直径3mm大小的中脑类器官 (midbrain organoid)。( Singapore scientists grow mini human brains.)

      如何构建肿瘤微环境 (tumour microenvironment, TME)研究肿瘤异质性、癌症进展与后续转移、药物反应和耐药，一直是癌症研究中巨大的挑战。目前已有人源肿瘤组织来源移植瘤模型（patient-derived xenografts, PDX）和肿瘤类器官(Patients derived organoids，PDO) 两种有效的研究模型。

      PDX最大的优势是保留了肿瘤异质性，相对于传统人源肿瘤细胞系更符合临床肿瘤特征。然而PDX动物模型移植成功率低、培养周期长和成本高等缺点使其难以大规模应用于临床。随着干细胞生物学的发展，体外3D细胞培养分化成可模拟体内器官空间形态结构的类器官(organoid)，亦可应用于新的人肿瘤模型的开发。

      类器官可由成体组织干细胞或多能干细胞生成。作为传统2D细胞培养和动物模型之间的桥梁，3D类器官具有多种优势，提供了实验可操作性和再现生物体复杂性。以下比较了此三种实验模型在生物研究中的优缺点。

 

 

N Engl J Med. 2019;380(6):569-579.

 

      肿瘤类器官（Patient-derived organoids, PDOs）是用取自患病者体内原发性肿瘤，在实验室中培养出一微型的3D肿瘤细胞模型。首先，从患者体内获取肿瘤组织，清洗以防止污染，经消化、分散、过滤、离心后分离出肿瘤细胞。然后，选择合适的生物材料作为3D培养的细胞外基质，通过模拟肿瘤细胞基质环境进行培植。最后，形成体外类器官模型。肿瘤类器官高度模拟了来源肿瘤组织的特征，保留了个体之间的肿瘤异质性，可用于功能性的测试，如进行高通量的药物筛选，甚至个体化治疗检测。

 

类器官模型在肿瘤研究中的独特优势：

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a. 成本低；

b. 培养周期短；

c. 多次传代后依然能保持基因组稳定性；

d. 高度保留原位肿瘤组织的生物特征和异质性。

肿瘤类器官(PDO)的多方面应用:

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在临床应用方面，肿瘤类器官可以用于化疗药、靶向药、新型抗肿瘤抗体药等药物敏感性检测，辅助临床治疗决策，有效优化医疗资源配置。对患者而言，通过PDO药敏检测技术，在疾病的各个阶段，均可快速检测出最适合患者的药物治疗方案，降低药物毒性副作用、耐药风险和肿瘤复发几率。

在生物医药科研方面，肿瘤类器官具备肿瘤异质性，与来源肿瘤组织的基因表达完全一致，堪称「培养皿中的微器官」。在疾病模型、肿瘤分子、再生医学、与精准医学研究等多方向均有广泛的应用前景。

在新药研发方面，肿瘤类器官可作为最佳的体外试验模型，可大幅度缩短临床前试验与临床试验的周期、降低新药开发成本与风险，提供新药开发临床前大量生物数据的支持，为新药研发提供最优质的平台。

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      肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocytes, TILs)为肿瘤微环境的一个重要组成部份，由不同淋巴细胞组成的异质群体，包括T 细胞、B 细胞、natural killer (NK) 细胞、巨噬细胞及其它各种免疫细胞。关于它们在肿瘤生长和进展中的作用，几十年来科学家们一直争论不休。但不可否认的是这群细胞TILs在癌症进展中发挥了关键的作用，甚至可作为一种治疗手段。因此，TILs的表型与功能特征，与肿瘤细胞或肿瘤间质的相互作用，以及它们在预后或预测中的意义，都已成为全球研究热点。

 

      如今，肿瘤类器官相对于PDX动物模型，体外培养环境相对单纯；需要人工重建才能恢复肿瘤微环境(tumour microenvironment, TME)。美国斯坦福大学的Calvin J. Kuo研究组，在Cell杂志上发表了Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment的论文，通过气液交互法（air-liquid interface，ALI）培养患者来源的肿瘤类器官（Patient-derived Organoids，PDOs）重现了患者肿瘤免疫微环境。

     ALI-PDOs 模型成功保留了原肿瘤组织中固有的纤维基质和多样的免疫细胞组分，并从基因水平上得到佐证。而且，PDOs 中的 TILs 准确保留了原始肿瘤中的 T 细胞受体（TCR）谱。

 

 

      Kuo实验室自2009起就持续运用气液交互类器官培养技术还原原代组织和肿瘤细胞微环境。在这篇文章中，他们将该方法拓展到临床肿瘤标本，并申请了ALI-PDO的专利技术。该技术特点在于通过一体培养，保留了原位的肿瘤实质、基质，同时包含功能化的肿瘤特异性的肿瘤浸润淋巴细胞群。进而还原了其他类器官模型中没有的肿瘤组织原位基质和具有免疫检查点封锁（Checkpoint Blockade）的肿瘤微环境内源免疫细胞群。作者通过ALI-PDO技术成功体外培养了来自100个患者，14不同组织位点，28种不同疾病亚型的肿瘤组织。验证了这些组织均能够保留原肿瘤组织种的基质层，并从基因水平上验证了这点。

      接下来，研究组进一步通过一系列实验验证了PDOs可以保留原肿瘤组织中固有的纤维基质和多样的免疫组分，并可以在体外完成冻存复苏操作。

      然而仅仅证明有免疫细胞是不够的，作者接着运用目前通量最高的10x Genomics的单细胞测序技术，对PDOs和原位肿瘤的单细胞同时进行了5’V(D)J和RNA-seq测序。通过该技术验证了PDOs中同样能够还原肿瘤组织中的T，B和NK细胞，并进一步验证了PDOs中的肿瘤浸润免疫细胞能够还原原位肿瘤中的TCR全部位点。最后，作者通过小鼠和人源肿瘤组织均验证了ALI-PDOs可以还原肿瘤组织中PD-1依赖的免疫检查点。

      在肿瘤免疫治疗如火如荼的今天，临床上迫切的需要能够个体化验证疗效的体外模型。但是鉴于肿瘤微环境的复杂性，免疫治疗药物体外实验一直无法与临床疗效相匹配。PDO技术则为这一需求提供了技术出口，这大大有助于癌症研究与抗癌药物研发。

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参考文献：

1. Palucka, A.K. and L.M. Coussens, The Basis of Oncoimmunology. Cell, 2016. 164(6): p. 1233-1247.

2. Junttila, M.R. and F.J. de Sauvage, Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature, 2013. 501(7467): p. 346-54.

3. Dijkstra, K.K., et al., Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell, 2018. 174(6): p. 1586-1598.e12.

4. Method of the Year 2017: Organoids. Nature Methods, 2018. 15: p. 1.

5. Li, X., et al., Oncogenic transformation of diverse gastrointestinal tissues in primary organoid culture. Nat Med, 2014. 20(7): p. 769-77.

6. Ootani, A., et al., Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med, 2009. 15(6): p. 701-6.

7. Vlachogiannis, G., et al., Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science, 2018. 359(6378): p. 920-926

8. James T. Neal., et all., Organoid modeling of the tumor immune microenvironment. Cell. 2018;175(7); 1972-1988.

 

 

      传统药物开发倚靠着人源肿瘤细胞系进行高通量筛选。令人沮丧的是人源肿瘤细胞系经长期体外培养后，其肿瘤细胞基因图谱、蛋白质表达、肿瘤异质性等都与原始肿瘤组织存在很大差异。经多年验证，此细胞模型与临床相关性不到5%，从而在预测临床药效方面不理想。

      面对如此难题，科学家们开发出人源肿瘤组织来源移植瘤模型 (patient derived xenograft, PDX) ，即通过将病人新鲜的肿瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠体内，建立异种移植的肿瘤模型；此模型保留了肿瘤患者的组织型和遗传学的特征，并且维持了肿瘤的异质性。其跟临床的药效学结果有极高的相关性（~90%），所以它们被广泛的应用到药物研发当中。

 

PDX最大的优势：保留了肿瘤异质性，更符合临床肿瘤特征

1. 移植所用样本直接取自人体肿瘤组织，稳定保留肿瘤的遗传特性，组织学和表型特征，及肿瘤异质性；

2. PDX亦可用于筛选敏感化疗药物或耐药标记物，其试验结果具有较好的临床预见性，可作为二三线临床用药指导；

3. PDX在移植过程中较好地保留了肿瘤间质和干细胞成分，使得肿瘤的生长微环境更接近实际情况，还可为肿瘤样本的保存和传代提供大量标本等。

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      PDX在给药处理一段时间后可取出肿瘤做实验下游分析，如：抽取肿瘤 DNA进行NGS，使用流式细胞仪分析肿瘤细胞表征，甚至体外细胞培养进行药物敏感性测试。然而此时人源肿瘤组织周边会混和着不同程度的鼠源间质细胞 (stroma cells) 、周细胞 (pericyte)，甚至有血管增生。这些浸润混合的鼠源” 污染细胞” 对人源肿瘤组织产生许多非必要的异质性进而造成实验结果偏差。因此，有效地从患者衍生的异种移植肿瘤中去除小鼠细胞是PDX模型下游分析或培养应用的重大环节。

 

温和解离肿瘤组织、最大程度保留肿瘤细胞表面分子标记以及去除小鼠细胞的完整解决方案：

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I. 肿瘤解离 (Tumor dissociation)

II. 去除小鼠细胞 (Mouse Cell Depletion using Magnetic Cell Separation)

（1）以台盼蓝（Trypan Blue) 染色计数活细胞，重悬细胞于1x10⁷ cells/80 uL PBS buffer。

附注：此时需以台盼蓝（Trypan Blue) 染色在显微镜下计数活细胞，而不可用Cell Counter。因为组织解离后的单细胞呈现多样性，利用Cell Counter计数无法获得正确的活细胞数目。

（2）将细胞与标记小鼠细胞的磁珠混合，放置2−8 °C的冰箱孵育15分钟。加入适当体积缓冲液，上样于分离柱。无标记的细胞先流出，此即为目标人源肿瘤细胞 （untouched tumor cells）。可利用缓冲液额外清洗管柱，已获得更多的肿瘤细胞量。

III．分离后的肿瘤细胞下游分析(Downstream Mouse Cell-free Human Tumor Cell Analysis)

（1）使用独特的小鼠细胞分子标记（CD45/ MHCⅠ）组合，可在人源肿瘤组织来源移植瘤模型(PDX)去除绝大部份小鼠细胞。

 

(2) 细胞碎片在磁珠分选时也被清除。

 

 

(3） 分离后的人源肿瘤细胞进行体外培养，可获得均质细胞族群。

 

 

 (4) 分离后的人源肿瘤细胞执行RNA-Seq，明显获得更多可信的读值 (Read counts)

 

 

      肿瘤组织解离后，仅需20分钟即可经由无标记方式分离出肿瘤细胞(Untouched isolation of tumor cells)，保留了最大程度的细胞表面抗原决定部位(cell surface epitopes)，更重要的是分离获得特定目标细胞进行下游实验，为您的实验研究得到高可信度与高品质的数据。