什么是巨噬细胞？

 

      巨噬细胞是天然免疫系统特化的，存活时间长，具有吞噬作用的细胞。它们与中性粒细胞一起，是感染的第一反应者。巨噬细胞参与细胞碎片和病原体的识别、吞噬和降解。巨噬细胞还在向T细胞提呈抗原以及诱导其他抗原呈递细胞表达共刺激分子等方面发挥作用，从而启动适应性免疫反应。此外，在炎症初期，它们通过释放细胞因子和趋化因子发挥重要作用，这些细胞因子和趋化因子反过来将其他免疫细胞募集到炎症部位。

      巨噬细胞存在于大部分组织中，因此具有不同的功能。除了能启动对病原体的免疫反应和炎症反应，巨噬细胞还维持组织稳态以及组织的修复和重塑发挥作用。不幸的是，这种功能与许多疾病有关，包括代谢和自身免疫性疾病、癌症、感染、肥胖和纤维化。因此，巨噬细胞似乎在肿瘤微环境中也起着关键作用，特别是在基质重塑、血管生成、转移和肿瘤进展中

 

巨噬细胞的发育

 

      巨噬细胞的来源很多。驻留在组织中的巨噬细胞可以从循环单核细胞中分化出来，循环单核细胞由骨髓中的造血干细胞发育而来，也可以在胚胎发育过程中在胎肝、卵黄囊或背主动脉附近的胚胎区域生成，因此在成年期独立于单核细胞而存在。前一种发育是通过单核细胞在稳定状态下或炎症时迁移到组织中实现的，随后分化为持续性的组织特异巨噬细胞，包括骨巨噬细胞（破骨细胞）、中枢神经系统（小胶质细胞）、结缔组织（组织细胞）和肝脏（库普弗细胞），以及肺泡巨噬细胞（噬尘细胞）、肠、脾和腹膜。

      小胶质细胞和库普弗细胞能够在存在白细胞介素34 （IL-34）的情况下自我更新，IL-34表达于这些组织，并与巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的受体结合。由于它们分布和作用于多种不同组织和器官中，因此巨噬细胞具有多种形态和表型。

 

 

图 1.巨噬细胞发育。单核细胞由骨髓中的造血干细胞发育而来，并经历几个分化步骤。单核细胞作为常驻单核细胞或有炎症时作为炎性单核细胞迁移到常驻组织中。迁移到组织后，分化为组织特异性巨噬细胞。

 

巨噬细胞是吞噬细胞

 

      巨噬细胞是除粒细胞（嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）和树突状细胞（DC）之外的三种吞噬细胞类型之一。微生物一旦进入宿主并开始复制，这些吞噬细胞中的一种就会将其识别并吞噬破坏，这一过程称为吞噬作用。大多数病原体通过呼吸系统、肠粘膜、皮肤损伤或泌尿生殖道进入宿主。由于巨噬细胞聚集在粘膜下层组织中，它们通常是第一个遇到病原体的防御细胞。当某些吞噬细胞受体（通常是病原体特有的碳水化合物或脂质结构）与病原体表面相互作用时，吞噬作用就开始了。

      在第一次相互作用后，吞噬细胞质膜将病原体包围并内化在一个被称为吞噬体的大膜包裹的内吞囊泡中。然后吞噬体与一个或多个溶酶体融合，形成吞噬溶酶体，溶酶体是含有抗菌肽和酶的小囊泡。溶酶体内容物被释放到吞噬溶酶体中，吞噬溶酶体反过来经历酸化和酶促过程，生成高活性的一氧化氮和超氧化物自由基来杀死病原体。

      关于噬细胞受体的两个例子是Dectin-1和甘露糖受体(CD206)。两者都是C型凝集素样家族的成员。Dectin-1由巨噬细胞和中性粒细胞表达，并与真菌细胞壁中常见的葡萄糖聚合物结合。CD206由巨噬细胞和DC表达，并与真菌、细菌和病毒共有的多种甘露糖基化配体结合。

 

 

图 2.吞噬作用。第一组：组织巨噬细胞携带多种表面受体，其中一些是吞噬作用所必需的。甘露糖受体可识别细菌、真菌和病毒上的甘露糖基化配体。Dectin-1与真菌细胞壁上的某些葡萄糖聚合物结合。补体受体结合并内化补体包裹的细菌。大多数吞噬作用受体可识别病原体特异性的碳水化合物或脂质结构。第二组：吞噬作用发生后，吞噬体与一个或多个溶酶体融合，生成吞噬溶酶体。

 

      巨噬细胞的分类仍然是一个非常有争议的话题，不同的因素会导致不同的表型和巨噬细胞活化状态，包括信号分子、生长因子、转录因子、表观遗传和转录后机制和变化，以及微环境信号，如细胞因子、细胞间接触物和代谢物。此外，面对微生物及其产物，如脂多糖（LPS），巨噬细胞可以调节自身的活化状态。然而，巨噬细胞的活化在组织稳态以及炎症和疾病进展中起着至关重要的作用。一般来说，巨噬细胞可以根据其功能和活化作用进行分类，并分为两种亚型：经典活化的M1巨噬细胞和替代活化的M2巨噬细胞。

 

 

M1和M2巨噬细胞的分化。M1和M2巨噬细胞响应多种因素，包括信号分子、生长因子、转录因子、细胞因子、细胞间接触物和代谢物。

 

经典活化态的M1巨噬细胞

 

      M1巨噬细胞主要通过天然和适应性免疫反应在Th1细胞募集、病原体抵抗和肿瘤控制中发挥作用。M1巨噬细胞通常由病原体、LPS、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和1型辅助性T （Th1）细胞因子干扰素γ（IFN-γ）活化。许多通路能促进巨噬细胞向M1极化，，包括IRF/STAT、LPS/TLR4和NF-κB/PI-3激酶通路。

      从特征上说，M1巨噬细胞抗原呈递活性强和分泌促炎细胞因子多，如白细胞介素1 （IL-1）、IL-6、TNF-α、一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）。此外，它们下调IL-12和IL-23和IL-10的表达。M1巨噬细胞的刺激导致 IL-1b、TNF-α、IL-12、IL-18和IL-23的分泌水平提高。此外，M1巨噬细胞表型表达高水平的主要组织相容性复合体II类（MHC II）、CD68、CD80和CD86，以及针对Th1细胞的趋化因子，包括CXCL9和CXCL12。

 

表 1.人M1巨噬细胞标志物。这些标志物可用于区分M1巨噬细胞和其他细胞类型。

 

物种	巨噬细胞亚型	标志物	标志物类型
人	M1	IFN-γ	分泌
人	M1	IL-1a	分泌
人	M1	IL-1b	分泌
人	M1	IL-6	分泌
人	M1	IL-12	分泌
人	M1	IL-23	分泌
人	M1	TNF-α	分泌
人	M1	CD16	表面
人	M1	CD16/CD32	表面
人	M1	CD32	表面
人	M1	CD64	表面
人	M1	CD68	表面
人	M1	CD80	表面
人	M1	CD86	表面
人	M1	CD369 (Dectin-1)	表面
人	M1	Mer (MerTK)	表面
人	M1	MHC II	表面
人	M1	IRF5	细胞内/转录因子
人	M1	STAT1	细胞内/转录因子
名词缩写表：CD，分化群；IFN，干扰素；IL，IL，白细胞介素；IRF，干扰素调节因子；MHC，主要组织相容性复合体；NOS，一氧化氮合酶；STAT，信号转换器和转录活化剂；TNF，肿瘤坏死因子。

 

表 2.小鼠M1巨噬细胞标志物。这些标志物可用于区分M1巨噬细胞和其他细胞类型。

 

物种	巨噬细胞亚型	标志物	标志物类型
小鼠	M1	IFN-γ	分泌
小鼠	M1	IL-1	分泌
小鼠	M1	IL-6	分泌
小鼠	M1	IL-12	分泌
小鼠	M1	IL-23	分泌
小鼠	M1	TNF-α	分泌
小鼠	M1	CD14	表面
小鼠	M1	CD16/CD32	表面
小鼠	M1	CD32	表面
小鼠	M1	CD64	表面
小鼠	M1	CD68	表面
小鼠	M1	CD80	表面
小鼠	M1	CD86	表面
小鼠	M1	CD204	表面
小鼠	M1	CD369 (Dectin-1)	表面
小鼠	M1	Ly-6C	表面
小鼠	M1	Mer (MerTK)	表面
小鼠	M1	MHC II	表面
小鼠	M1	IRF5	细胞内/转录因子
名词缩写表：CD，分化群；IFN，干扰素；IL，白细胞介素；IRF，干扰素调节因子；MHC，主要组织相容性复合体；TNF，肿瘤坏死因子。

 

替代活化型M2巨噬细胞

 

      M2巨噬细胞可由寄生虫或真菌感染、免疫复合物、凋亡细胞、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、IL-13、TGF-b和2型辅助性T细胞因子 （Th2）IL-4、IL-33和IL-25通过Th2细胞替代活化。促进巨噬细胞进入M2状态的潜在信号包括STAT6、IRF4、PPARδ和PPARγ。

      与经典活化亚型相反，替代活化的亚型表达相反的表达谱：下调IL-12和IL-23，上调IL-10和IL-1RA。此外，M2巨噬细胞表达较低的炎症细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α。M2巨噬细胞在病原体清除、抗炎反应和代谢以及伤口愈合、组织重塑、免疫调节、肿瘤进展和恶性肿瘤中发挥作用。

      M2表型的特点是表达CD206、CD163、CD209、FIZZ1和Ym1/2。一般来说，这种亚型高效表达吞噬作用和清除甘露糖和半乳糖所需的受体，以及能通过精氨酸酶通路增加鸟氨酸和多聚氨基酸的产生。这种类型的巨噬细胞表达的趋化因子有CCL1、CCL17、CCL18、CCL22和CCL24 。

 

M2巨噬细胞亚型

 

      针对对巨噬细胞不同的刺激，已知有四种M2亚型：M2a、M2b、M2c和M2d。这些亚型因其细胞表面标志物、分泌的细胞因子和生物功能不同而各不相同。然而，所有M2巨噬细胞亚型都共同表达IL-10。

· M2a巨噬细胞：由IL-4或IL-13活化。IL-4反过来促进甘露糖受体（CD206）的表达。经证实，进一步上调 IL-10、TGF-b、CCL17、CCL18和CCL22能促进细胞生长、组织修复和胞吞作用。

· M2b巨噬细胞：由免疫复合物、Toll样受体（TLR）配体和IL-1b活化。活化后，这种亚型释放促炎和抗炎细胞因子TNF-α、IL-1b、IL-6和IL-10。M2b巨噬细胞在免疫反应和炎症的调节中发挥作用。

· M2c巨噬细胞：由糖皮质激素、IL-10和TGF-b（和灭活的巨噬细胞）活化。这种亚型的特征是高效表达抗炎IL-10、促纤维化因子TGF-b、CCL16、CCL18以及Mer受体酪氨酸激酶（MerTK），其中MerTK能促进凋亡细胞吞噬。

· M2d巨噬细胞：由TLR拮抗剂、IL-6和腺苷活化。腺苷促进IL-10和血管内皮生长因子（VEGF）的表达，这个过程能加剧血管生成和肿瘤进展。

 

表 3.人M2巨噬细胞标志物。这些标志物可用于区分M2巨噬细胞和其他类型的细胞。

 

物种	巨噬细胞类型	标志物	标志物类型
人	M2	IDO	分泌
人	M2	IL-10	分泌
人	M2	TGF-b	分泌
人	M2	CD115	表面
人	M2	CD204	表面
人	M2	CD163	表面
人	M2	CD206 (MMR)	表面
人	M2	CD209 (DC-SIGN)	表面
人	M2	FceR1	表面
人	M2	VSIG4	表面
人	M2	IRF4	胞内/转录因子
人	M2	STAT6	胞内/转录因子
名词缩写表：CD，分化群；FceR1，IgE受体I的Fc片段；IDO，吲哚胺-2，3-双加氧酶；IL，白细胞介素；IRF，干扰素调节因子；STAT，信号转导和转录激活因子；TGF，转化生长因子；VSIG4，V-Set免疫球蛋白域蛋白4。

 

表 4.小鼠M2巨噬细胞标志物。这些标志物可用于区分M2巨噬细胞和其他类型的细胞。

 

物种	巨噬细胞类型	标志物	标志物类型
小鼠	M2	精氨酸酶	分泌
小鼠	M2	IDO	分泌
小鼠	M2	IL-10	分泌
小鼠	M2	TGF-b	分泌
小鼠	M2	YM1	分泌
小鼠	M2	CD14	表面
小鼠	M2	CD115	表面
小鼠	M2	CD163	表面
小鼠	M2	CD204	表面
小鼠	M2	CD206 (MMR)	表面
小鼠	M2	CD209 (DC-SIGN)	表面
小鼠	M2	CSF1R	表面
小鼠	M2	FceR1	表面
小鼠	M2	Ly-6C	表面
小鼠	M2	IRF4	胞内/转录因子
小鼠	M2	RELM-a	胞内/转录因子
小鼠	M2	STAT6	胞内/转录因子
名词缩写表：CD，分化簇；CSF1R，集落刺激因子1受体；FceR1，IgE受体I的Fc片段；IDO，吲哚胺-2，3-双加氧酶；IL，白细胞介素；IRF，干扰素调节因子；RELMa，抵抗素样分子-α；TGF，转化生长因子。

 

 

下表A列出了可用于识别巨噬细胞（一般表型）及其表征（功能特征）的标志物。标记物的位置(表面或细胞内)对检测这些抗原的方法有影响。

 

表A .近期已知的细胞标记物列表。列出的标志物可用于区分人和小鼠巨噬细胞。

 

物种	标志物类型	标志物	克隆	标志物的位置
人	一般表型	CD11b	ICRF44	表面
		CD14	61D3	表面
		CD15	HI98	表面
		CD16	eBioCB16	表面
		CD68	eBioY1/82A	胞内
	功能特性	IDO	Eyedio	胞内
		CD163	eBioGHI/61或Mac 2-158	表面
		CD206	19.2	胞内
		精氨酸酶-1	A1exF5	细胞内
		CD204（MSR-1）	PSL204	表面
		CD369（Clec7a，Dectin-1）	1500	表面
		GPNMB（骨激活素）	HOST5D	表面
		VSIG4	JAV4	表面
		Marco	PLK-1	表面
		MerTK	HMER5DS	表面
		骨桥蛋白	2F10	胞内
		Axl	DS7HAXL	表面
		VISTA	B7H5DS8	表面
		HLA-DR	LN3	表面
小鼠	一般表型	CD11b	M1/70	表面
		F4/80	BM8	表面
		MerTK	DS5MMER	表面
		CD68	FA-11	胞内
	功能特性	Axl	MAXL8DS	表面
		CD204	M204PA	表面
		CD369	bg1fpj	表面
		VISTA	MIH64	表面
		CD163	TNKUPJ	表面
		CD206	MR6F3	胞内
		GPNMB（骨激活素）	CTSREVL	表面
		VSIG4（CRIg）	NLA14	表面
		CXCL13	DS8CX13	胞内
		IDO	mIDO-48	胞内
		Nos2（iNos）	CXNFT	表面
		精氨酸酶-1	A1exF5	胞内
		LYVE-1	ALY7	表面
		RELM-a	DS8RELM	表面
		Ly-6C	HK1.4	表面
名词缩写表：CD，分化簇；CXCL13，C-X-C基序趋化因子13；GPNMB，糖蛋白非转移性黑素瘤蛋白B；HLA，人白细胞抗原；IDO，吲哚胺-2，3-双加氧酶；LYVE-1，淋巴管内皮透明质酸受体1；NOS，一氧化氮合酶；RELMa，抵抗素样分子-α；VSIG4，V-Set免疫球蛋白域蛋白4。

 

流式细胞仪-识别巨噬细胞的示例

 

      虽然传统的M1/M2模型可以用于体外培养和刺激，来探索不同类型的巨噬细胞活化状态，但对组织巨噬细胞复杂网络的新认识清楚地表明，其无法充分描述这些细胞在体内的功能和表型多样性。 因此，我们建议基于多种标志物的表达和功能特征，采用更灵活和更全面的方法来代替过分简化的M1/M2模型。然而，用于定义M1和M2表型的经典标志物仍然在巨噬细胞表征中发挥重要作用。在这里，我们定义了一些传统的标志物，包括诱导型一氧化氮合酶（iNOS，NOS2）、精氨酸酶-1（Arg1）、甘露糖受体（CD206）、RELM-a（FIX1）和CD163，用于表征巨噬细胞。

 

iNOS和精氨酸酶1

 

      巨噬细胞（至少在小鼠细胞中）经典激活型和替代活化型的标志物分别为iNOS和Arg1（图1）。iNOS是一种酶，可催化L-精氨酸的NADPH依赖性氧化反应生成L-瓜氨酸和一氧化氮（NO）。一氧化氮是细胞毒性和其他生理功能（例如，血管舒张）的重要介质。iNOS在巨噬细胞中不是组成型表达，其存在能表明此前用促炎细胞因子（如IL-1、TNF-α或IFN-γ）刺激的结果。

      Arg1酶将L-精氨酸转化为尿素和L-鸟氨酸。通过降解精氨酸，Arg1占据了iNOS的底物，并且下调一氧化氮生成。IL-4和IL-13强烈诱导巨噬细胞表达Arg1，而不是由抗炎细胞因子（如IL-10或TGF-b）诱导。与iNOS表达相反，在多个组织巨噬细胞群中发现Arg1有表达。例如，大多数小鼠大腹膜巨噬细胞（F4/80 高巨噬细胞）在稳态下呈Arg1阳性。如图4所示，甚至可以在一些受IFN-γ刺激的巨噬细胞中检测到Arg1。因此，Arg1不应被视为M2极化的完全特异性标记，尤其是分析原代未培养细胞时。

 

 

图 1.用IFN-γ刺激的巨噬细胞主要表达iNOS，小部分亚群表达iNOS和低水平的Arg1。IL-4刺激的巨噬细胞表达Arg1而不表达iNOS。C57BL/6小鼠骨髓衍生巨噬细胞采用LPS和IFN-γ（M1）或IL-4（M2a）处理24小时，随后用 F4/80单克隆抗体（克隆BM8）、eFluor 450（货号48-4801-82）进行表面染色。然后用 Intracellular Fixation&Permeabilization Buffer SetI（货号88-8824-00）固定和透化细胞，随后用 iNOS单克隆抗体（克隆CXNFT）、APC（货号17-5920-82）和精氨酸酶1单克隆抗体（克隆A1exF5）、PE（货号12-3697-82）进行细胞内染色。存活F4/80+细胞用于分析。

 

甘露糖受体（CD206）

 

      巨噬细胞甘露糖受体，称为CD206或甘露糖受体C类型1（MRC1），介导真菌、细菌、原生动物和病毒抗原的吞噬和内吞摄取，并且在免疫防御及其调节中发挥重要作用。甘露糖受体是替代活化巨噬细胞的原始识别标志物。与Arg1相反，CD206广泛地在替代活化型巨噬细胞中表达，包括用IL-10或糖皮质激素处理的耐受性细胞。有趣的是，TGF-b被证明可以下调CD206的表达。抑制这种受体表达的其他因素包括LPS、IFN-γ和TNF-α。与Arg1相似，CD206组成型表达地表达于多种类型的组织巨噬细胞中，尽管它与Arg1的表达模式不完全重叠。图2中的右组显示了CD206在小（F4/80 lo）和大（F4/80 hi）腹膜巨噬细胞中的组成性表达。

 

 

图2.大量小鼠小腹膜巨噬细胞（F4/80 lo）和大腹膜巨噬细胞（F4/80 hi）的组成性表达CD206。用 F4/80单克隆抗体（克隆BM8）、eFluor 450（货号48-4801-82）对小鼠常驻腹膜渗出细胞进行表面染色，随后用 Intracellular Fixation&Permeabilization Buffer Set（货号88-8824-00）进行固定和透化。然后用大鼠IgG2b同种型对照（克隆eB149/10H5）、APC（货号17-4031-82（左组）或 CD206单克隆抗体（克隆MR6F3）、APC（货号17-2061-80（右组）对细胞进行胞内染色。总细胞用于分析；大多数双阴性细胞为B细胞。

 

RELM-a（FIZZ1）

 

      RELM-a，也称为抵抗素样α或FIZZ1，是一种由IL-4和IL-13强烈诱导的小细胞因子，参与抵抗寄生虫感染的反应。与Arg1相似，糖皮质激素和IL-10不能诱导RELM-a。尽管如此，这两种常用的M2活化标志物的在体内表达的模式非常不同。例如，在没有刺激的情况下，大多数小腹膜巨噬细胞（F4/80 lo）和少数大腹膜巨噬细胞（F4/80 hi）表达RELM-a（图3）。

 

 

图3.大多数小腹膜巨噬细胞（F4/80 lo）和极少数大腹膜巨噬细胞（F4/80 hi）自发表达RELM-a。C57BL/6小鼠常驻腹膜渗出细胞用 F4/80单克隆抗体（克隆BM8）、eFluor 450（货号48-4801-82）进行表面染色。然后用 Intracellular Fixation&Permeabilization Buffer Set（货号88-8824-00）固定和透化细胞，并且用大鼠IgG1同种型对照（克隆eBRG1）、APC（货号17-4301-82（左组）或 RELMα单克隆抗体（克隆DS8RELM）、APC（货号17-5441-82）（右组）对细胞进行胞内染色。所有腹膜细胞用于分析；大多数双阴性细胞为B细胞。

 

CD163

 

      CD163为触珠蛋白和血红蛋白受体。由于CD163的主要功能是促进铁的再循环过程，因此在脾红髓巨噬细胞中可以观察到CD163的最高表达。CD163还可以用于检测某些细菌化合物，并且在组织巨噬细胞的其他亚群中表达，包括Kupffer c细胞、肠固有层巨噬细胞和一部分大腹膜巨噬细胞（图4），尽管表达程度较低。与人CD163不同，小鼠CD163不容易由M2极化细胞因子诱导，故不是鼠科动物M2巨噬细胞的良好标志物。相反，其表达似乎表明了组织特异性巨噬细胞功能（例如，血红蛋白再循环）。

 

 

图4.很大一部分大腹膜巨噬细胞（F4/80 hi）和几乎没有小腹膜巨噬细胞（F4/80 lo）组成性表达CD163。BALB/c小鼠脾细胞用 F4/80单克隆抗体（克隆BM8）、eFluor 450（货号48-4801-82）和大鼠IgG2a同种型对照（克隆eBR2a）、PerCP-eFluor 710（类别编号46-4321-82）（左组）或 CD163单克隆抗体（克隆TNKUPJ）、PE（货号12-1631-82)（右组）对细胞进行胞内染色。总细胞用于分析。

 

      作为免疫系统的一部分，巨噬细胞除了在对抗疾病中发挥调节作用之外，在慢性炎症、自身免疫性疾病和癌症中也发挥负向作用。在常规免疫反应中，促炎巨噬细胞受到抑制，致使其促炎信号减弱。在长期损伤过程中，失调的巨噬细胞持续分泌炎性细胞因子并且募集其它免疫细胞。这些过程维持慢性炎症，被认为在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。一旦肿瘤形成，就会使巨噬细胞从免疫活性状态分化为免疫抑制状态。在大多数癌症中，这些所谓的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）高度密集，均与患者预后不良有关。在伤口愈合过程中，如果免疫反应控制不够，巨噬细胞也可能导致纤维化。对于其它慢性病包括动脉粥样硬化、哮喘、炎性肠病和类风湿性关节炎，巨噬细胞也起关键作用。

 

研究方法

 

      可以从全血（PBMC分离、巨噬细胞分析、单核细胞分化成巨噬细胞）或组织或肿瘤（组织或肿瘤样本的单细胞悬液制剂）中分离和分析巨噬细胞。此外，人和小鼠单核细胞系有商业化的产品，包括THP-1细胞（急性单核细胞白血病）、U937细胞（组织细胞淋巴瘤）以及RAW264.7细胞（小鼠白血病单核巨噬细胞）和J774A.1细胞（小鼠BALB/c单核巨噬细胞）。

      有多种方法可以分离巨噬细胞，包括磁珠细胞分选、密度梯度分离、激光捕获显微解剖和流式细胞仪分选法（FACS）。分离后，可以通过基因表达分析、功能研究、细胞因子和趋化因子生成的评估以及使用免疫荧光染色、免疫检定、流式细胞仪、免疫印迹或聚合酶链反应的蛋白质表达和细胞表面标志物来分析和表征巨噬细胞功能和表型。请注意，并非每种分析方法均需要分离巨噬细胞。

 

巨噬细胞分离

 

      当分析或处理来自组织或肿瘤的巨噬细胞时，通常制备组织或肿瘤切片或单细胞悬液。组织或肿瘤切片可直接用于免疫组织化学（IHC）染色和分析。为了制备单细胞悬液，需要解剖组织或肿瘤，然后进行酶消化。单细胞悬浮液可以直接用于表面标记物的流式细胞术分析等方法

      当需要时，可以使用激光捕获显微解剖和流式细胞仪分选法（FACS）或磁珠细胞分选试剂盒分离巨噬细胞。通过流式细胞术(FACS)进行分离时，使用针对细胞表面标记的荧光染料偶联的抗体对细胞亚群进行染色，然后使用细胞分选仪根据定义的分选标准对染色细胞进行分选。使用抗体磁珠细胞分离试剂时，细胞特异性表面标志物的特异性抗体接合在磁珠上，细胞悬液会继续带有磁珠一起孵育。一旦磁珠上抗体与目标细胞的表面标志物结合，再洗去未结合的非目标细胞，就可得到与磁珠结合的目标细胞。

      此外，可以进一步培养和刺激分离的巨噬细胞。通常，M1巨噬细胞可以通过刺激被重新编程为M2巨噬细胞，反之亦然。巨噬细胞的培养可用于刺激或生成细胞裂解物或细胞培养上清液，其可用于qPCR检测、免疫印迹或各种免疫检测（IA），包括ELISA、基于磁珠的免疫检测（多因子试剂盒）和基于PCR的免疫检测（如 ProQuantum高灵敏度免疫检测，用于各种细胞因子的定量）。也可以通过检测吞噬作用来研究巨噬细胞功能。

      当从全血中分析或处理巨噬细胞时，常用步骤是分离单核细胞并且将其分化为巨噬细胞。因此，使用Ficoll Paque通过密度梯度分离从全血中分离PBMC。这种方法利用了全血中不同细胞类型之间的密度差异。随后，使用FACS流式分选或磁珠细胞分选试剂盒从PBMC悬液中分离CD14+单核细胞，例如，采用PBM Pan Monocytes enrichmnet Kit（货号：711105）、Human CD14 Positive selection kit（ 货号：711405）。另一种经济高效的分离方法是在组织培养塑料器皿中培养PBMC悬浮液，单核细胞优先粘附在其上;使用明胶（货号：211025）涂层表面会增加单核细胞数量。

 

巨噬细胞体外分化

 

      有多种刺激/分化技术能在体外获得原代巨噬细胞或极化M1或M2巨噬细胞。如果不需要进一步分离单核细胞，则分离的PBMC可通过与含15%胎牛血清（FCS）的RPMI 1640培养基一起培养直接生成巨噬细胞。

      分离的单核细胞可以使用特殊的分化培养基分化成原代巨噬细胞。例如，使用生长因子GM-CSF和M-CSF可以使单核细胞分化成巨噬细胞。可以在RPMI 1640培养基中刺激单核细胞，培养基中添加10% FCS和10ng/mL GM-CSF或10ng/mL M-CSF持续7天，能导致M1和M2巨噬细胞分化。刺激后，细胞以细长形状粘附于培养皿表面。

      另外，可以用不同的细胞因子先后刺激单核细胞来获得M1和M2极化巨噬细胞。用含10% FCS的RPMI 1640培养基培养得到的细胞，随后用10ng/mL脂多糖处理24小时（ eBioscience脂多糖（LPS）溶液， 货号00-4976-03）和50ng/mL IFN-γ以获得M1巨噬细胞或添加20ng/mL IL-4可获得M2/M2a巨噬细胞。用免疫复合物和IL-1b或LPS处理能促进M2b活化，加入IL-10、TGF-b或糖皮质激素则能促进M2c活化 。可以使用免疫组织化学染色或流式细胞仪分析其表面表达的标志物来识别巨噬细胞类型。

 

      1882年，Ilya Metchnjkoff首次描述了单核细胞，此后，证明了单核细胞对人健康和疾病至关重要。单核细胞是白细胞的一个亚群，在维持机体稳态、病原体识别和清除以及炎症中发挥关键作用。小鼠的单核细胞约占其白细胞总数的4%，而人单核细胞占其白细胞总数的10%。在骨髓祖细胞生成和发育后，单核细胞在脉管系统、骨髓和脾脏中循环；其在稳态下不增值。无论是在正常的发育过程中还是由于病原体攻击，一旦单核细胞迁移到外周组织，就会分化为树突状细胞或巨噬细胞。单核细胞的特征是可塑性和异质性，因为它可以快速调整其功能表型以响应变化的机体环境。

 

单核细胞发育

 

      单核细胞是单核吞噬细胞系统（Mononuclear phagocyte system,MPS）的成员，MPS是对所有高吞噬性单核细胞及其前体的综合分类。MPS包括除多形核粒细胞以外的所有髓系免疫细胞。在细胞流式分选技术（FACS）出现之前，对MPS中细胞的来源和谱系知之甚少，FACS能够根据特定细胞标志物物的表达来识别祖细胞和分化细胞群。目前的单核细胞分化模型表明，循环单核细胞来源于具有髓系限制潜能的造血干细胞（HSC）源性祖细胞。骨髓单核细胞分化期间被普遍认同的步骤包括髓系共同祖细胞（CMP）、粒细胞-巨噬细胞前体（GMP）、巨噬细胞和DC前体（MDP）（图1）。

图 1.小鼠单核细胞的发育谱系。名词缩写表：CD103 IpDC，CD103+固有层树突状细胞；CDP，树突状细胞共同前体；CMoP，单核细胞共同祖细胞；CX3CR1+，CX3C-趋化因子受体1；HSC，造血干细胞；MDP，巨噬细胞和树突状细胞前体；MDSC，髓源抑制性细胞；MP，髓系前体；TipDC，生成树突状细胞的肿瘤坏死因子（TNF）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）；pDC，浆细胞样树突状细胞；cDC，典型树突状细胞。

 

单核细胞亚群标志物

 

---

人单核细胞标志物

      根据CD14, CD16 (Fcγ RIII), CD64 (Fcγ RI)和趋化因子受体CD192和CX3CR1的表达将人外周血单核细胞群定义为三个不同的亚群：经典型、中间型和非经典型（表1）。可以通过不同水平的HLA-DR和CD195以及受体TNFR1（CD120a）和TNFR2（CD120b）对这些亚群进一步进行分类。TNFR1在中间型单核细胞中表达最高，而TNFR2在非经典型单核细胞中表达最高。

 

表 1.人单核细胞标志物。

 

群体	标志物	趋化因子受体	功能
经典型 87-88%	CD14Hi CD64 CD62L TNFR1 TNFR2Low	CD192Hi CXCR1Low	有吞噬活性的主要群体 较弱促炎细胞因子生成
中间型（经典型CD16+） 2-3%	CD16 CD14Hi CD64 HLA-DRHi TNFR1Hi TNFR2	CD192Low CX3CR1Hi CD195	促炎 生成TNF-α、IL1b和IL-6
非经典型 10%	CD14Low CD16Hi TNFR1Low TNFR2Hi		抗炎 组成型生成IL-1RA
名词缩写表：CD，分化簇；CXC，半胱氨酸-任意氨基酸-半胱氨酸；CXCR，CXC趋化因子受体；HLA，人白细胞抗原；IL，白细胞介素；TNF，肿瘤坏死因子。TNFR，肿瘤坏死因子受体。Low：低表达水平，Hi：高表达水平。

 

小鼠单核细胞标志物

 

      小鼠单核细胞也有三个不同的亚群（表2），由其细胞表面表达的Ly6C、CD11b和趋化因子受体CD192和CX3CR1来定义。此外，高水平的CD115表达能够区分外周血单核细胞和粒细胞以及淋巴细胞，淋巴细胞也表达CD11b（Mac-1）。

 

表 2.小鼠单核细胞标志物。

 

群体	标志物	趋化因子受体	功能
经典型 Ly6CBright 40%	Ly6CHi CD43Low CD11b CD115 CD62L	CD192Hi CXCR1Low	炎症产生TNFa
中间型 20%	Ly6CHi CD43Hi CD11b CD115		促炎
非经典型 Ly6CDim	Ly6CLow CD43Hi CD11b CD115 CD11c	CD192Low CX3CR1Hi	抗炎 组成性表达IL-1RA
名词缩写表：CD，分化簇；CXC，半胱氨酸-任意氨基酸-半胱氨酸；CXCR，CXC趋化因子受体；HLA，人白细胞抗原；IL，白细胞介素；TNF，肿瘤坏死因子；TNFR，肿瘤坏死因子受体。Low：低表达水平，Hi：高表达水平。

 

趋化因子和单核细胞迁移

 

CCR2

 

      CCL2（也称为MCP1）和CCL7（也称为MCP3）是与CCR2结合并且介导Ly6CBright单核细胞募集的CC趋化因子。虽然CCR2的表达仅限于少数细胞类型，但大多数（如果并非全部）有核细胞在促炎细胞因子激活或一系列微生物分子刺激天然免疫受体时能够表达CCL2许多感染会诱导CCL2的表达，从而导致血清和炎症组织中CCL2的高度循环。CCL2二聚化并与组织糖胺聚糖结合，由此引导单核细胞向感染或炎症部位移动的梯度。支持这一模型的是，CCL2中的氨基酸突变抑制了单核细胞的募集，而此氨基酸突变可阻止自身二聚化并与糖胺聚糖的结合

 

CCR1和CCR5

 

      单核细胞也表达CCR1和CCR5，这些受体结合多种趋化因子，包括共享配体CCL3（也称为MIP1α）和CCL5。体外迁移试验表明：（1）CCR1主要在剪切流存在时介导单核细胞阻滞；（2）CCR5有助于单核细胞”扩散“；（3）CCR1和CCR5都是通过内皮细胞向CCL5趋化。这些观察结果表明，这两种受体在单核细胞募集中具有特殊作用。表3总结了参与单核细胞募集的趋化因子。

 

表 3.参与单核细胞迁移的趋化因子受体。

 

趋化因子受体	配体
CCR1 (CD191)	CCL3 (MIP-1a), CCL5 (RANTES), MCP2 (CCL8)
CCR2 (CD192)	CCL2 (MCP1), CCL7 (MCP3), CCL12 (MCP5)
CX3CR1	CX3CR1
CCR5	CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES)
CCR6	CCL20 (MIP-3a)
CCR7	CCL19 (MIP-3b)
CCR8	CCL1
CXCR2	CXCL1 (GROa), CXCL2 (GROb), CXCL3 (GROg), MIF
CXC，半胱氨酸-任意氨基酸-半胱氨酸；CXCR，CXC趋化因子受体；CCL，半胱氨酸-半胱氨酸趋化因子配体；CC，趋化因子受体；MCP，单核细胞趋化蛋白；MIP，巨噬细胞炎性蛋白；RANTES，调节活化正常T细胞表达和分泌细胞因子；MIF，巨噬细胞迁移抑制因子

 

黏附分子和单核细胞迁移

 

      单核细胞募集遵循白细胞黏附和迁移的一般模式，包括滚动、黏附和迁移。白细胞（包括单核细胞）的迁移取决于整合素和其他黏附分子。小鼠中的LY6CHi单核细胞表达L-选择素、P-选择素糖蛋白配体1（PSGL1）、淋巴细胞功能相关抗原1（LFA1，也称为αLβ2整合素）、巨噬细胞受体1（MAC1，也称为整合素αMβ2）、血小板内皮细胞黏附分子（PECAM1）和迟现抗原4（VLA4，也称为整合素α4β1），所有这些均有助于白细胞黏附和迁移。

      在静息状态下，整合素LFA1介导LY6CLow单核细胞沿着真皮血管内皮细胞游走。相反，LFA1缺失对LY6CHi单核细胞的早期募集不影响。这些结果表明，不同单核细胞亚群可能因组织类型和炎症状态不同而黏附机制不同。表4总结了参与单核细胞募集的黏附分子。

 

表 4.黏附分子参与单核细胞迁移。

 

黏附分子	配体
L-选择素	糖蛋白、CD34、GLYCAM1和MADCAM1
PSGL	P-选择素和E-选择素
LFA1	ICAM1
MAC1	ICAM1
VLA4	VCAM1
PECAM1	内皮PECAM1
DNAM-1 (CD226)	CD155
名词缩写表：DNAM-1，DNAX辅助分子-1；GLYCAM1，糖基化相关细胞黏附分子1；ICAM1，细胞间黏附分子1；LFA1，淋巴细胞功能相关抗原1；MAC1，巨噬细胞受体1；MADCAM1，粘膜地址素细胞黏附分子1；PECAM1，血小板内皮细胞黏附分子；PSGL1，P-选择素糖蛋白配体1；VCAM1，血管细胞黏附分子1；VLA4，迟现抗原4。

 

研究单核细胞的工具

 

分离

      可以从外周血单核细胞（PBMC）分离原代人单核细胞。首先通过密度梯度离心从人血或外周白细胞中分离PBMC。然后使用Invitrogen Dynabeads Untouched Human Monocytes Kit从PBMC中分离单核细胞，该试剂盒通过阴性分离从PBMC中分离较纯的、有活性的单核细胞。该试剂盒去除 T 细胞、B 细胞、NK 细胞、树突状细胞、粒细胞和红细胞，而在样品中留存了保留阴性分选的人单核细胞。如果有细胞分选仪，则用CD14、CD64和CD192作为人单核细胞的特异性标志物。

细胞培养

      原代人单核细胞可以在体外培养；然而需要注意的是，在血清或M-CSF存在的5天内，培养的单核细胞将开始分化为巨噬细胞。单核细胞以粘附和非粘附细胞的混合形式生长，粘附细胞的比例取决于培养基和刺激因子（如果添加）。如果使用自体血清，推荐使用RPMI 1640培养基，如补充5%胎牛血清的Gibco先进RPMI 1640培养基。
 

细胞因子和趋化因子表达谱

      在稳态情况下，IL-34和CSF-1促进单核细胞分化和存活，而在炎症期则受GM-CSF的调节。趋化因子（CCL2、CCL3、CCL5）梯度促使单核细胞其从外周血迁移到组织中，在组织中根据不同的刺激分化为巨噬细胞、髓系树突状细胞或破骨细胞。单核细胞是促炎细胞因子的主要来源，如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8，其对病原体的天然免疫反应至关重要。多因子免疫试剂提供了一种有效的方法来检测血浆、血清或细胞培养物中单核细胞相关细胞因子的分泌。Invitrogen多因子检测试剂提供了一个方便的多因子线上选择工具，除了预混合的panel之外，还可以自定义个人多因子panel。

 

表5：参与单核细胞分化、募集和分泌的关键细胞因子。

 

	分化	募集	分泌
细胞因子、趋化因子、生长因子	CSF-1、IL-34、GM-CSF	CCL2、CCL3、CCL5	IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNFα

 

多因子免疫检测试剂

 

 

物种	描述	分析物	货号
人	Immune Monitoring 65-Plex Human Panel	G-CSF (CSF-3), GM-CSF, IFN alpha, IFN gamma, IL-1 alpha, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17A (CTLA-8), IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-31, LIF, M-CSF, MIF, TNF alpha, TNF beta, TSLP, BLC (CXCL13), ENA-78 (CXCL5), Eotaxin (CCL11), Eotaxin-2 (CCL24), Eotaxin-3 (CCL26), Fractalkine (CX3CL1), Gro-alpha (CXCL1), IP-10 (CXCL10), I-TAC (CXCL11), MCP-1 (CCL2), MCP-2 (CCL8), MCP-3 (CCL7), MDC (CCL22), MIG (CXCL9), MIP-1 alpha (CCL3), MIP-1 beta (CCL4), IP-3 alpha (CCL20), SDF-1 alpha (CXCL12), FGF-2, HGF, MMP-1, NGF beta, SCF, VEGF-A, APRIL, BAFF, CD30, CD40L (CD154), IL-2R (CD25), TNF-RII, TRAIL (CD253), TWEAK	EPX650-10065-901
小鼠	Immune Monitoring 48-Plex Mouse ProcartaPlex Panel	BAFF, G-CSF (CSF-3), GM-CSF, IFN alpha, IFN gamma, IL-1 alpha, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-15/IL-15R, IL-17A (CTLA-8), IL-18, IL-19, IL-22, IL-23, IL-25 (IL-17E), IL-27, IL-28, IL-31, IL-33, LIF, M-CSF, RANKL, TNF alpha, ENA-78 (CXCL5), Eotaxin (CCL11), GRO alpha (CXCL1), IP-10 (CXCL10), MCP-1 (CCL2), MCP-3 (CCL7), MIP-1 alpha (CCL3), MIP-1 beta (CCL4), MIP-2, RANTES (CCL5), Betacellulin (BTC), Leptin, VEGF-A, IL-2R, IL-7R alpha, IL-33R (ST2)	EPX480-20834-901

 

 

Pan markers	M2 macrophage	M1 macrophage	Monocyte	Tissue associated macrophage
CD11b CD15 CD33 CD40 CD63 CD68（mature） CD80↑ CD85 CD86↑ CD105↑ CD115 CD169 CD195(CCR5) CD282(TLR2) CD284(TLR4) CD354（Trem-1） CXCL10 CXCL11 CXCL9 GPNMB Mature macrophage marker MIP-2α(CXCL2)	分泌因子 IDO IL-10 TGFβ	分泌因子 IFNγ IL-1α IL-1β IL-6 IL-12 IL-23 TNFα	细胞表面 CD14○ CD33 CD172a(SIRPα)	细胞表面 Axl CD192(CCR2) CD14 CD68 CD115 CD163 CD206 CD369(Dectin-1) HLA-DR CD273(PD-L2)
	细胞表面 CD115 CD204 CD163 CD206(MMR) CD209(DC-SIGN) FcεR1 VSIG4	细胞表面 CD16 CD16/CD32 CD32 CD64 CD68 CD80 CD86 CD369(Dectin-1) Mer（MerTK） MHCⅡ		胞内/转录因子 NOS2
	胞内/转录因子 IRF4 STST6	胞内/转录因子 IRF5 STST1

↑=Upregulated  ↓=Downregulated  ○=Key marker  ●=Subset

 

 

Pan  markers	M2 macrophage	M1 macrophage	Monocyte	Tissue associated macrophage
Axl● CD11b CD16/CD32 CD40 CD64 CD68 CD107(Mac3) CD115 CD282(TLR2) CD284(TLR4) F4/80● Galectin-3(Mac2) GITRL● GPNMB Ly6G(Gr -1) MHC ClassⅡ↑	分泌因子 Arginase IDO IL-10 TGFβ YM1	分泌因子 IFNγ IL-1 IL-6 IL-12 IL-23 TNFα	细胞表面 Ly6c● CSF1R	细胞表面 Axl CD192(CCR2) CD14 CD68 CD115 CD163 CD206 CD369(Dectin-1) HLA-DR CD273(PD-L2)
	细胞表面 CD14 CD115 CD163 CD204 CD206(MMR) CD209(DC-SIGN) CSF1R FcεR1 Ly-6C	细胞表面 CD16 CD16/CD32 CD32 CD64 CD68 CD80 CD86 CD369(Dectin-1) Mer（MerTK） MHCⅡ		胞内/转录因子 NOS2
	胞内/转录因子 IRF4 RELMα STST6	胞内/转录因子 IRF5 STST1

↑=Upregulated  ↓=Downregulated  ○=Key marker  ●=Subset

 

 

此方案描述了从健康C57BL / 6小鼠脾脏分离后巨噬细胞的流式细胞分析。首先解离小鼠脾脏，从而迅速获得单细胞悬液，以备流式细胞分析。

流式细胞仪染色方案

用Viobility Fixable Dye固定染料标记细胞

·  Viobility Fixable Dye预先进行了重组。将小瓶加热到室温以避免水凝结。通过向染色小瓶中添加100 µL无水DMSO，重构一小瓶冻干的Viobility Fixable染料，并混合直至完全溶解。将溶液等分，并在无水（干燥剂）条件下于–20°C储存，并避光长达一个月。

下面给出的体积最多可容纳10⁷个有核细胞。当使用少于10⁷个单元时，请按照指示使用相同的体积。当使用更高的细胞数量时，相应地按比例扩大所有试剂体积和总体积（例如，对于2×10⁷有核细胞，请使用所有指示试剂体积和总体积的两倍体积）。

1.确定细胞数。 

2.通过加入1mL的1×PBS洗涤细胞，并以300×g离心10分钟。上清液被完全吸出。

3.将细胞重悬于100 µL 1×PBS中。

4.加入了1 µL挥发性固定染料。 

5.充分混合样品并避光室温下孵育15分钟。

▲注意：较高的温度和/或较长的孵育时间可能会导致非特异性细胞标记。在冰上工作需要增加孵育时间。

6.通过添加1mL PEB缓冲液洗涤细胞，并以300×g离心10分钟。上清液被完全吸出。

7.重复步骤6。 

8.进行表面染色。

表面染色

· 下面给出的体积用于多达106个有核细胞。当使用少于106个单元时，请按照指示使用相同的体积。当使用更高的细胞数时，相应地按比例增加所有试剂的体积和总体积（例如，对于2×106有核细胞，请使用所有指示试剂体积和总体积的两倍体积）。

1.确定细胞数。 

2.将细胞以300×g离心10分钟。上清液被完全吸出。 

3.根据相应抗体数据表中列出的稀释度，制备了与除CD68抗体以外的所有抗体-荧光染料偶联物的预混液。

▲注意：CD68是一种细胞内标记物，将在固定和透化细胞后被检测到。 

4.将100 µl抗体预混液添加到细胞中。 

5.将细胞重悬，并在黑暗中于4°C孵育10分钟。 

6.通过添加1mL PEB缓冲液洗涤细胞，并在4℃以300×g离心5分钟。上清液被完全吸出。 

7.进行细胞内染色。

细胞内染色

· 试剂是新鲜制备的。否则可能会导致结果欠佳。 预先计算了所需的总缓冲区量；体积将取决于要分析的细胞数量以及要执行的测试数量。

1.将先前已被表面标记染色的细胞重悬于来自Inside Stain Kit的250 µL Inside Fix溶液中。

2.充分混合细胞，并在室温下孵育20分钟。 

3.将细胞以300×g离心5分钟。

4.完全吸出上清液，将沉淀重悬于1 mL PEB缓冲液中。 

5.将细胞以300xg离心5分钟，并完全吸出上清液。 

6.根据相应的数据表，在Inside Perm中将CD68抗体稀释至最终体积100 µL，然后添加到细胞中。 

7.将细胞悬浮液在室温下孵育10分钟。 

8.加入1mL的Inside Perm缓冲液，并将细胞以300xg离心5分钟。 

9.完全吸去上清液，将沉淀重悬于0.5-1 mL PEB缓冲液中。

10.流式细胞仪分析是使用分析仪进行的。

 

流式分析

 

小鼠脾脏的红髓巨噬细胞的分析。 使用先前的方案对来自C57BL / 6小鼠的脾细胞进行染色。 首先使用FSC-H / FSC-A门控对单个细胞进行门控，使用Viobility负门控对活细胞进行门控（数据未显示）。 CD45 +红髓巨噬细胞（A）缺乏T，B和NK细胞谱系标记CD3，CD19和CD335（B）的表达，并表达CD11b，F4 / 80和CD68（C）。 另外，红髓巨噬细胞还特征性表达Mer和CD64（D）。

 

相关抗体

 

靶标	克隆号	目的	荧光	货号
CD11b	M1/70	巨噬细胞	eFluor 450	48-0112-82
F4/80	BM8	红髓巨噬细胞	FITC	11-4801-82
CD68	FA-11	红髓巨噬细胞	PE	12-0681-82
CD3ε	145-2C11	细胞类型排除	PE-eFluor 610	61-0031-82
CD19	eBio1D3 (1D3)	细胞类型排除	PE-eFluor 610	61-0193-82
CD335 (NKp46)	29A1.4	细胞类型排除	PE-eFluor 610	61-3351-82
CD64	X54-5/7.1	细胞类型排除	PerCP-eFluor 710	46-0641-82
CD45	30-F11	红髓巨噬细胞	APC-eFluor 780	47-0451-82
Mer	REA477	白细胞	APC	130-107-479

 

 

      本申请方案描述了健康C57BL/6小鼠脾脏分离后单核细胞的流式细胞分析。使用温和的MACS解离仪可轻松解离小鼠脾脏，快速获得可用于流式细胞分析的活单细胞悬液。

用Viobility™固定染料标记细胞

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      预先重构Viobions固定染料。将小瓶温热至室温以避免水冷凝。通过向染料小瓶中加入100 μL无水DMSO并混合将一个小瓶冻干的Viociency固定染料重构并混合直至完全溶解。将溶液等分并在无水（干燥剂）条件下在-20℃下储存，并保护溶液免于光达1个月。

      下面给出的体积最多为高达10⁷个核细胞。在使用少于10⁷个单元格时，请按照所示使用相同的体积。当使用更高的细胞数时，相应地扩大所有试剂体积和总量（例如，对于2×10⁷核细胞，使用所有指示的试剂体积和总量的两倍）。

1.确定细胞数。

2.通过加入1mL 1×PBS洗涤细胞，并以300×G离心10分钟。上清液完全吸出来。

3.将细胞重悬于100μl1×PBS中。

4.加入1μLViocienct固化染料。

5.将样品混合良好，在室温下在黑暗中孵育15分钟。

▲注意：较高的温度和/或较长的孵育时间可能导致非特异性的细胞标记。在冰上工作需要增加孵化时间。

6.加入1ml PEB缓冲液洗涤细胞，并以300×g离心10分钟。上清液完全吸出来。

7.重复步骤6。

8.进行表面染色。

表面染色

---

      下面给出的体积最多为10⁶个核细胞。 在使用少于10⁶个单元格时，请使用相同的卷如图所示。 当使用更高的细胞数时，相应地扩大所有试剂体积和总量（例如，对于2×10⁶核细胞，使用所有指示的试剂体积和总量的两倍）。

1.确定细胞数。

2.将细胞以300×g离心10分钟。 上清液完全吸出来。

3.根据各抗体数据片中提到的稀释液制备具有所有抗体的主混合物。

4.向细胞中加入100μl抗体母料混合物。

5.重新悬浮细胞并在4℃下在黑暗中孵育10分钟。

6.通过加入1ml PEB缓冲液洗涤细胞，并在4℃下以300×g离心5分钟。 上清液完全吸出来。

7.将细胞重悬于100μl的PEB缓冲液中，并使用MACSQUANT^®分析仪进行流式细胞术分析。

流式图

      门控策略显示小鼠脾脏分析单核细胞。 使用先前描述的面板染色来自C57BL / 6小鼠的脾细胞。 使用Viocility-负栅极（数据未示出），使用FSC-H / FSC-A网和活细胞上最初在单细胞上进行样品。 CD45 ⁺单核细胞（a）缺乏F4 / 80（b）的表达以及T，B和NK细胞谱系标记物（CD3，CD19，CD335; c），同时表达高水平的CD11b和Ly6c（c，d）。 此外，趋化因子受体CD192的表达的分析有助于鉴定小鼠脾（D）内的单核细胞。

相关产品

Specificity	Clone	Purpose	Fluorochrome	货号
CD11b	M1/70	Monocytes	eFluor 450	48-0112-82
F4/80	BM8	Cell type exclusion	FITC	11-4801-82
CD3e	145-2C11	Lineage	PE-eFluor 610	61-0031-82
CD19	eBio1D3 (1D3)	Lineage	PE-eFluor 610	61-0193-82
CD335 (NKp46)	29A1.4	Lineage	PE-eFluor 610	61-3351-82
Ly-6C	RB6-8C5	Monocytes	PE-Cyanine7	25-5931-82
CD45	RA3-6B2	Leukocytes	APC-eFluor 780	47-0452-82

 

ED克隆抗鼠抗体已经被专门设计用来识别巨噬细胞。 然而，许多ED克隆在磁极淋巴组织中也特定表达于其他细胞类型，如髓系细胞和网状元素。

 

CD68（克隆号：ED1）

CD68(Macrosialin)单克隆抗体(MA5-28262)克隆号：ED1是一种广泛应用的Pan-巨噬细胞标记物，识别CD68，一种90-110kda的单链糖蛋白。CD68(Macrosialin)是一种110k Da全膜糖蛋白，主要在单核细胞和巨噬细胞的细胞内溶酶体上表达，树突状细胞和外周血粒细胞上有较小程度的表达。 此外，CD68可以在组织巨噬细胞的吞噬活性中发挥作用，无论是在细胞内溶酶体代谢中，还是在细胞外-细胞和细胞-病原体相互作用中。 在扁桃体和一些组织细胞淋巴瘤或组织细胞增多症，急性髓系白血病(AML)和粒细胞肉瘤中，CD68通过间质网状细胞表达。 在各种人恶性肿瘤中，CD34细胞中CD68的表达升高，包括几项急性髓样白血病研究

CD163（克隆号：ED2）

单克隆抗体( MA5-16656)克隆号ED2，识别CD163，这是一种175kDa细胞表面糖蛋白，存在于大鼠巨噬细胞上。 该抗体是检测肝脏滑膜衬里和Kupffer细胞的有用工具。 也可用于鉴别胸腺皮质巨噬细胞(ED2+ve)和胸腺髓质巨噬细胞(ED2-ve)。 然而，CD163在单核细胞、肺泡巨噬细胞或小胶质细胞上不表达的。

CD169（克隆号：ED3）

单克隆抗体(MA1-80164)克隆号：ED3，识别大鼠CD169细胞表面抗原，这是一种由巨噬细胞表达的185kDa分子，主要局限于淋巴器官。 CD169是含有唾液酸的糖结合物的受体。 ED3抗体强烈地染色脾脏边缘区巨噬细胞和边缘金属团。 在自身免疫性疾病组织中，如与多发性硬化症相关的组织中，CD169也在巨噬细胞中表达。

Follicular Dendritic Cells（FDC） 标记（克隆号：ED5）

FDCs是初级和淋巴组织生发中心(GCS)的大细胞。 它们通过选择过程呈现非处理抗原，并关闭B细胞的凋亡，从而选择记忆B细胞。FDC在各种传染病如艾滋病和传染性海绵状脑炎中发挥作用。单克隆抗体(MA5-16663)克隆号：ED5，染色显示B细胞滤泡中的网状模式，代表滤泡树突状细胞。 肾脏中的Mesangial细胞也被ED5克隆抗体阳性染色。

CD11b（克隆号：ED7）

M小鼠抗大鼠CD11b抗体（MA1-80560）克隆号：ED7，识别大鼠巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和粒细胞上的膜抗原。CD11b(整合素α-M，ITGAM，整合素α-X，ITGAX)是一种165kDa的粘附分子，与整合素β-2(CD18)非共价结合)。 CD11b/CD18异二聚体复合物也称为整合素α-Mβ-2、Mac-1和CR3（补体受体3）。 CD11b在单核/巨噬细胞、粒细胞、活化淋巴细胞、NK细胞的一个亚群、树突状细胞的一个亚群和大脑中的小胶质细胞表面表达。 CD11b/CD18作为ICAM-1(CD54)、ICAM-2(CD102)、ICAM-4(CD242)、CD14、CD50、CD23、肝素、IC3b、纤维蛋白原和因子X的受体，是细胞与细胞和细胞基质相互作用的关键。 CD11b在8%的脾细胞、44%的骨髓细胞和不到1%的胸腺细胞上表达，在神经组织中通常用作小胶质细胞的标记。CD11b的表达在单核细胞成熟过程中增加，但在组织巨噬细胞上的表达水平不同。 此外，据报道，腹腔巨噬细胞表达的CD11b水平高于脾巨噬细胞。 与CD11b功能障碍相关的疾病包括系统性红斑狼疮6和ITGAM相关的易感的系统性红斑狼疮。

CD172a（克隆号：ED9）

单克隆抗体(MA5-16664)克隆号：ED9，识别大鼠CD172a。Sirpα(CD172a，信号调节蛋白α)是一种在髓系起源细胞，包括粒细胞、树突状细胞(DCS)、巨噬细胞、肥大细胞和造血干细胞上表达的受体型跨膜糖蛋白。 Sirpα作为几种激活的酪氨酸激酶的底物，包括EGFR、PDGFR、SRC和胰岛素受体，参与受体酪氨酸激酶偶联信号通路的负调控。Sirpα与整合素相关蛋白CD47的配体结合导致Sirpα细胞质区免疫受体酪氨酸抑制基序(Iitms)酪氨酸激酶磷酸化，介导酪氨酸磷酸酶shp-1和shp-2的募集和激活。 将Sirpα与CD47连接已在几个调控过程中得到证实，包括巨噬细胞抑制宿主细胞吞噬和T细胞和DCS的双向激活。Sirpα对血清、生长因子、胰岛素、癌基因、生长激素和细胞粘附诱导的细胞反应有调节作用，在不同的生理和病理过程中起着普遍的作用。 癌细胞高度表达CD47，激活Sirpα，抑制巨噬细胞介导的癌细胞生长破坏。