文章目录
人呼吸道上皮细胞
人呼吸道上皮细胞
1. 呼吸道上皮细胞ALI（气液交界面）培养操作流程
1.0试剂和材料
|
货号 |
名称 |
|
05040 |
PneumaCult™-Ex plus 培养基 |
|
38023 |
Costar® 12 mm Transwell®, 0.4 μm 聚酯膜 Inserts* |
|
38024 |
Costar® 6.5 mm Transwell®, 0.4 μm 聚酯膜 Inserts** |
|
Animal Component-Free 细胞解离试剂盒 |
|
2.0 人呼吸道上皮细胞培养原理图
3.0 制备培养基
使用无菌技术进行以下操作。
3.1 制备完全的PneumaCult™-Ex Plus 培养基
3.1 制备500 mL完全的PneumaCult™-Ex Plus 培养基(基础培养基+50X添加物+氢化可的松母液)。
1. 室温(15-25℃)解冻PneumaCult™-Ex Plus 50X 添加物，倒置小瓶轻轻混匀，不要涡旋。
注：解冻后可观察到沉淀。如果添加物能被轻轻混匀，这不会影响性能。一旦解冻，立即使用或进行分装并-20℃下储存。不要超过添加物的有效期。解冻分装后的添加物应立即使用。不要反复冻融。
2. 将10 mL PneumaCult™-Ex Plus 50X 添加物和0.5 mL氢化可的松母液加入到490 mL PneumaCult™-Ex Plus 基础培养基中制备完全培养基。
注：如不立即使用，完全的PneumaCult™-Ex Plus 培养基储存于2-8℃，4周内用完。不要超过各组份的有效期。
注：完全的培养基不含抗生素。如果需要，可自行添加。
3.2 制备完全的PneumaCult™-ALI基础培养基
制备完全的PneumaCult™-ALI基础培养基(PneumaCult™-ALI 10X添加物+PneumaCult™-ALI基础培养基)。完全的PneumaCult™-ALI基础培养基用于制备维持培养基（3.3节）。
1. 2-8℃解冻PneumaCult™-ALI 10X 添加物 ，倒置小瓶轻轻混匀，不要涡旋。
注：一旦解冻，立即使用或进行分装并于-20℃下储存。不要超过添加物的有效期。解冻分装后的添加物应立即使用。不要反复冻融。
2. 将50 mL PneumaCult™-ALI 10X 添加物加入到450 mL PneumaCult™-ALI 基础培养基中，完全混匀。
注：如不立即使用，完全的PneumaCult™-ALI基础培养基储存于2-8℃，2周内用完。或者分装后-20℃保存。不要超过各组份的有效期。解冻分装后的培养基应立即使用。不要反复冻融。
3.3 制备PneumaCult™-ALI维持培养基
注：只准备“分化阶段”所需的PneumaCult™-ALI维持培养基体积。
制备10 mL PneumaCult™-ALI 维持培养基(PneumaCult™-ALI完全基础培养基+PneumaCult™-ALI维持添加物+肝纳素+氢化可的松母液)。
1. 室温（15-25℃）解冻PneumaCult™-ALI 维持添加物 。
注：一旦解冻，立即使用或进行分装并于-20℃下储存。不要超过添加物的有效期。解冻分装后的添加物应立即使用。不要反复冻融。
2. 混合下列成份：
- 9.83 mL PneumaCult™-ALI完全基础培养基
- 100 µL PneumaCult™-ALI 维持添加物·
- 20 µL 肝纳素
- 50 µL氢化可的松母液
注：如不立即使用，完全的PneumaCult™-ALI维持培养基储存于2-8℃，2周内用完。
4.0 试验步骤
4.1扩增阶段
下面的方案用于将T-25 cm2培养瓶中扩增的上皮细胞接种在单独的一个insert（12孔板和24孔板）中。如果使用其他培养皿，则相应地调整。整个流程，PneumaCult™-Ex 培养基可替代 PneumaCult™-Ex Plus 培养基。
1. 在5 mL完全的PneumaCult™Ex Plus培养基中接种1.25 x 105 细胞 (0.5 x 104细胞/cm2) 。
注：如果起始细胞为冻存的细胞，直接在PneumaCult™-Ex Plus 完全培养基中复苏并在接种后24小时进行换液。
2. 在37°C下孵育细胞，每两天进行一次换液，直到细胞融合达到50-70%，这时准备传代。 这个过程一般需要3-5天。
注： 一些供体细胞群的扩增阶段可能需要更长的时间。遇上周末，可在星期五下午和星期一早上第一时间进行两次换液。
3. 应用下列流程进行细胞传代：
i. 预热足够体积的D-PBS(不含Ca2+和Mg2+)，完全的PneumaCult™Ex Plus培养基，无动物源成份（ACF）的细胞解离试剂盒到室温(15-25℃)。
ii. 用5 mL D-PBS(不含Ca2+和Mg2+)清洗细胞。
iii. 加入2mL ACF酶解离液，在37°C下孵育78分钟，直到细胞通过轻轻敲击培养瓶而被移除。
iv. 加入2 mL ACF酶抑制剂，将细胞收集在15 mL离心管中。
v. 350 x g离心5分钟。
vi. 弃上清，用1-2 mL完全的PneumaCult™Ex Plus培养基重悬细胞。
vii. 用台盼蓝和血球计数板进行细胞计数。
4. 在培养皿（基底室）的一个培养孔中加入PneumaCult™Ex Plus培养基：
- 12孔培养板: 1 mL 培养基
- 24孔培养板: 0.5 mL培养基
5. 在insert（顶室）接种1 x 105 细胞/cm2：
- 12 mm Transwell® insert (12孔板): 11 x 104 细胞/0.5 mL PneumaCult™-Ex Plus培养基
- 6.5 mm Transwell® insert (24孔板): 3.3 x 104 细胞/ 0.2 mL PneumaCult™-Ex Plus培养基
6. 37°C孵育。每2天使用新鲜的PneumaCult™-Ex Plus 培养基对基底室和顶室进行全换液，直到细胞完全融合。这个阶段大约需要2 4天。
注：一些供体的细胞群，扩增阶段可能需要更长的时间。当融合率<50%(PneumaCult™-Ex Plus 培养基)或<80%(PneumaCult™-Ex培养基)时，不推荐进行接下来的过渡培养。
4.2 分化阶段 (在INSERTS中进行ALI培养)
1. 从基底室和顶室轻轻吸出培养基。仅在基底室中加入PneumaCult™-ALI 维持培养基，如下所示：
- 12孔板: 1 mL 培养基
- 24孔板: 0.5 mL 培养基
2. 37°C孵育。每2天使用新鲜的PneumaCult™-ALI 维持培养基对基底室进行一次全换液，使顶室暴露在空气中。
注：遇到周末，可在周五下午和周一一早进行换液。
3. 从第二周开始气升培养后，室温下(1525°C)，通过用D-PBS(不含Ca2+和Mg2+)洗涤细胞一次，从顶室表面去除多余的粘液。如下所示：
- 12孔板: 0.5 mL D-PBS
- 24孔板: 0.2 mL D-PBS
4. 这一过程应按要求进行重复（大约每周一次），以防止过多的粘液积聚。
注：去除液体时要小心，以免损伤底层细胞。
2. 人体呼吸道体外建模
呼吸道研究建模
|
体内（动物模型） |
体外（细胞培养） |
||||
|
小鼠/大鼠 |
猪/绵羊/猴子 |
细胞株 |
hPSC分化 |
原代上皮细胞 |
|
|
时间 |
短/中 |
长 |
短 |
短/中/长 |
短 |
|
成本 |
中 |
高 |
低 |
中 |
低/中 |
|
取材 |
中 |
难 |
易 |
中 |
易 |
|
生理相关性 |
低/中 |
高 |
低 |
中 |
高 |
呼吸道体外建模
虽然呼吸道各主要部位均可以建模，但是肺泡细胞的体外培养由于组织结构的复杂程度及难获得性目前尚未有成熟的培养方法。临床和基础科学应用将主要精力集中在支气管上皮细胞，这可能是因为很多病症均是因为此部位的细胞遭到破坏，例如哮喘及囊性纤维病变（Cystic Fibrosis），并且研究人员能够很容易地通过鼻毛刷法或支气管镜获取此部位的原代细胞样本。呼吸道上皮细胞的体外培养对离体研究呼吸道的生理功能， 呼吸道疾病的致病机制以及诊疗都具有重要意义。
为建立模拟人体呼吸道模型，研究人员研发出专门的体外三维细胞培养 技术，而此三维结构集成了呼吸道的形态和功能特点。例如，近端呼吸道 的基底细胞，在三维特定培养条件下可以分化成假复层纤毛柱状上皮细 胞（其中包括纤毛细胞、杯状细胞和基底细胞）。在此种体外细胞培养的 条件下，细胞呈现出纤毛有节奏地摆动、分泌粘液、屏障性能以及重新建 模和修复性能，这些性能均与人体原生呼吸道上皮细胞相似。1,2目前比较成熟的体外呼吸道建模主要有两种技术：
最有代表性特色的培养技术是在组织培养嵌入物上进行三维（器官样） 气液界面培养。3-10 在此模型中，从支气管刷上获取人体的支气管上 皮细胞，或是从尸体供体组织上分离出上皮细胞，经传代扩增后接种到0.4μm Transwell培养皿中。诱导细胞分化的过程，首先需要让通透膜上培养的 细胞增殖直至其完全融合，之后移去增殖培养基，只在底层换上分化培养 基， 这样细胞表面暴露在空气中，底部接触分化培养基继续培养，直至 其完全分化，整个过程大约需要21 - 28天。当培养物的上部暴露在空气 中，底部在专门的细胞分化培养基中，可以诱发单层培养物分化成假复层 纤毛柱状上皮细胞（与原生人体呼吸道相似）。此模型系统适用于吸入毒 理学，药物筛选以及基础研究等一系列应用。11 和活体动物实验比较，使 用此类模型的好处是费用低廉、易于操作。气液界面培养的独特应用是可 以将悬浮微粒直接加入到顶端细胞表面，模拟大气中悬浮颗粒吸入，为烟 雾及大气污染物对呼吸道的危害及毒性研究提供了独一无二的平台。1,12,13
另一种技术是类器官培养，就是将分离出的呼吸道上皮细胞种在半固体 Matrigel®基质中培养成三维球状或分支形态。在此模型中，单个细胞可以 克隆增殖生长成为三维球状或分支形态，被称之为支气管或肺泡类器官 培养。14-16类器官培养可以不依赖Transwell™通透性培养皿， 所以可以 成为大规模高效筛选的极具吸引力的备选系统。
文献
1. Berube K, et al. Altern Lab Anim 37: 89-141, 2009
2. Berube K, et al. Toxicology 278: 311-318, 2010
3. Muller L, et al. J Vis Exp 80, 2013
4. Whitcutt MJ, et al. In Vitro Cell Dev Biol 24: 420-428, 1988
5. Neuberger T, et al. Methods Mol Biol 741: 39-54, 2011
6.Randell SH, et al. Methods Mol Biol 742: 285-310, 2011
7. Pezzulo AA, et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 300: L25-31, 2011
8. Lin H, et al. J Pharm Sci 96: 341-350, 2007
9. Lee MK, et al. Drug Deliv 12: 305-311, 2005
10. Dvorak A, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 44: 465-473, 2011
11. Wong AP, et al. Nat Biotechnol 30(9): 876-82, 2012
12. Kastner PE, et al. Toxicol In Vitro 27: 632-640, 2013
13. Mathis C, et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 304: L489- 503, 2013
14. Rock JR, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 12771-12775, 2009
15. Lee JH, et al. Cell 156: 440-455, 2014
16. Barkauskas CE, et al. J Clin Invest 123: 3025-3036, 2013
3. 气道上皮细胞及其干细胞和祖细胞
人体呼吸道上皮细胞
人类在呼吸过程中，吸入外界空气，空气中的氧气通过呼吸进入循环系统，同时体内细胞产生的二氧化碳通过肺泡和毛细血管的气体交换排到 外界空气中。呼吸道具有加温、湿润、过滤等保护功能。在换气前，呼吸 道会将吸入的空气变暖，变湿，然后温暖湿润的空气将会直达肺部的最 远端，同时可以保护肺部免受病原体及大气污染物的侵袭。人体呼吸道可 分为传导区和呼吸区。传导区包括鼻腔通道、气管、主支气管、肺内支气管 和细支气管，不参与换气流程。从气管到末端细支气管，随着呼吸道的不 断分支，各级分支的直径和长度逐步缩小/缩短。呼吸区包括呼吸性细支 气管、肺泡管和肺泡囊。呼吸区是指肺腔内吸入的空气与肺毛细血管中的 血液进行换气（经肺通气进入人肺泡的新鲜空气与血液进行气体交换，氧 气从肺泡顺着分压差扩散到静脉血，而静脉血中的二氧化碳，则向肺泡扩 散）的场所。1,2
从鼻腔通道到肺泡囊的整个人体呼吸道覆盖着一层连续的上皮细胞，但 是传导区和呼吸区的上皮细胞在形态和细胞成分上却各有不同。在包括 鼻腔通道、气管和支气管在内的传导区的最近端部位，呼吸道上皮细胞的 形态为假复层纤毛柱状上皮细胞。距离传导区越远（分支增多，呼吸道内 径缩小），此上皮细胞的厚度越薄，且在小呼吸道（细支气管）形成类似立 方上皮细胞。大呼吸道上皮细胞主要由三种细胞类型构成：可分泌粘液的 杯状细胞、可通过与顶部纤毛进行协同摆动而促进粘液运动的纤毛细胞， 以及在基底膜上排列且不与上皮细胞顶面接触的基底细胞。细支气管内 的立方上皮细胞由两种细胞类型构成：分泌细胞和纤毛细胞，但是其含有 的纤毛细胞数量要比近端大呼吸道所含数量要少。肺泡上皮细胞分为I型 肺泡上皮细胞和II型肺泡上皮细胞（AEC）。肺泡细胞通过毛细血管的内 皮细胞基膜，与内皮细胞融合，形成换气屏障。整个呼吸道内的细胞均为 各种低活跃度的细胞，包括大呼吸道内的神经内分泌细胞、分布在肺间质 内的肺泡巨噬细胞（吞噬细胞）（其主要作用是清除气腔内存在的和吸入 的空气中的尘粒、细菌等异物）。1,3
上皮细胞屏障和防御功能
呼吸道上皮细胞在协调空气进出肺泡的过程中，发挥着重要作用。呼吸道 上皮细胞可以阻挡和清除随空气进入呼吸道的颗粒、异物，使进入肺泡 的气体几乎清洁无菌，这一防御作用至关重要。其主要的防御手段是综合 利用分泌细胞和纤毛细胞的功能，因为分泌细胞会分泌出粘液，覆盖在纤 毛细胞的纤毛上，纤毛协调摆动，将粘液层与附着在粘液层上的随空气吸 入呼吸道的异物向咽喉方向移动，直至到达咽部，被吞咽或咳出。4,5其他 各种宿主防御机制也保证了呼吸道上皮细胞可以正常有效的发挥保护作 用。重要的是，上皮细胞层并非是独立发挥防御作用，而是与其他上皮细 胞、间充质细胞、内皮细胞和细胞外基质一起，作为共生的功能单元，协调 发挥作用。6,7,8
另外上皮细胞可以通过细胞间连接形成另一层防御屏障，有效的阻止病原 体或有毒物质进入体内。通过细胞间紧密连接，控制阻渗层，限制顶层腔 室和基底外侧腔室间分子的被动流动。细胞间紧密连接也是维持离子和 溶质体内平衡的重要因素，从而实现对呼吸道表面液体厚度和离子组成 控制，这是保护肺部的必要手段。9
尽管人上呼吸道存在这些有效的防御系统，但是呼吸道上皮细胞长期接 触外部空气，必然导致经常受损。呼吸道上皮细胞受损后，导致基底膜部 分或全部外露，仅有基底细胞群与基底膜相连。这些结构与功能的典型变 异是由肺部每天饱受各种自然颗粒物、人为颗粒物、纤维物质和化学品 等各种随空气吸入的物质的伤害而形成，由此导致患上慢性支气管炎、 哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD）或囊胞性纤维症（CF）等各种呼吸疾病。 一旦受损，呼吸道上皮细胞会自动进行修复，以期恢复细胞屏障的完整性 和正常的上皮细胞功能，但是这些修复机制尚未完全为人所知。1,5,10,11
呼吸道特定区域的干细胞与祖细胞
呼吸道上皮细胞一直进行着缓慢而持续的动态代谢平衡。当发生中轻度 损伤，呼吸道上皮细胞会及时做出反应，重建上皮细胞层，恢复其正常的 结构和功能。这个上皮细胞修复的过程主要由呼吸道干细胞和祖细胞来 完成。11-18
上皮祖细胞生物学领域内，描述不同祖细胞的术语有些复杂而没有统一 标准化。在本篇综述中，我们用“祖细胞”一词来概括地定义相对而言未分 化的，具有增殖和分化潜能的细胞，而干细胞属于祖细胞里的一种罕有细 胞，具有持续增殖、自我更新和多向分化潜能。相比之下，很多成年祖细胞 是短暂扩充细胞，可以广泛增殖成为终末分化细胞，但是与干细胞相比， 其寿命周期有限。12,13,19
有证据表明：不同种类的上皮干细胞和祖细胞分布在肺部的位置不同：基 底细胞分布在气管和大支气管，20细支气管肺泡干细胞（BASC）分布在细 支气管肺泡管连接处（BADJ），21II型肺泡上皮细胞则分布在肺泡区。22
基底细胞
越来越多的证据表明：基底细胞为分布在气管支气管部位的多能祖细胞， 在出生后不同发育阶段和稳态周期内，既可进行自我更新，又可形成纤毛 细胞谱系和分泌细胞谱系，并且可以在上皮细胞受损后，进行修复。以上 认知是从体内遗传谱系示踪研究和体外培养（气液界面（ALI）培养和三 维球状形态（克隆形态）培养中总结出来的。在运用此类培养技术，可以 发挥单细胞自我更新和分化的潜能。20,23,24 这些方法均需用标志物对基底 细胞进行精准标示，但是这些标志物对基底细胞祖细胞的功能上的重要 性尚不明确。应用最广泛的基底细胞标志物有P63、IGTA6、NGFR、KRT5 和KRT14。19,20,23-27 所有这些标志物中，最为常用的是KRT5和KRT14。KRT5 可以在所有的基底细胞中进行标记，而只有当上皮细胞的代谢速率较低 时，通常采用 KRT14来标记出稳态子代基底细胞。23 这就说明：不同基底 细胞间存在功能异质性，只有少数基底细胞能够形成多个成熟细胞谱系。 根据KRT14-CreER追踪，对小鼠气管和支气管上皮细胞进行的谱系示踪 研究的结果表明：在呼吸道受损的情况下，基底细胞子代可转化为多能或 单能细胞。
对因强酸、洗涤剂或系统性萘摄入等各种介质摄入而使腔细胞受损，进 而进行修复的过程中，用KRT5和KRT14进行标记的双阳性基底细胞，无论 是单独存在或是以小集群形式存在的，均呈现出暂时性的数量增加。这一 结果表明：当基底细胞被“激活”进行增殖时，KRT14标志物的表达水平上 调。23,28 但是，还有研究结果认为所有的基底细胞均能进行多向分化，而且 基底细胞祖细胞的分化命运是受到局部环境和损伤机制的影响。20
与人体肺部的再生疗法实际相关的一个问题是：基底细胞是否是唯一能 有效修复假复层上皮细胞的细胞，或分化的细胞是否能在特定条件下返 回祖细胞/或转分化成其它分化细胞。在Rajagopal 实验室近期发表的一 篇主要论文中，采用了一种方法专门杀死小鼠体内气管中的KRT5+标志物 和基底细胞，29 在这种情况下，研究人员发现分化的 SCGB1A1+分泌细胞 可返回到祖细胞状态，转而成为P63和 KRT5标记的双阳性基底细胞。这 些基底细胞能够长期积蓄，与正常的KRT5+标记的祖细胞功能相似。通过 体外培养，论文作者进一步证明：基底细胞之间的细胞间连接可以阻止表 层分化细胞的去分化，但是还需对去分化的重新驱动程序的精准机制以 及随后产生的干细胞功能进行进一步研究。29
分泌细胞 (Club Cell)
与人体肺部的再生疗法实际相关的一个问题是：基底细胞是否是唯一能有效修复假复层上皮细胞的细胞，或分化的细胞是否能在特定条件下去分化或转分化。在Rajagopal 实验室近期发表的一篇主要论文中，采用了一种方法专门杀死小鼠体内气管中的KRT5+标志物和基底细胞，在这种情况下，研究人员发现分化的 SCGB1A1+分泌细胞可返回到祖细胞状态，转而成为P63和 KRT5标记的双阳性基底细胞。这些基底细胞能够长期积蓄，与正常的KRT5+标记的祖细胞功能相似。通过体外培养，论文作者进一步证明：基底细胞之间的细胞间连接可以阻止表层分化细胞的去分化，但是还需对去分化的重新驱动程序的精准机制以及随后产生的干细胞功能进行进一步研究。
细支气管肺泡干细胞（BASC）
最细小的末端细支气管与肺泡之间的过渡区被称之为细支气管肺泡管连 接处。小鼠体内的此部位包含纤毛细胞和分泌细胞，但是人体内的此部位 所分布的细胞，尚不明确。将小鼠体内细支气管肺泡管连接处的少量细 胞（每个气管有1-2个胞）共同标记为Scgb1a1（分泌细胞）和肺泡表面活 性蛋白C（Sftpc），肺泡表面活性蛋白C是II型肺泡上皮细胞特有的一种蛋 白。其结论为：此类双阳性细胞为细支气管肺泡干细胞。之所以被称之为 细支气管肺泡干细胞，是因为当被荧光活化细胞分选方法所分离时， 此类细胞会在培养皿中生成细支气管细胞和肺泡细胞。30 Kim及其同事 进一步通过采用精致的3D克隆共同培养方法，证明了肺内皮细胞中的 BMP4-NFATC1-TSP轴可以诱导细支气管肺泡干细胞分化成肺泡谱系。21
II型肺泡上皮细胞（AEC2）
气体交换部位的主要上皮细胞类型包括：立方II型肺泡上皮细胞（主要生 产和分泌表面活性蛋白）和扁平的I型肺泡上皮细胞（主要进行换气）。成 年小鼠的肺泡部位的细胞新陈代谢一般比较慢，因此很难追踪到稳态的 谱系关系。但是，在对肺泡细胞进行实验性损伤，或让其接受氧化应激作 用的情况下，存活的细胞将快速增殖，并激活细胞修复机制。
过去40年一直采用H3胸苷标记法进行的研究结果表明，当因组织内氧气 过多或一氧化碳过多导致上皮细胞受损后，成年猴和小鼠的II型肺泡上皮 细胞会进行增殖，并形成I型肺泡上皮细胞。近期，针对体内遗传谱系示踪 的研究肯定了成熟的II型肺泡上皮细胞有这种自我更新和分化能力。上述 体内遗传谱系示踪研究采用与终末分化细胞（包括肺泡表面活性蛋白C和 Lyz2）相关的基因驱动的Cre重组酶。在稳态的新陈代谢情况下，单个II型 肺泡上皮细胞很少发生克隆性增殖，亦很少分化为I型肺泡上皮细胞。当博莱霉素和氧气过多对肺泡部位造成损伤之后，标记为II型肺泡上皮细胞 的谱系分化为I型肺泡上皮细胞的比例明显增高。22,31-34
近年来，干细胞和祖细胞谱系的识别以及这些细胞在成人体内的活动的 相关研究发展很快。相对而言，分子水平的信号通道对细胞行为的调控方 面的研究发展缓慢。 普遍认为，个体发育过程中使用的主要分子信号通 路在肺部细胞修复过程中被激活而发挥着重要作用，但是这些观点需要 进一步在生理或临床相关实验模型上测试证明，。探索肺形成的机制，尤 其是肺泡形成领域的研究，方兴未艾。支气管上皮的气液界面培养系统， 和近几年流行起来的体外类器官培养（支气管类器官和肺泡类器官）系统 为解决这些呼吸领域的问题提供了最佳的技术支撑和研究平台。
文献
1.Berube K, et al. Altern Lab Anim 37: 89-141, 2009
2.Crystal RG, et al Proc Am Thorac Soc 5: 772-777, 200
3.Kaisani A, et al. Differentiation 87: 119-126, 2014
4.Randell SH. Proc Am Thorac Soc 3: 718-725, 2006
5.Livraghi A and Randell SH. Toxicol Pathol 35: 116-129, 2007
6.Rock JR, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 108: E1475-1483, 2011
7.Weaver M, et al. Dev Biol 258: 169-184, 2003
8.Knight DA, et al. Expert Rev Respir Med. 4(6): 747-58, 2010
9.Matsui H, et al. J Clin Invest 102: 1125-1131, 1998
10.Rawlins EL, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 410-417, 2007
11.Borok Z, et al. Proc Am Thorac Soc 8: 215-222, 2011
12.Hogan BL, et al. Cell Stem Cell 15: 123-138, 2014
13.Kotton DN and Morrisey EE. Nat Med 20: 822-832, 2014
14.Rock JR and Hogan BL. Annu Rev Cel Dev Biol 27: 493-512, 2011
15.Rock JR, et al. Dis Model Mech 3: 545-556, 2010
16.Stripp BR and Reynolds SD. Proc Am Thorac Soc 5: 328-333, 2008
17.Wansleeben C, et al. Dev Biol 2: 131-148, 2013
18.Hackett TL, et al. Stem Cells 26(10): 2576-85, 2008
19.Reynolds SD, et al. Proc Am Thorac Soc 9: 27-37, 2012
20.Rock JR, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 12771-12775, 2009
21.Lee JH, et al. Cell 156: 440-455, 2014
22.Barkauskas CE, et al. J Clin Invest 123: 3025-3036, 2013
23.Cole BB, et al. Am J Pathol 177: 362-376, 2010
24.Ghosh M, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 45: 459-469, 2011
25.Ghosh M, et al. Stem Cells 31: 2767-2778, 2013
26.Ahmad S, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 48: 94-104, 2013
27.Ghosh M, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 45: 403-410, 2011
28.Ghosh M, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 49: 1127-1134, 2013
29.Tata PR, et al. Nature 503: 218-223, 2013
30.Giangreco A, et al. Am J Pathol 161: 173-182, 2002
31.Desai TJ, et al. Nature 507: 190-194, 2014
32.Evans MJ, et al. Exp Mol Mathol 22: 142-150, 1975
33.Evans MJ, et al. Am J Pathol 70: 175-198, 1973
34.Kaplan HP, et al. Lab Invest 20: 94-100, 1969
4. 人气道上皮细胞培养检测技术与检测指标
对于人体呼吸道体外建模，ALI（气液交界面）是最佳选择。该培养方式独有的开放式培养条件，可以提供更多的科研信息。
细胞免疫荧光（IF）检测
采用ALI培养的气道上皮细胞，而通过细胞特异性表面标记进行ICC/IF检测。
使用纤毛细胞的标记（AC-Tubulin）、杯状粘液分泌细胞的标记物（Muc5AC）以及基底细胞标记物（CD271）标记细胞。
相关抗体
|
细胞类型 |
标记 |
抗体货号 |
|
纤毛细胞 |
AC-Tubulin |
|
|
杯状细胞 |
MUC5AC |
|
|
基底细胞 |
KRT5 |
|
|
KRT14 |
||
|
NGFR |
MA5-13314,MA5-13311,14-9400-82,MA1-20167,MA5-15574,PA5-81626,PA5-20162,MA1-18419,MA1-18418,MA1-18420 |
粘液分泌清除和纤毛摆动检测
跨膜电位（TEER，Trans Epithelial Electrical Resistance）
电生理测定（尤斯灌流室）
 |
 |
5. 建立呼吸道研究模型：气-液界面培养
人支气管上皮
人呼吸道的支气管上皮层分为假复层（pseudostratified），纤毛（ciliated） 以及柱状（columnar）上皮。该区域主要有三种细胞类型：纤毛细胞 （ciliated cells），分泌细胞（secretory cells）（主要是分泌粘液的杯状细 胞）和基底细胞（basal cells）1。 支气管上皮作为保护屏障，防御各种吸入性伤害，例如毒素，污染物和病 原体。
屏障功能的维持主要基于于上皮的三个关键特征：
1. 紧密连接蛋白（tight junction proteins）维持着上皮的完整性，并且 对于其作为物理屏障的功能至关重要。
2. 分泌细胞分泌的粘液会捕获颗粒物质和病原体，然后通过纤毛细胞 的协同将这些颗粒物质和病原体通运出气道2,3。
3. 粘液中含有抗菌肽（antimicrobial peptides）和炎症因子 （inflammatory mediators）等保护性介质，形成了对病原体和有毒 物质的化学和免疫屏障4。 呼吸道上皮的生理相关模型的需求正在日益增长，但其挑战仍在于如何 在体外重现体内组织的复杂结构和功能。
体外呼吸道上皮建模
多种细胞类型可用于人类呼吸系统的建模，包括永生化的呼吸细胞系（ 例如BEAS-2B细胞和16HBE14o-细胞）以及来自动物或人类供体的原代 细胞。尽管使用永生化细胞系和动物原代细胞很普遍，但使用这些模型 产生的数据并不直接适配于人类系统5。传统培养人原代支气管上皮细胞 的方法是将细胞浸没于培养基之下进行培养；但是，在该培养系统中的 细胞无法进行粘膜纤毛分化。为了重现在体内观察到的伪分层粘膜纤毛 表型（pseudostratified mucociliary phenotype），必须在气-液界面（AirLiquid Interface，ALI）上培养原代人支气管上皮细胞（primary human bronchial epithelial cells，HBEC）（图1）6。气-液界面培养的主要特征是细胞的基底表面与液体培养基接触，而其顶 端表面则暴露于空气中。常见的细胞接种方法是将细胞接种到细胞培养插 件（cell culture insert）的可渗透膜上。在细胞培养初期，顶端和基底的腔 室都需要添加培养基（图1A）。当细胞数量接近满板时，需要对细胞“airlift”，即吹干顶端腔室的培养基，并保留基底腔室的培养基（图1B）。该培 养系统模拟了人气道中的情况，诱导细胞向粘膜纤毛表型分化。
图1. 气-液界面培养的示意图 使用多孔细胞培养板进行培养的原代人支气管上皮细胞的浸没培养（A）以及气-液界面 培养（B）示意图。
气-液界面培养视频
气-液界面培养的生理相关性
原代HBEC的气-液培养近年来越来越被认为是与呼吸系统生理学高度 相关的重要培养系统5 。在气-液上培养的HBEC经历了高度的粘膜纤毛 分化，从而形成了代表体内气道的体外模型。H&E（hematoxylin and eosin）和PAS（periodic acid-Schiff）染色显示气-液界面培养物（图2A和 2C），如同体内支气管上皮一样（图2B和2D），表现出伪分层的形态，以及 异种细胞群的组成，包括纤毛和粘液分泌（PAS阳性）细胞。该模型的特征还在于体现出上皮的屏障功能，例如表达紧密连接蛋白和 高细胞跨膜电阻（high transepithelial electrical resistance）6。通过转录 组分析7与细胞对毒素、病原体等外源物质的生理反应实验，进一步证实 了气-液界面培养物对气道建模的高度适用性8-10。此外，对来自患有呼吸 系统疾病（例如哮喘，囊性纤维化，慢性阻塞性肺病）供体的原代细胞进 行气-液界面培养，可以重现体内疾病特征，从而建立可靠的体外研究模 型11,12。
图2. 气-液界面培养的人支气管上皮原代细胞重现了体内支气管上皮的结构 （A-B）H&E和PAS的染色显示，PneumaCult™-ALI培养的气-液界面处分化的细胞形成 了假复层上皮（A和C），表现出体内支气管上皮（B和D）的特点。（A）和（C）中的数据由 Samuel Wadsworth提供。
PneumaCult™-ALI的气-液界面培养
PneumaCult™-ALI（货号 #05001）是一种不含血清及牛垂体 提取物（BPE）的培养基，经过优化，可在气-液界面培养中重现 原代HBEC的粘液纤毛分化。欲了解更多信息，请访问 www.Novobiotec.com.
气-液界面培养的应用
气-液界面培养在呼吸系统研究中具有巨大的潜力，拥有广泛的实验用途。 其中诸多专业的实验，往往无法通过传统浸没培养模型进行。使用气道上 皮细胞的气-液界面培养物可以：
- 研究呼吸道上皮的细胞生物学 气-液界面培养物是体外研究呼吸道上皮的生理学相关度最高的 模型6。 • 建立呼吸系统疾病模型 使用气-液界面培养来培养患有慢性呼吸系统疾病（如哮喘，囊性纤 维化，慢性阻塞性肺病）的患者的气道上皮细胞，从而可以在体外研 究疾病的机制11,12。
- 研究呼吸道上皮的感染 一些呼吸道病毒只会有选择性地感染完全分化的气道上皮细胞13,14。
- 测试吸入式药物的有效性 气溶胶颗粒可以直接添加在半干的细胞顶端表面上，从而模拟粉末 在体内沉积到肺的表面15,16。
- 测试吸入物质的毒性 气-液界面分化的原代上皮细胞对于吸入成分（例如烟草烟雾成分之 类）的伤害反应与人体内气道的真实伤害反应极为相似17,18。
参考文献
1. Ehrhardt C, et al. Drug Absorption Studies II: 235-257, 2008
2. Fahy J V and Dickey BF. New Engl J Med 363(23): 2233-2247, 2010
3. Button B, et al. Science 337(6097): 937-941, 2012
4. Tam A, et al. Ther Adv Respir Dis 5(4): 255-273, 2011
5. Bérubé K, et al. Toxicology 278(3): 311-318, 2010
6. Prytherch Z, et al. Macromol Biosci 11(11): 1467-1477, 2011
7. Dvorak A, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 44(4): 465-473, 2011
8. Thaikoottathil J V, et al. Eur Respir J 33(4): 835-843, 2009
9. Krunkosky TM, et al. Microb Pathog 42(2-3): 98-103, 2007
10. Palermo LM, et al. J Virol 83(13): 6900-6908, 2009
11. Ostrowski LE, et al. Lung 190(5): 563-571, 2012
12. Comer D, et al. Eur Respir J doi: 10.1183/09031936.00063112
13. Matrosovich, MN et al. Proc Natl Acad Sci U S A 101(13): 4620-4, 2004
14. Hao W, et al. J Virol 86(24):13524-13532, 2012
15. Lin H, et al. J Pharm Sci 96(2): 341-350, 2007
16. Tralau T and Luch A. Trends Pharmacol Sci 33(7): 353-364, 2012
17. Andreoli C, et al. Toxicol in Vitro 17(5-6): 587-594, 2003
18. Balharry D, et al. Toxicology 244(1): 66-76, 2008