2013 |
| PSC | FGF2, EGF, BDNF, NT-3 | DMEM/F12, Neurobasal | Pasca, A.M. et al. Nature Methods. 2015 |
| PSC | DKK1 | DMEM/F12 | Phillips, A.W., et al. J. Vis. Exp. 2017 |
| PSC | DKK1, BMPR1a-Fc | DMEM/F12, Neurobasal | Mariani, J., et al. PNAS. 2012 |
| PSC | N/A | DMEM/F12, Neurobasal | Iefremova, V., et al., Cell Reports. 2017 |
| PSC | BDNF, GDNF, NT-3, Laminin, bFGF | DMEM/F12, Essential 8, Essential 6, Neurobasal | Zhou, T., etal., Cell Stem Cell. 2017 |
参考文献
1. Reynolds BA & Weiss S. (1992) Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science 255(5052): 1707–10.
2. Tropepe V et al. (1999) Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol 208(1): 166–88.
3. Tropepe V et al. (2001) Direct neural fate specification from embryonic stem cells: A primitive mammalian neural stem cell stage acquired through a default mechanism. Neuron 30(1): 65–78.
4. Conti L et al. (2005) Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol 3(9): 1594–1606.
5. Pollard SM et al. (2008) Fibroblast growth factor induces a neural stem cell phenotype in foetal forebrain progenitors and during embryonic stem cell differentiation. Mol Cell Neurosci 38(3): 393–403.
6. Zhang SC et al. (2001) In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 19(12): 1129–33.
7. Chambers SM et al. (2009) Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology 27(3): 275-80.
8. Elkabetz Y et al. (2008) Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev 22(2): 152-65.
9. Li X-J et al. (2009) Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development 136(23): 4055–63.
10.Ye W et al. (1998) FGF and Shh signals control dopaminergic and serotonergic cell fate in the anterior neural plate. Cell 93(5): 755–66.
11.Kim J-E et al. (2011) Investigating synapse formation and function using human pluripotent stem cell-derived neurons. Proc Natl Acad Sci U S A 108(7): 3005–10.
12. Li X-J et al. (2005) Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 23(2): 215–21.
13.Fasano CA et al. (2010) Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell 6(4): 336–47.
14. Seaberg RM & van der Kooy D. (2002) Adult rodent neurogenic regions: the ventricular subependyma contains neural stem cells, but the dentate gyrus contains restricted progenitors. J Neurosci 22(5): 1784– 93.
15. Eiraku M et al. (2008) Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.Cell Stem Cell 3(5): 519–32.
16. Watanabe K et al. (2005) Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci 8(3): 288–96.
17. Kadoshima T et al. (2013) Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A 110(50): 20284–9.
18. Paşca AM et al. (2015) Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods 12(7): 671–8.
19.Pfrieger FW & Barres BA. (1997) Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science 277(5332): 1684–7.
20.Ullian EM et al. (2001) Control of synapse number by glia. Science 291(5504): 657–61.
21. Lancaster MA et al. (2013) Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 501(1): 373–9.
22.Jo J et al. (2016) Midbrain-like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuromelanin-producing neurons. Cell Stem Cell. 19(2): 248-257.
23. Qian X et al. (2016) Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell 165(5): 1238–54.
3. iPSC来源人脑类器官培养操作流程
hPSC衍生的脑类器官则是一种三维（3D）体外培养系统，能够重现人脑发育过程和发育中的人脑结构。这些“迷你脑”提供了一种模拟人体生理环境的体外模型，专用于研究人神经系统特有的神经发育和疾病过程。脑类器官在人脑发育和神经系统疾病（诸如自闭症、精神分裂症、或因寨卡病毒感染导致的脑缺陷）的研究中具有重要应用。
STEMdiff™脑类器官试剂盒为无血清培养系统，设计用于从人胚胎干细胞（ES）和诱导多能干细胞（iPS）生成脑类器官，基于MA Lancaster和JA Knoblich8发表的配方研发。培养40天后，这些脑类器官具有层次分明的祖细胞群，并产生成熟神经元，与在早期发育中人脑皮质层的观察结果相符。
图1 STEMdiff™脑类器官试剂盒培养示意图
准备培养基
用无菌技术制备STEMdiff™脑类器官试剂盒（货号#08570）。根据需要按照使用说明准备每种培养基。培养基组分、体积及存储和稳定性见表1。
1. 室温(15-25℃)解冻添加物。混合完全。
注：如不立即使用，分装添加物并储存于-20℃。不要超过保质期。分装好的添加物再次解冻后，应立即使用。切勿反复冻融。
2. 按照表1所示，在基础培养基中加入添加物，充分混合。使用前，预热至室温(15-25℃)。
注：如果不立即使用，按照表1储存培养基。
表1 准备STEMdiff™脑类器官培养基
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培养基 |
组分 |
体积（mL） |
储存和稳定性 |
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EB 形成培养基 (50 mL) |
STEMdiff™脑类器官基础培养基1 |
40 |
2 - 8°C 最多储存2周 |
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STEMdiff™ 脑类器官添加物 A |
10 |
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诱导培养基 (50 mL) |
STEMdiff™脑类器官基础培养基1 |
49.5 |
2 - 8°C 最多储存2周 |
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STEMdiff™ 脑类器官添加物 B |
0.5 |
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扩增培养基(25 mL) |
STEMdiff™脑类器官基础培养基2 |
24.25 |
2 - 8°C 最多储存2周 |
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STEMdiff™ 脑类器官添加物 C |
0.25 |
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STEMdiff™ 脑类器官添加物 D |
0.5 |
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成熟培养基(100 mL) |
STEMdiff™脑类器官基础培养基2 |
98 |
2 - 8°C 最多储存2周 |
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STEMdiff™ 脑类器官添加物 E |
2 |
使用说明
操作前，阅读整个操作流程
使用无菌技术进行以下操作：
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A.EB形成(第0-5天) B.诱导(第 5-7天) C.扩增(第 7-10天) D.类器官成熟（第10-40天） |
A.EB形成(第0-5天)
该流程是由6孔板中的一孔hPSC形成的EB。对于其他培养器皿，相应地调整体积。使用前预热培养皿、培养基和试剂到室温 (15 - 25°C)。
注：当大多数的集落呈现大而紧致并有密集的多层中心状态时，对HPSC培养物进行传代。当融合率不超过70-80%，分化率< 10% 时传代hPSC。
第0天
1. 准备EB形成培养基（见表1）。
2. 按照以下方法，制备EB接种培养基：30 µL 5 mM Y-27632加入15 mL EB形成培养基中，使其终浓度为10 μM。
3. 显微镜下观察确定hPSC培养分化区域。通过刮擦去除分化的区域。
4. 将hPSC培养孔中的培养基吸去，用1 mL无菌的PBS洗涤培养孔。
5. 吸去PBS加入1mL GCDR.
6. 37°C孵育8-10分钟。
注：使用不同的细胞系和其它无酶解离试剂，孵育的时间可能会有所不同。
7. 用1mL移液器，缓慢地上下吹打3-5次，轻轻重悬细胞。将细胞悬液转移到无菌的50 mL离心管中。
8. 用另外的1 mL EB接种培养基洗涤培养孔，并将洗涤后的内容物一起转移至步骤8中的离心管中。
9. 300 x g 离心5分钟。
10. 去掉上清液。加入1-2 mL EB接种培养基重悬细胞。
11. 台盼蓝和血球计数板计数细胞。
12. 计算细胞体积，要求90000个细胞/mL；将这一细胞体积添加到合适的EB接种培养基中。
13. 在96孔圆底超低黏附培养板的每孔中加入100µL步骤12中的细胞悬液（90000细胞/mL）。
注：为了提高EB形成的效率和产量，这步推荐使用多通道移液枪。
14. 37°C孵育96孔培养板。至少24小时内不要扰动培养板。
15. 显微镜下观察培养板。直径较小的EB(100-200μm)将被观察到，在其周围有一层未整合的细胞。
第2-5天
16. 在第2天和第4天，轻轻在每孔加入100 μL EB形成培养基。这一步推荐使用多通道移液枪。37℃孵育。
17. 第5天，在显微镜下观察EB。此时EB的直径应达到>300μm（通常为400-600μm），并显示圆形和光滑的边缘（见流程示意图的图片）。
18. 进行B节。
B. 诱导（第5-7天）
注：使用前将培养皿、培养基和试剂加热到室温 (15 - 25°C)。
注：如果没有超低附着板，也可以使用AggreWell™冲洗液(货号#07010)预包被的组织培养处理过的培养皿以防止细胞贴壁。
第5天
1. 准备诱导培养基（见表1）并加热到室温(15 - 25°C)。
2. 24孔超低黏附培养板的每个孔中加入0.5 mL诱导培养基。
3. 如下在24孔培养板的每个孔中加入1-2个EB：
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a. 使用宽口径的200µL移液器枪头，从A节的96孔板的1孔中吸取50µL悬液获得EB。 b. 小心地将大部分培养基推回培养孔中，EB则留在移液器枪头端。 c. 在含有诱导培养基的24孔板的每孔中分配EB。 |
注：通过来回摇动培养板3-4次，确保EB在培养孔中均匀分布。互相接触的EB更有可能发生融合。如果大量的EB融合，在每孔转移1个EB。
4. 培养板在37℃孵育48小时。EBS将保持平滑、半透明的边缘（见流程示意图的图片）。
5. 进行C节（扩增）
C. 扩增（第7-10天）
第7天
1. 2-8°C冰上解冻Matrigel1-2小时。
注：解冻足够的Matrigel用于15μL/EB(例如96孔x15μL/孔=1.44 mL Matrigel)。
注：将Matrigel®保持在冰上，以防止过早成胶。使用前与Matrigel®接触的所有塑料器皿应在-20°C下冷却至少30分钟。
2. 准备扩增培养基（见表1 ）
3. 将包埋表面(如Parafilm)放置在一个空的、无菌的100mm培养皿中。
4. 采用200 µL宽口径移液枪头，从24孔板的1孔中吸取25-50 μL含有EB的培养基，转移到嵌入表面。重复此步骤，直到收集到12-16个EB。
注：一次嵌入不超过12-16个EB；这可防止EBs干燥和Matrigel过早成胶。
5. 用标准的200 µL移液枪头小心地从每个EB中除去多余的培养基。摆正枪头，使其远离EB避免将其吸上来。
6. 使用带有预冷的200 µL标准移液器枪头，在每个EB上逐滴加入15 µL Matrigel。
7. 用一支新的 200 µL枪头将EB布置在液滴中心。
8. 将培养皿安置于37℃条件下30分钟使Matrigel聚合。
9. 使用无菌手术钳抓住含有Matrigel液滴的嵌入面。
10. 将6孔超低黏附培养板一孔上的玻片摆正，用1毫升的吸管，吸取培养基，轻轻冲洗Matrigel液滴，使其从玻片脱离并进入培养孔。每孔使用3mL培养基。重复操作，直到所有12-16 Matrigel液滴都收集到培养孔中。
11. 37°C下孵育3天。嵌入的类器官将发展为膨胀的神经上皮，通过EB表面的出芽可证明（见流程示意图的图片）。
12. 进行D节（类器官成熟）
D. 类器官成熟（第10-40+天）
第10天
1. 准备成熟培养基（见培养基准备）
2. 在最慢的情况下使用5mL或10 mL的移液管，小心地吸去类器官培养孔中的所有培养基。不要扰Matrigel-类器官。
3. 在每孔中加入3 mL成熟培养基。
4. 在37°C的培养箱中，将类器官培养皿置于定轨摇床上。对于IN FORSHT Celltron定轨摇床，根据表2设置定轨摇床转速（rpm）。对于其他定轨摇床，使用图1中的等式计算转速rpm。
表2 不同培养皿在IN FORSHT Celltron定轨摇床上的推荐转速
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培养皿* |
培养基体积(mL) |
推荐摇床速度(rpm) |
相对离心力 (RCF)† (g) |
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6-孔培养板60 mm培养皿 |
3 |
65 |
0.11808 |
|
12-孔培养板 |
1.5 |
85 |
0.20194 |
|
24-孔培养板 |
1 |
100 |
0.2795 |
*6孔板和12孔
板是类器官培养的最好培养板。
† 计算时使用25 mm的摇动直径。
rpm: 摇速
RCF：离心力（表2）
throw：摇动直径（厂家提供）
图2 rpm与RCF的转换
5. 按照以下方法，每3-4天进行全换液：
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a. 倾斜培养皿 b.用5毫升的移液管，用最慢速度去除培养基。 c. 每孔加入3 mL新鲜的成熟培养基。 d. 重新将培养皿置于37℃培养箱中的定轨摇床上。 |
Day 40+ 第40+天
第40天，类器官具有暗相衬结构，且该结构周围可能是更薄更透明的、显示分层的区域（见流程示意图的图片）。在第40天获得拥有致密核的类器官的成功率为50-60％；细胞系不同成功率也不同。异质形态显而易见。
6. 通过冷冻/免疫标记法和/或RT-qPCR法检测类器官。以下是免疫标记的标记蛋白：
• 心室分区标记物: PAX6, SOX2
• 中间祖细胞标记物: ASCL1, TBR2
• 皮质板/前板/神经元标记物: TUJ1, DCX, MAP2, TBR1, CTIP2
7. 可以使用STEMdiff™脑类器官成熟试剂盒对脑类器官进行40天以上甚至更长时间的培养。
注：如果准备一瓶(225 mL)的成熟培养基，加入4.5 mL的添加物E之前，先吸去29.5mL的 STEMdif™脑类器官基础培养基。
主要试剂
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货号 |
名称 |
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STEMdiff™脑类器官试剂盒(08570) |
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08572 |
STEMdiff™ 脑类器官基础培养基 1 |
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08573 |
STEMdiff™ 脑类器官基础培养基 2 |
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08574 |
STEMdiff™ 脑类器官添加物 A* |
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08575 |
STEMdiff™ 脑类器官添加物 B* |
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08576 |
STEMdiff™ 脑类器官添加物 C** |
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08577 |
STEMdiff™ 脑类器官添加物 D* |
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08578 |
STEMdiff™ 脑类器官添加物 E* |
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STEMdiff™脑类器官成熟试剂盒(08571) |
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08573 |
STEMdiff™ 脑类器官基础培养基 2 |
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08578 |
STEMdiff™ 脑类器官添加物 E* |
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Fisher Scientific 14-222-730 |
200 µL 宽口径枪头 |
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38045 |
100 mm培养皿 |
STEMdiff™脑类器官培养常见问题及解决办法
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阶段 |
问题 |
可能的原因 |
解决办法 |
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EB形成阶段（0-5天） |
许多小的EB而没有形成大的中心EB |
起始hPSC质量不高 |
通过观察形态学和标记多能标记物OCT 3/4和TRA-1-60来检查多能性，以确保hPSCs具有高质量。如果OCT 3/4和TRA-1-60表达低（<90%），重新开始使用高质量的hPSC |
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来源于传代早期的高质量的hPSC |
|||
|
不超过70-80%的融合率时传代细胞细胞 |
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96孔板在培养时被扰动 |
至少在接种后24小时确保96孔板不被扰动 |
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EB显著增长，但是没有明亮边缘 |
起始hPSC质量不高 |
通过观察形态学和标记多能标记物OCT 3/4和TRA-1-60来检查多能性，以确保hPSCs具有高质量。如果OCT 3/4和TRA-1-60表达低（<90%），重新开始使用高质量的hPSC |
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来源于传代早期的高质量的hPSC |
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不超过70-80%的融合率时传代细胞细胞 |
|||
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诱导阶段（5-7天） |
EB呈现大的球形生长物 |
起始hPSC质量不高 |
不要再继续实验，重新选用高质量的hPSC |
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转移太多的EB形成培养基 |
在转移EBS时，只转移少量的EB形成培养基(10-20μL/500μL) |
||
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培养孔产生大量细胞碎片 |
转移太多的EB形成培养基 |
在转移EBS时，只转移少量的EB形成培养基(10-20μL/500μL) |
|
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扩增阶段（7-10天） |
没有扩增也没有表面积的增加，而是表面起泡 |
Matrigel批次欠佳 |
改用不同批次的Matrigel |
|
Matrigel嵌入时机不当 |
细胞系不同，神经上皮出现所需的时间可能不同。如果次最佳继续扩增，持续诱导阶段超过7天（直至第10-11天） |
||
|
起始hPSC质量不高 |
不要再继续实验，重新选用高质量的hPSC |
4. 脑类器官的冷冻切片和荧光染色
脑类器官为中枢神经系统的研究提供了一种模拟人体生理环境的模型。这类三维（3D）体外培养的类器官能够帮助研究正常和疾病状态下人脑的发育过程，在诸如自闭症，精神分裂症或因病毒感染导致的脑缺陷研究中具有重要的应用。
使用人多能干细胞（hPSCs）建立脑类器官的主要优势在于重现发育中人脑的3D结构。脑类器官中的中枢神经组织形成分层结构和伪脑室，与在生物体内观察到的大脑结构相似。为了分析研究这种特殊的细胞结构，需要专业的组织学方法。
在处理具有复杂结构的大型三维组织（如脑类器官）时，有着许多技术上的技巧。除了实验上的小心操作，这些类器官还需要足够的透膜（penetration），固定（fixation），抗冻保护（cryoprotection）来保持其组织形态。这些实验流程可能会影响蛋白表面的抗原结构，使得抗体无法识别抗原表位，继而影响实验结果。
实验过程
培养脑类器官
本操作流程使用STEMdiffTM脑类器官试剂盒（产品号 #08570）培养脑类器官。
固定
1. 使用1 mL（p1000）移液枪头，将类器官转移到50 mL离心管中。
注：可以剪掉枪头尖，以免损伤类器官。
2. 吸出培养基。D-PBS清洗三次，每次10分钟。移除D-PBS。
3. 加入4% PFA溶液。在2-8℃过夜孵育(16小时)。
注：为了正确以及彻底地固定样本。我们推荐使用新鲜配制的4% PFA溶液。
4. 吸出PFA。PBS-T清洗类器官三次，每次10分钟。
5. 将类器官保存在2-8℃ PBS-T中（最长可保存一周）。
抗冻保护（Cryoprotection）
将类器官孵育在30%蔗糖溶液中，防止在冻存不善带来的冰晶破坏蛋白结构所形成的伪影。
6. 吸出PBS-T，加入5 mL 30%蔗糖溶液。
7. 2 - 8℃孵育过夜。
注：类器官的孵育时间可以根据样本的大小和密度做出调整。当类器官不再浮于溶液中，则可以停止孵育并进行下一步实验。
包埋（Embedding）
8. 水浴中将明胶溶液温热至37℃。
9. 移除离心管中的蔗糖溶液，加入明胶溶液至完全浸没类器官。
10. 37℃孵育1个小时。使明胶可以渗透 Corning® Matrigel® droplet并完全覆盖类器官。
11. 取出类器官，转移到包埋模具中。
注：明胶在室温下会开始聚合并硬化；必须快速将类器官转移到包埋模具中。
速冻（Snap freezing）
速冻有助于防止类器官中冰晶的形成，并有助于维持样本的天然细胞结构。
12. 将干冰加入100%乙醇中制备干冰/乙醇浆液。
13. 混合液停止沸腾后，加入包埋的样本。
14. 将样本置于冷冻浆液中直至完全冷冻，然后将样本转移至-80℃冰箱长期保存。
冷冻切片
15. 从-80℃冰箱中取出冻块，在低温恒温箱中加热30分钟至切片所需温度。
注：明胶包埋类器官的最佳切片温度为-26℃至-30℃。
16. 切片厚度可以根据后期选择的成像系统（imaging system）调整。常用的厚度为10-20 μm。
注：多个连续切片能在不同区域观察不同的标志物。
17. 从冰箱中取出切片载玻片，并使其在室温下干燥。
18. 用PAP笔勾勒出切片轮廓。笔蜡完全干燥后，进行下一步。
19. 如有必要，可进行抗原恢复，或直接进行步骤20。
（可选）抗原修复
PFA固定所形成的共价交联（Cross-linkages）可能会干扰或占据抗原表位 (reviewed by Shi et al. 1997)4。因此，在一抗结合前，有些样本需要额外的抗原修复。
封闭
20. PBS-T清洗载玻片10分钟，清除明胶。
21. 将载玻片平放，并滴上足够的封闭缓冲液。笔蜡的轮廓会将封闭缓冲液保持在组织切片上。
22. 室温下于加湿箱中孵育1小时。
一抗
23. 制备一抗稀释液。推荐的稀释比例参照表2。
24. 倒掉封闭缓冲液，替换为一抗稀释液。
25. 室温下于加湿箱中过夜孵育（16小时）。
二抗
26. 在PBS-T中准备二抗稀释液。推荐的稀释比例参照表3。
注：Alexa Fluor®抗体非常稳定，但也应注意不要将抗体长时间暴露在直射光下。
27. 倒掉一抗稀释液，将载玻片放入切片盒中，PBS-T清洗载玻片三次。
28. 将载玻片平放，并滴上足够的二抗稀释液，室温下于加湿箱中孵育2小时。
盖玻片
30. 倒掉二抗稀释液，将载玻片放入切片盒中。
31. PBS清洗载玻片三次，每次30分钟。
32. 晾干5分钟。
33. 在载玻片上滴上PermaFluorTM，盖上盖玻片。在镜下观察前保存在2-8℃中。
预期结果
下图是使用上述操作流程处理的第40天脑类器官切片的荧光图像，切片厚度为16 μm，放大倍数为20倍。
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图1. 对类器官组织进行免疫荧光染色，CTIP2（绿色），PAX6（品红色），III类β-微管蛋白/ TUJ1（蓝色）和DAPI（灰色）。伪脑室（pseudo-ventricle，虚线部分）周围放射状分布PAX6+神经祖细胞，此为皮层区，这些神经祖细胞可进一步分化为皮质板神经元（表达CTIP2和TUJ1）。比例尺= 500 μm。 |
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图2. 对类器官组织进行免疫荧光染色，TBR2（中间前体，绿色）和磷酸化vimentin（PVIM，分裂中的细胞，品红色）。细胞在伪脑室（pseudo-ventricle，虚线部分）周围的皮质区边界处活跃分裂，一部分分裂细胞表达TBR2，并向祖细胞区向中央（箭头）迁移以形成中间祖细胞（intermediate progenitors）。比例尺= 100 μm。 |
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图3. 对类器官组织进行免疫荧光染色，CTIP2（绿色），TBR1（5/6 皮层神经元，品红色）和DAPI（白色）。假定祖细胞区域（presumptive progenitor zones）（白色）内部中心处的细胞以及类器官外表面的细胞表达深层神经元标志物（CTIP2和TBR1）。比例尺= 100 μm。 |
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图4. 对类器官组织进行免疫荧光染色，FOXG1（前脑细胞，绿色）或SOX2（神经祖细胞，品红色）。由STEMdiffTM脑类器官试剂盒所培养脑类器官能够生成前脑型组织（forebrain-type tissue，表达FOXG1）。SOX2+神经祖细胞在假性脑室区域（虚线）周围呈放射状排列。比例尺= 100 μm。 |
讨论
中枢神经系统结构复杂，需要灵敏的组织学技术，才能在显微镜观察下真实重现这种结构。本操作流程帮助使用者在对组织结构损坏最小的情况下，对三维培养的类器官进行冰冻切片。三维脑类器官切片在显微镜下的照片可以呈现出在二维（2D）图像下无法观察到的表型结构。例如，使用常规二维培养无法观察皮质分层中的缺陷。
从干细胞分化培养神经类器官的技术已成为科学家研究人类神经组织及其结构的重要手段，这些技术使科学家能够对神经系统功能性的研究提出新的问题和假设。皮质分层缺陷与精神疾病如精神分裂症有关。另外，在Rett Syndrome的小鼠模型中，V层神经元中的树突棘密度受到很大影响。从患者处取得的细胞样本，衍生为相应的类器官并对其进行研究的手段，可以更快更有效地为患者设计治疗方案，应用于临床研究。
另外，如果要观察组织样本特别是类器官内部3D构建和基因表达的时空分布和相互调节关系，还可以借助组织透明技术和荧光染色技术，保证给予您意向不要的3D分布图，无需担心组织切片的三维重构而丢失关键信息。
5. 从人ESCs/iPSCs诱导脑类器官
对于类器官培养基的是否要标准化，目前尚未达成共识。Lancaster指出：“Sometimes standardization is important, but it can also be constraining on what you can learn if you can’t play around with your culture conditions - 有时标准化很重要，但如果不能对培养条件进行调整，也会在某种程度上限制研究。”实际上，Lancaster和Knoblich的脑类器官的发现是出乎意料的，并且不会在一个限制性很强的环境下发生。标准化的完全培养基不利于研究人员调整，可能限制研究的发展。
过去，中枢神经系统（CNS）药物研究主要依赖于啮齿动物模型或细胞体外模型等传统方法。由于人类和啮齿类动物间的物种差异，所获得的数据难以真实地模拟神经发育和疾病机制等。随着干细胞技术的发展，培养人大脑类器官成为目前神经科学研究领域炙手可热的研究项目。大脑类器官是模拟人脑的生理特性的独特而绝佳的工具，可用于研究正常脑与疾病脑的建模，用于阐明中枢神经系统疾病的发病机制，亦可用于神经发育疾病的探索，或用作中枢神经系统药物筛选的工具。
01 脑类器官培养方法概述
脑类器官通常从人多能性干细胞(ESCs/iPSCs)开始培养，自发形成脑发育早期所具备的结构和层次。但脑细胞团簇达到一定尺寸后，可发育的阶段会受到营养缺乏和氧供应的限制，继而神经元开始死亡，结构停止发育。
目前，大脑类器官的培养主要分为两种方法，引导分化法 (Guided)和非引导 (Un-guided)分化法。
在类器官结构中，多能性干细胞(ESCs/iPSCs)诱导为拟胚体 (Embryoid Body, EB)，在外胚层形成后，引导分化为神经或非神经方向。引导分化法获得的类器官依赖分化过程中添加的生长因子，大多数是脑区特异性的，如皮层、海马、中脑、大脑等。引导分化法得到的类器官含有神经祖细胞、神经元、星形胶质细胞及其他的大脑细胞。由于是引导性分化，批次间的可变因素少，可以产生对应比例的特异性细胞类型。很多团队都在尝试用不同的方法来培养类器官，分别培养脑区特异的类器官后再将其共培养，类器官会自我融合形成含有不同脑区的类器官，该模型可以用于研究脑区间的相互作用。
02 3D大脑类器官的制作方法
2013年，Lacaster和Knoblich等发表在Nature及Nature protocol上的3D大脑类器官的制作方法使得体外用人多能干细胞 (包括胚胎干细胞及诱导多能干细胞)诱导3D大脑类器官的技术前进了一大步，他们通过使用一种允许类器官获取能量和氧气的新方法克服了这一局限，使用 一个微小的振动刀片将类器官切成半毫米切片，然后将它们放在覆盖富含营养的液体的多孔膜上。然后，类器官可同时从上方吸收氧气，从下方吸收营养物质，使其在培养物中继续发育一年。图1是该方法的概括。
03 文献分享
以下介绍了2014年，Lancaster发表在Nature Protocol上的“Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells”一文中从人多能性干细胞(iPSCs/ESCs)诱导脑类器官的方法：
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诱导EB形成 1-2h |
1. 当ESCs/iPSCs在六孔板中长到融合度为70-80%时用于诱导EB，通常每个六孔板孔的细胞可用于诱导一整个96孔板。 注：干细胞克隆的形态对于大脑组织形成的成功与否非常关键。克隆需呈现多能性的特征 (如边缘清晰，克隆紧密等)，且无分化倾向； 对于无饲养层培养的ESCs/iPSCs：① 用1ml的无钙镁的D-PBS洗涤细胞后，向每孔中加入600μl的含0.5mM的EDTA的无钙镁的D-PBS溶液。培养箱孵育4min； ② 轻柔吸出EDTA溶液，注意不要破坏克隆，加入1ml的Accutase。放回培养箱孵育4min； ③ 用1ml的mTeSR1培养基吹散克隆，使其从培养皿底部脱落。转移2ml至15ml离心管中，用1ml移液器将克隆吹散为浑浊的单细胞悬液； ④ 270g 室温离心细胞5min，同时用台盼蓝检测死细胞，用血细胞仪或自动细胞计数仪细胞计数；检测两次取平均值； ⑤ 用1ml的含50μM的ROCK抑制剂Y-27632的低bFGF的ESCs培养基重悬细胞，吹打，保证细胞呈单细胞重悬的状态。然后，用含Y-7632的低FGF-2的培养基重悬细胞，使细胞浓度为每150μl含9000个活细胞； ⑥ 每个96孔板孔中放入150μl的细胞悬液，置于培养箱继续培养； |
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饲养EB,早期胚层分化 5-7d |
2. 24h后，显微镜下观察,可见有清晰边缘的小的EB形成,边缘有许多死细胞围绕在EB周围,为正常现象，不会干扰EB在中间形成,继续置于37℃的5%二氧化碳的培养箱中培养； 3. 隔天轻柔地吸去半量培养基,避免干扰到EB和底部的细胞,补充150μl的新鲜培养基(总体积会大于150μl,量的准确与否不重),培养基中添加Y-27632(1:100),FGF-2浓度为4ng/ml,直到EB直径大于350-450μm为止,通常,仅前4天需要添加二者； 4. EB直径达到350-600μm时，用3中的培养基隔天饲养EB,培养基中不含Y-27632和FGF-2； |
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原始神经上皮的诱导 4-5d |
5. EB直径达到500-600μm时，边缘开始变得明亮，并且呈现光滑的边缘 (通常为第6天)，将每个EB用剪掉枪头的200μl移液器转移至含有500μl的神经诱导培养基的低吸附24孔板中，轻柔且不要破坏EB，继续培养； 注：将200μl移液器枪头剪掉，使开口直径约为1-1.5mm。确保开口不要太小，避免破坏EB，但也不能太大，太大会难以吸去EB。不要试图用刮刀将EB铲出，会破坏EB的结构； 6. 转移至24孔板后，另外加入500μl的神经诱导培养基饲养EB； 7. 2d后，组织培养显微镜观察EBs，形态边缘变得更加明亮，提示神经外胚层的分化；一旦这些区域开始显示与神经上皮形成一致的假复层上皮的放射状组织，这一般发生在神经诱导培养基中的4-5d后，继续进行第8步，将组织聚集转移到Matrigel液滴中； 注：健康的细胞聚集有光滑的边缘，神经上皮边缘在光学上呈半透明状。有时组织可能在光学上表现为非放射状组织的半透明组织，虽然这不是理想状态，但没有观察到这对类器官形成有长期的负面影响。重要的是，如果在神经诱导中再多放置1-2天，这些非放射区域就会变成放射状，但是如果不及时转移到基质凝胶(步骤8)，其他已经放射状的区域可能开始收缩并失去形成神经上皮芽的能力。当有神经外胚层出现时，需尽快将组织转移到Matrigel中，如果太晚，会影响脑组织的晚期形态； |
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将神经外胚层组织转移至Matrigel液滴中 1-2h |
8. 4℃下冰上解冻Matrigel。观察发现，500μl的Matrigel在冰水混合物浴时，1-2h后会恢复液体状态； 9. 将Parafilm膜置于一个空的带有凹坑的中号枪头盒上，将手指按向Parafilm膜形成凹坑，每个坑的体积约为200μl； 注：Parafilm不能高压灭菌，所以不能彻底灭菌，因此需保证Parafilm膜保存在干净的环境中，准备凹坑前，向手套和Parafilm膜喷洒70%乙醇消毒；在这一步也可以在培养基中添加抗生素以避免污染； 10. 将Parafilm膜用剪刀修剪为单个含4x4(共16个)凹坑大小的正方形，将其放入60mm的组织培养皿中； 11. 用200μl的移液器转移神经外胚层组织，每个凹坑中放置1个； 注：将200μl移液器枪头剪掉，使开口直径约为1.5-2mm。确保开口不要太小，避免破坏EB，但也不能太大，太大会难以吸去EB。不要试图用刮刀将EB铲出，会破坏EB的结构； 12. 用未剪头部的200μl移液器小心地吸去组织边缘多余的培养基； 13. 每个组织快速滴入Matrigel，每孔约30μl，使Matrigel滴入Parafilm凹坑中； 注：快速滴入Matrigel，避免组织干掉。尽量一次性滴入Matrigel，一次性包埋好16个组织； 14. 用10μl的移液枪头移动组织，使组织位于液滴的中央，这一步需要在滴入Matrigel后立即进行，因为室温下Matrigel非常容易固化； 15. 将此60mm培养皿置入37℃培养箱中，孵育20-30min以使Matrigel聚合； 16. 取出60mm培养皿，加入5ml不含Vitamin A的脑类器官分化培养基； 17.将Parafilm膜反过来并摇动培养皿，直至Matrigel液滴从凹坑中滴入培养基中；不容易脱落的液滴可以用镊子用力晃动Parafilm膜使其脱落，将培养皿置于培养箱中继续培养组织。 |
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神经上皮芽的固定培养 4d |
18. 24h后，观察包埋的组织，1-3d内，组织会呈现包含液体空腔的进一步扩张的神经上皮样； 注：从Matrigel主体中会迁移出一些细胞类型，通常呈成纤维细胞样，这些细胞代表了非神经特性的群体，从神经诱导时逃脱出来；然而这些细胞通常不能生存，且迁移出来后，对神经上皮芽的形成呈现促进作用； 19. 将液滴继续培养24h，然后将培养基更换为不含Vitamin A的脑类器官分化培养基，继续培养48h； 注：换液时，倾斜培养皿使液滴下沉，轻柔吸出培养液。尽量在不破坏类器官的情况下，吸出更多的培养液。更换为5ml的新鲜培养液； |
|
脑组织的生长 ~1年 |
20. 4h的静止培养后，用开口约为3mm的剪去头部的1ml移液枪头将包埋好的类器官转移至125ml的震动反应器中，加入75~100ml的含Vitamin A的脑类器官分化培养液，将此生物反应器放置在培养箱中安装的磁搅拌板或轨道振动筛上用85rpm的速度震动。也可以将60mm的培养皿中培养液更换为含Vitamin A的脑类器官培养液，将其置于轨道振动筛上培养； 注：每个生物反应器中不要转移超过2个60mm培养皿的类器官(32个)，太多类器官会引起类器官的融合； 使用低速搅拌搅拌板，因为常规速度的搅拌棒会因磁力搅拌而引起发热； 轨道振动筛可用于分析多种培养条件，同时使用多种基因突变剂处理，而传统的搅拌板只能同时防止4-6个单独的瓶；用生物反应器和轨道振动筛培养的脑类器官未观测到有区别； 21. 振动筛上的类器官每3-4天全量换液，摇瓶上的类器官每周换液，注意观察形态；在合适的时间点取样本用于实验研究； |
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Lancaster protocol中用到的试剂 |
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| iPSC培养基（500 mL） |
DMEM-F12( 400 mL ) KOSR( 100 mL) ES-quality FBS(15 mL ) Glutamax(5 mL ) MEM-NEAA( 5 mL) 2-Mercaptoethanol(3.5 μL) bFGF (20 ng/mL) (有滋养层培养低) 对于低 bFGF (4 ng/mL）使用前加入 |
| 神经诱导培养基 |
DMEM-F12 N2添加物 (1%) Glutamax添加物(1% ) MEM-NEAA (1% ) Heparin (终浓度1 μg/mL) |
| 脑类器官分化培养基（约250 mL） |
DMEM-F12(125 mL) Neurobasal(125 mL) N2 添加物（1.25 mL） Insulin( 62.5 μL) Glutamax添加物（ 2.5 mL） MEM-NEAA (1.25 mL) penicillin-streptomycin( 2.5 mL) DMEM/F12以1:100 稀释的 2-Mercaptoethanol(87.5 μL) B27添加物不含 vitamin A（ 2.5 mL） |
| 脑类器官成熟培养基 |
DMEM-F12(125 mL) Neurobasal(125 mL) N2 添加物（1.25 mL） Insulin( 62.5 μL) Glutamax添加物（ 2.5 mL） MEM-NEAA (1.25 mL) penicillin-streptomycin( 2.5 mL) DMEM/F12以1:100 稀释的 2-Mercaptoethanol(87.5 μL) B27添加物含 vitamin A（ 2.5 mL） |
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脑类器官形成所需细胞因子 |
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Human Insulin |
10-365 |
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Retinoic Acid |
3027949 |
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L-Ascorbic Acid |
5088177 |
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Y-27632 |
1293823 |
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hESC培养基 |
hESC-500 |
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Vitronectin Matri试剂盒 |
AF-VMB-220 |
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cAMP |
6099240 |
6. 流式细胞仪对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠的脑和脊髓组织浸润细胞进行免疫分型
分离患有实验性自身免疫性脑脊髓炎的小鼠的脑和脊髓样品，并分析免疫细胞的存在。
表面染色
下面给出的体积是针对多达106个有核细胞的。当使用少于106个单元时，请按照指示使用相同的体积。当使用更高的细胞数量时，相应地按比例增加所有试剂的体积和总体积（例如，对于2×106有核细胞，请使用所有指示试剂体积和总体积的两倍体积）。
1.确定细胞数。
2.将细胞以300×g离心10分钟。上清液被完全吸出。
3.根据相应抗体数据表中提到的稀释度，制备具有所有抗体的预混液。
4.将100 µl抗体预混液添加到细胞中。
5.将细胞重悬，并在黑暗中于4°C孵育10分钟。
6.通过加入1mL PEB缓冲液洗涤细胞，并在4℃以300×g离心10分钟。上清液被完全吸出。
7.将细胞重悬于100 µL PEB缓冲液中，并在立即使用MACSQuant®Analyzer进行流式细胞术分析之前添加1 µL碘化丙啶。
流式分析图
门控策略显示了对EAE小鼠的大脑和脊髓组织的免疫细胞亚群的分析。 使用多组织解离试剂盒从EAE小鼠中分离出大脑（AF）和脊髓组织（GL）后鉴定免疫细胞亚群的代表性流式细胞仪数据。 根据散射信号和碘化丙啶荧光，碎片，死细胞和双峰被排除在分析之外（数据未显示）。 单核细胞/巨噬细胞，小胶质细胞（A，G），嗜中性粒细胞（B，H），CD4 + T细胞（C，I），CD8 + T细胞（D，J），NK细胞（E，K）和B细胞的不同子集 （F，L）基于表面蛋白表达被枚举。
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Antibody panel 1
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Specificity |
Clone |
Purpose |
Fluorochrome |
货号 |
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CD45 |
30-F11 |
Leukocytes |
eFluor 506 |
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CD11b |
M1/70 |
Monocytes |
APC |
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Ly6-G |
1A8-Ly6g |
Neutrophils |
PE |
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Propidium Iodide Solution |
- |
Viability |
- |
Antibody panel 2
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Specificity |
Clone |
Purpose |
Fluorochrome |
货号 |
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CD3 |
145-2C11 |
T cells |
eFluor 450 |
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CD4 |
RM4-5 |
T helper cells |
APC |
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CD8a |
53-6.7 |
Cytotoxic T cells |
PE |
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Propidium Iodide Solution |
- |
Viability |
- |
Antibody panel 3
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Specificity |
Clone |
Purpose |
Fluorochrome |
货号 |
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CD3 |
145-2C11 |
T cells |
eFluor 450 |
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CD19 |
eBio1D3 (1D3) |
B cells |
APC |
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CD45R (B220) |
RA3-6B2 |
B cells |
FITC |
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NK1.1 |
PK136 |
NK cells |
PE |
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Propidium Iodide Solution |
- |
Viability |
- |