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粒细胞研究
粒细胞研究
1.粒细胞概述
粒细胞是什么？
粒细胞是一种异质性白细胞，其包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞。它们是天然免疫细胞，一旦被活化，就会释放免疫刺激分子来抵抗病毒和寄生虫感染。粒细胞依靠炎症信号将其募集到损伤、感染或过敏反应的部位，从而将其活化并具有效应功能。除了能对病毒和寄生虫感染反应之外，粒细胞还参与多种疾病，包括慢性炎症、哮喘、过敏、免疫调节、自身免疫和癌症。
粒细胞的特征胞浆中存在分泌性细胞毒性颗粒，并且为多形核。粒细胞中数量最多的是中性粒细胞（约占人体循环白细胞的60%，小鼠的20%），其次是嗜酸性粒细胞（循环白细胞的1%-3%，约占骨髓循环白细胞的6%），而嗜碱性粒细胞是最少的细胞（约占循环白细胞的<1%）。肥大细胞主要是组织驻留细胞。
粒细胞的类型
中性粒细胞
一种杀微生物的粒细胞，能吞噬病原体以及对DAMP或PAMP做出反应[2]。它们通过分泌细胞因子将其他免疫细胞募集到炎症部位，从而进行免疫调节。
形态：未成熟中性粒细胞为增生性细胞，核圆形且初始凹陷，胞浆颜色较浅成熟细胞有深色多叶核。
丰度：最数量最多的的细胞，约占人体循环白细胞的60%，小鼠的20%。
嗜酸性粒细胞
提供宿主对寄生虫感染和过敏性疾病的反应。在感染过程中，它们通过脱颗粒作用释放储存在细胞质颗粒中的阳离子蛋白。可以释放细胞因子（包括IL-10和IL-4）来调节免疫反应。
形态：大型双叶核，并带有细胞颗粒。在流式细胞分析中显示高的侧向散射（SSC）。
丰度：数量位居第二的细胞，占循环白细胞的1-3%，约占骨髓的6%。
嗜碱性粒细胞
在PAMP活化或IgE交联后过敏和宿主对寄生虫的反应中发挥作用。是唯一含有组胺并分泌包括IL-4在内的某些细胞因子的循环白细胞。
形态：大型细胞质颗粒。
丰度：数量最少的细胞，占循环白细胞的<1%。
肥大细胞
与过敏反应有关，但也已证明其具有保护作用，特别是对寄生虫和环境毒素（如毒液）的免疫。与嗜碱性粒细胞一样，肥大细胞可表达FcεRI，它结合IgE免疫球蛋白的Fc区域，而IgE免疫球蛋白是为了应对寄生虫感染和过敏原而分泌的[6]。参与组织修复和维护。
形态：模糊的细胞核边界以及致密的颗粒状细胞质。
丰度：组织中肥大细胞的不多。粘膜液中发现有长效组织驻留细胞。
粒细胞分离和流式细胞术分析
粒细胞是从血液、骨髓或组织中分离出来的终末分化细胞。流式细胞分析仪可用于确定活化粒细胞的数量。用于分离细胞的方法会严重影响粒细胞的非特异性活化[1]。
中性粒细胞
通常通过密度梯度离心的方法将嗜中性粒细胞从全血中分离出来，而不是从骨髓中分离出来。
嗜酸性粒细胞
最容易获得人和小鼠体内嗜酸性粒细胞的来源是血液，而骨髓中的嗜酸性粒细胞数量最多。通过适当的蛋白酶消化组织，可从大多数组织中获得组织驻留的嗜酸性粒细胞。嗜酸性粒细胞的另一个来源是从过敏性哮喘模型小鼠中获得的支气管肺泡灌洗液。流式细胞分析仪和分选仪可用于分型和分离。
嗜碱性粒细胞
流式细胞分析仪和分选仪应用于嗜碱性粒细胞的分型和分离。也可以在IL-3存在的情况下从骨髓细胞中培养得到小鼠嗜碱性粒细胞，尽管已观察到这样会导致产生的细胞的表型和功能有差异。
肥大细胞
从组织或腹膜腔中分离的肥大细胞活动度非常高，而且通常数量很少。转化的肥大细胞系的发育已被用作模型。目前已经有从骨髓细胞分化成小鼠肥大细胞或从骨髓、脐血或胎儿肝细胞分化成人类肥大细胞的方案，通常都涉及IL-3、SCF或两者都需要培养较长的时间。然而，这些培养的细胞不能完全替代组织驻留的肥大细胞，因为很难在体外重现这些细胞分化所在的微环境。
表 1.流式细胞术分型的粒细胞标记物清单
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细胞亚群 |
标志物 |
定位 |
物种 |
|---|---|---|---|
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泛粒细胞 |
表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人 |
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表面 |
人 |
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表面 |
小鼠 |
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表面 |
人 |
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表面 |
人 |
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中性粒细胞 |
弹性蛋白酶 |
分泌 |
人和小鼠 |
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乳铁蛋白 |
分泌 |
人和小鼠 |
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分泌 |
人和小鼠 |
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分泌 |
人和小鼠 |
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分泌 |
人和小鼠 |
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IL-1α/β |
分泌 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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CD112（连接蛋白-2） |
表面 |
人和小鼠 |
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CD114 （G-CSFR） |
表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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CD181 （CXCR1） |
表面 |
人和小鼠 |
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CD282 （TLR2） |
表面 |
人和小鼠 |
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CD284 （TLR4） |
表面 |
人和小鼠 |
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CD286 （TLR6） |
表面 |
人和小鼠 |
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Ly-6G （Gr-1） |
表面 |
关键表型标志物：小鼠 |
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钙卫蛋白（S100A8/A9） |
表面 |
人 |
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CD281 （TLR1） |
胞内 |
人和小鼠 |
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CD289 （TLR9） |
胞内 |
人和小鼠 |
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肥大细胞 |
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组织蛋白酶 |
分泌 |
人和小鼠 |
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组胺 |
分泌 |
人和小鼠 |
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分泌 |
人和小鼠 |
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分泌 |
人和小鼠 |
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TGFβ |
分泌 |
人和小鼠 |
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分泌 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
关键表型标志物：人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
关键表型标志物：人和小鼠 |
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IL-33R（ST-2） |
表面 |
人和小鼠 |
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嗜碱粒细胞 |
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分泌 |
人和小鼠 |
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分泌 |
人和小鼠 |
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组胺 |
分泌 |
人和小鼠 |
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CCL3（MIP-1α） |
分泌 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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CD88 （C5a受体） |
表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
关键表型标志物：人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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CD154（CD40配体） |
表面 |
人和小鼠 |
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CD192 （CCR2） |
表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人 |
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CD218 （IL-18R） |
表面 |
人和小鼠 |
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CD282 （TLR2） |
表面 |
人和小鼠 |
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CD284 （TLR4） |
表面 |
人和小鼠 |
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CD286 （TLR6） |
表面 |
人和小鼠 |
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CD294 (CRTH2) |
表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
关键表型标志物 |
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CD281 （TLR1） |
细胞内 |
人和小鼠 |
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CD289 （TLR9） |
胞内 |
人和小鼠 |
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C/EBPα |
胞内 |
人和小鼠 |
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GATA-2 |
胞内 |
人和小鼠 |
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嗜酸性粒细胞 |
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分泌 |
人和小鼠 |
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分泌 |
人 |
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分泌 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
关键表型标志物：人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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CD170（SiglecF） |
表面 |
关键表型标志物：人和小鼠 |
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CD193 （CCR3） |
表面 |
关键表型标志物：人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
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表面 |
人和小鼠 |
在流式细胞仪中，基于FSC/SSC的形态学很容易分辨粒细胞（图1）。如果根据紫光散射特性对白细胞设门，则可将人血液中的三种主要白细胞群体（淋巴细胞、单核细胞和粒细胞）区分开来。
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图 1.在Invitrogen Attune Nx流式细胞仪上使用紫光散射鉴定人全血中的白细胞。如果根据紫光散射特性对白细胞设门，则可将人血液中的三种主要白细胞（淋巴细胞、单核细胞和粒细胞）分开来。 通过在白细胞群周围画一个多边形门，然后绘制紫色SSC与蓝色FSC的对比图，将白细胞分为粒细胞、单核细胞和淋巴细胞。
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图 2.使用细胞标志物CD15鉴定粒细胞。CD15或Lewis X是粒细胞表达的3-岩藻糖基-N-乙酰乳糖胺碳水化合物。用小鼠IgM同型对照物APC（货号17-4752-80）（蓝色直方图）或抗人CD15 APC （货号17-0158-42）（紫色直方图）正常人外周血细胞进行染色。对粒细胞设门进行分析。
粒细胞细胞因子和趋化因子表达谱
中性粒细胞：当受到IFNγ的正向调节或受到IL10的负向调节时，活化的中性粒细胞可以分泌多种细胞因子。由于人中性粒细胞的总RNA通常比其他白细胞的总RNA少几倍，所以每个中性粒细胞生成的细胞因子量明显低于其他白细胞。
嗜碱性粒细胞：细胞因子IL-3可作为一种有效的造血生长因子，参与骨髓祖细胞的分化和嗜碱性粒细胞的活化。嗜碱性粒细胞可分泌IL-4、TSLP、IL-13和IL-25，这些细胞因子可促进Th2功能，并有助于免疫球蛋白特别是IgE的合成。
嗜酸性粒细胞：IL-5是一种有效的造血生长因子，其可活化嗜酸性粒细胞，并与IL-3和GM-CSF协同作用，促进成熟嗜酸性粒细胞的发育。嗜酸性粒细胞趋化因子1、2和3是嗜酸性粒细胞向肺部和肠道等身体部位迁移的有效化学诱导剂。据报道，嗜酸性粒细胞能分泌超过30种细胞因子，其中一些是被预先合成并储存在嗜酸性粒细胞晶体颗粒中。
肥大细胞：小鼠和人肥大细胞已被确认能分泌许多的细胞因子、趋化因子和生长因子，参与介导过敏性疾病以及天然和适应性免疫反应。虽然大多数细胞因子也由许多其他细胞生成，但肥大细胞的分泌可能取决于肥大细胞的特定功能，如抵抗寄生虫感染、细菌感染、病毒感染、食物过敏和粘膜部位过敏。
多因子免疫试验提供了一种方便且经济的方法来分析与粒细胞相关的细胞因子、趋化因子和生长因子。全面的Immune Monitoring 65-Plex Human Panel是市面上最常用的多重免疫试验试panel，它是监测粒细胞分泌细胞因子的有效方法。
表2：肥大细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞分泌的关键细胞因子。
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肥大细胞 |
嗜碱粒细胞 |
中性粒细胞 |
嗜酸性粒细胞 |
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|---|---|---|---|---|
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细胞因子、趋化因子、生长因子 |
CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL9, CCL10, CCL17, CXCL2, CXCL8, CXCL10, TNF, IL-1beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-11, IL-13, IL-16, IL-33, G-CSF, NGF, FGF, PDGF, SCF, TGF-beta1, VEGF |
IL-4, IL-13, MIP-1α, TSLP, IL-25, IL-6, CCL5, CCL3, VEGF, GM-CSF, IL-3 |
TNF-alpha, IL-4, IL-10, IFN-gamma, CCL5, IL-1alpha, IL-1beta, IL-6, CCL3, IL-8, CXCL1, CXCL8, CXCL10, CCL2, VEGF, G-CSF, FasL, TRAIL, BAFF |
CCL5, CCL3, IL-6, NGF, MBPs, eosinophIL-derived neurotoxin (EDN), EPX, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-16, IL-17, IL-25, IFN-gamma, TNF-alpha, CCL11, CCL13, CCL17, CXCL1, CXCL5, CXCL8, CXCL10, CXCL11, CXCL9, SCF, VEGF, TGF-beta, TGF-alpha |
表 3.用于免疫监测的多因子免疫试剂。
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物种 |
描述 |
分析物 |
货号 |
|---|---|---|---|
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人 |
Immune Monitoring 65-Plex Human Panel |
G-CSF (CSF-3), GM-CSF, IFN alpha, IFN gamma, IL-1 alpha, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17A (CTLA-8), IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-31, LIF, M-CSF, MIF, TNF alpha, TNF beta, TSLP, BLC (CXCL13), ENA-78 (CXCL5), Eotaxin (CCL11), Eotaxin-2 (CCL24), Eotaxin-3 (CCL26), Fractalkine (CX3CL1), Gro-alpha (CXCL1), IP-10 (CXCL10), I-TAC (CXCL11), MCP-1 (CCL2), MCP-2 (CCL8), MCP-3 (CCL7), MDC (CCL22), MIG (CXCL9), MIP-1 alpha (CCL3), MIP-1 beta (CCL4), IP-3 alpha (CCL20), SDF-1 alpha (CXCL12), FGF-2, HGF, MMP-1, NGF beta, SCF, VEGF-A, APRIL, BAFF, CD30, CD40L (CD154), IL-2R (CD25), TNF-RII, TRAIL (CD253), TWEAK |
EPX650-10065-901 |
|
小鼠 |
Immune Monitoring 48-Plex Mouse ProcartaPlex Panel |
BAFF, G-CSF (CSF-3), GM-CSF, IFN alpha, IFN gamma, IL-1 alpha, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-15/IL-15R, IL-17A (CTLA-8), IL-18, IL-19, IL-22, IL-23, IL-25 (IL-17E), IL-27, IL-28, IL-31, IL-33, LIF, M-CSF, RANKL, TNF alpha, ENA-78 (CXCL5), Eotaxin (CCL11), GRO alpha (CXCL1), IP-10 (CXCL10), MCP-1 (CCL2), MCP-3 (CCL7), MIP-1 alpha (CCL3), MIP-1 beta (CCL4), MIP-2, RANTES (CCL5), Betacellulin (BTC), Leptin, VEGF-A, IL-2R, IL-7R alpha, IL-33R (ST2) |
EPX480-20834-901 |
2.血液细胞分类
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人外周血白细胞 (A) 用CD45染色后，依据CD45的表达水平呈现分离的三个细胞群：粒细胞 (P1)、单核细胞(P2)和淋巴细胞(P3) 。 (B) FSC和 SSC散点图. *检测CD45 表达和FSC、SSC分析能够帮助鉴别区分你所感兴趣的细胞群 Im, M. et al. |
造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)细胞因子：SCF, TPO, Flt3 ligandMarkers:人：CD34+, CD90+,, Lin-, CD38-/low, CD45RA-, CD49f+小鼠: Lin-, CD117+, Sca-1+
磁珠分选kit：人：小鼠：
培养基：
小分子抑制剂：StemRegenin 1 (SR1), UM171, GW9662 |
Lymphoid progenitor细胞因子：SCF, IL-7Markers:人：小鼠：
磁珠分选kit：人：小鼠：
培养基：
小分子抑制剂：
|
B cell lineageSCF, IL-1β, IL-6， IL-7， IL-11， IL-12Markers:人：CD19+小鼠: CD19+磁珠分选kit：人：小鼠：
培养基： |
Activated B细胞TGF-β1, BAFF, IL-2, IL-4, IFN-γ, CD40L, anti-CD40, anti-CD180, anti IgM/IgD |
Plasma cell
Markers:人：CD138+小鼠：CD138+ |
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NK cell LineageSCF, IL-2, IL-12Markers:人: CD3-, CD16+, CD56+小鼠: CD3-, CD49b+磁珠分选kit：人：小鼠：
培养基：
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Activated NK细胞IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 |
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T cell Lineage:细胞因子：SCF, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-7Markers:人：CD3+, CD56-小鼠: CD3+, CD49b-磁珠分选kit：人：小鼠：
培养基：
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NK T细胞IL-2, IL-7, IL-15, CD137L, anti CD3, anti CD28
Markers:人：CD3+, CD56+小鼠： |
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γδ T细胞IL-2, IL-7, IL-15, CD137L, anti CD3, anti CD28 |
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CD4 naïve T细胞IL-2, IL-7, IL-15, CD137L, anti CD3, anti CD28Markers: CD3, CD4, TCRα/β, CD62L, CD197 (CCR7), CD45RA, CD45RBHuman:CD4+CD45RA+CD45RO-, CD8-, CD14-, CD16-, CD19-, CD20-, CD36-, CD56-, CD66b-, CD123-, TCRγ/δ-, CD235a- |
Th1细胞IL-2, anti CD3, anti CD28, IL-12, IL-18, IL-27, IFN-γ, anti IL-4Markers: CD3, CD4, CD119 (IFN-γ Ra), CD183 (CXCR3), CD195 (CCR5), CD218a (IL-18Ra)， LT-βR， CD366 (Tim-3) |
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Th2细胞IL-2, anti CD3, anti CD28, IL-4, IL-6,IL-31,IL-33,TSLP, IL-25, anti IFN-γ, anti-IL-12/IL-23P40Markers: CD3, CD4, CD119 (IFN-γ Ra), CD193 (CCR3), CD194 (CCR4), CDw198 (CCR8)， CRTH2， IL-33Ra, CD365 (Tim-1) |
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Th17细胞IL-2, anti CD3, anti CD28, TGF-β1, IL-1β, IL-6, IL-21, IL-23, anti IL-2, anti L-4, anti IFNγMarkers: CD3, CD4, TCRα/β, CD161, CD194 (CCR4), CD196 (CCR6)， IL-23R |
||||||
Treg 细胞IL-2, anti CD3, anti CD28, TGF-β1Markers: CD3, CD4, CD25, FoxP3 |
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Th9细胞IL-2, anti CD3, anti CD28, TGF-β1，IL-4， anti IFN-γMarkers: CD3, CD4, TCR a/β |
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Tfh 细胞IL-2, anti CD3, anti CD28, IL-6, IL-21, CXCL13Markers: CD3, CD4, TCRα/β, CD84, CD126(IL-6Ra),CD150 (SLAM),CD154 (CD40L), CD185 (CXCR5), CD252 (OX40L), CD278 (ICOS), CD279 (PD1) |
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Th22 细胞IL-2, anti CD3, anti CD28, IL-6, TNF-αMarkers: CD3, CD4, TCRα/β, CD194 (CCR4), CD196 (CCR6)， CCR10 |
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CD8 naïve T细胞IL-2, IL-7, IL-15, CD137L, anti CD3, anti CD28Markers: Human: CD8+CD45RA+CCR7+CD45RO-CD57-CD56-, CD4-, CD14-, CD16-, CD19-, CD20-, CD36-, CD94-, CD123-, CD244-, TCRγ/δ-, CD235a-
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Treg细胞IL-2, IL-7, IL-15, CD137L, anti CD3, anti CD28Markers: CD3, CD4, CD25, FoxP3 |
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Megakaryocyte erythrocyte progenitor细胞因子：SCF, IL-3， TPOMarkers:人：小鼠：磁珠分选kit：人：小鼠：
培养基：
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Megakaryocyte lineage（巨核细胞系）IL-3, GM-CSF, TPOMarkers:人：小鼠：磁珠分选kit：人：小鼠：
培养基：
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platelets (Resting)Markers:人: CD42b+小鼠: CD41+ |
platelets (activated)Markers:人: CD62p+小鼠: CD62p+ |
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Erythroid lineageIL-3， GM-CSF, EPOMarkers:人：小鼠：磁珠分选kit：人：小鼠：
培养基：
|
Red blood cells 红细胞Markers:人: CD235a+小鼠：Ter119+ |
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Common myeloid progenitor
IL-3, IL-6, G-CSF, GM-CSF, EPO
Markers:人：小鼠：
|
Monocytic lineageIL-3, IL-4, M-CSF, GM-CSFMarkers:人：CD14+, CD16±, CD64+小鼠: CD11bhi, CD115hi, Gr-1lo, Ly-6C± |
OsteoclastM-CSF, RAK-L |
||||
MacrophageFlt3 ligand, M-CSF, GM-CSF, IL-34
Markers:人：CD11b+, CD68+, CD163+小鼠：F4/80+, CD68+ |
Mature macrophageTNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-1β, IL-13 |
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Dendritic cell（DC）IFN-γ, IL-4, GM-CSF, Flt3 ligand, IL-34Markers:人：CD1c+, CD83+, CD141+, CD209+, MHC Ⅱ+小鼠: CD11c+, MHC Ⅱ+ |
Mature dendritic cellIL-1β, TNF-a， IL-6, IL-23, CD40L |
|||||
Basophilic lineageIL-3, IL-4, IL-10, TSLPMarkers:人：2D7 antigen, CD117-, CD123+, CD203c+ , FcεRIα+小鼠: CD200R3+, FcεRIα+ |
||||||
Eosinophilic lineageIL-3, IL-4, GM-CSF, IL-5Markers:人：CD11b+, CD193+, EMR1+, Siglec-8, (CD16-CD66b+CD45+)小鼠：CD11b+, CD193+, F4/80+, Siglec-F+ |
||||||
Neutrophilic lineageIL-3, IL-4, GM-CSF, G-CSFMarkers:人：CD15+, CD16+, CD49d-小鼠：CD11b+， CD115-, Ly-6B.2, Ly-6clo/neg, Ly6G+, Gr-1+ |
||||||
Mast cell lineageIL-3, IL-4, SCF, TGF-ß1Markers:人：小鼠： |
||||||
图例：
Human CD4 Memory T cell: CD4+CD45RA-CD45RO+,CD8-, CD14-, CD16-, CD19-, CD20-, CD36-, CD56-, CD123-, CD235a-, γδ TCR-
磁珠分选kit：
Human CD8 Memory T cell: CD8+CD45RA-CD45RO+, CD4-, CD14-, CD11b-, CD19-, CD20-, CD16-, CD36-, CD56-, CD123-, CD235a-，γδ TCR-
磁珠分选kit：
3.人粒细胞 markers
Human
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Pan markers |
Mast |
Neutrophil |
Basophil |
Eosinophil |
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CD11b CD13 CD15 CD32 CD33 |
分泌因子 Cathepsins Histamine TNFα IL-4 TGFβ NGF |
分泌因子 Elastase Lactoferrin IL-6 IL-12 TNFα IL-1 α/β |
分泌因子 Histamine IL-4 IL-13 CCL3(MIP-1α) |
分泌因子 MBPs EDN EPX |
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细胞表面 CD9 CD15 CD24 CD35 CD43 CD64 CD116 CD117(c-kit)○ CD123 CD125 CD126 FcεR1○ IL-33R（ST-2) |
细胞表面 CD10 CD15 CD17 CD24 CD35 CD43 CD66a CD66b○ CD66c CD66d CD89 CD93 CD112 CD114 CD116 CD157 CD177 CD181(CXCR1) CD282(TLR2) CD284(TLR4) CD286(TLR6) Calprotectin（S100A8/A9）
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细胞表面 Basophil Marker CD9 CD11a CD13 CD16 CD25 CD33 CD38 CD43 CD88 CD123○ CD125 CD154 CD192 CD203c CD218(IL-18R)
CD282(TLR2) CD284(TLR4) CD286(TLR6) FcεR1○
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细胞表面 CD9 CD15 CD24 CD35 CD43 CD64 CD116 CD123 CD125○ CD126 CD193(CCR3)○ CD244 FcεR1○
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胞内/转录因子 CD281(TCR1) CD289(TCR9) |
胞内/转录因子 C/EBPα CD281(TCR1) CD289(TCR9) GATA2 |
↑=Upregulated ↓=Downregulated ○=Key marker ●=Subset
4.小鼠粒细胞 markers
Mouse
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Pan markers |
Mast |
Neutrophil |
Basophil |
Eosinophil |
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CD11b CD16/CD32 |
分泌因子 Cathepsins Histamine TNFα IL-4 TGFβ NGF |
分泌因子 Elastase Lactoferrin IL-6 IL-12 TNFα IL-1 α/β |
分泌因子 Histamine IL-4 IL-13 CCL3(MIP-1α) |
分泌因子 MBPs EPX |
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细胞表面 CD9 CD15 CD24 CD35 CD43 CD64 CD116 CD117(c-kit)○ CD123 CD125 CD126 FcεR1○ IL-33R（ST-2) |
细胞表面 CD10 CD15 CD17 CD24 CD35 CD43 CD66a○ CD66b CD66d CD89 CD93 CD112(Nectin-2) CD114(G-CSFR) CD116 CD157 CD177 CD181(CXCR1) CD282(TLR2) CD284(TLR4) CD286(TLR6) Ly-6G(Gr-1)○ |
细胞表面 CD9 CD11a CD13 CD25 CD33 CD38 CD43 CD88(C5a receptor) CD123 CD125 CD154(CD40 ligand) CD192(CCR2) CD218(IL-18 receptor)
CD282(TLR2) CD284(TLR4) CD286(TLR6) CD294(CRTH2) FcεR1○ |
细胞表面 CD9 CD15 CD24 CD35 CD43 CD64 CD116 CD123 CD125 CD126 CD170（SiglecF）○ CD193(CCR3)○ CD244 FcεR1 |
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胞内/转录因子 CD281(TCR1) CD289(TCR9) |
胞内/转录因子 CD281(TCR1) CD289(TCR9) C/EBPα GATA-2 |
↑=Upregulated ↓=Downregulated ○=Key marker ●=Subset
5.流式细胞术对小鼠脾脏嗜碱性粒细胞的免疫分型
本方案描述了健康C57BL/6小鼠脾脏分离后嗜碱性粒细胞的流式细胞分析。使用温和的MACS解离仪可轻松解离小鼠脾脏，快速获得可用于流式细胞分析的活单细胞悬液。
用紫外可固定染料标记细胞
Viobility Fixable Dye预先进行了重组。 将小瓶加热到室温以避免水凝结。 通过向染色小瓶中添加100 µL无水DMSO，重构一小瓶冻干的Viobility Fixable染料，并混合直至完全溶解。 将溶液等分，并在无水（干燥剂）条件下于–20°C储存，并避光长达一个月。
下面给出的体积最多可容纳107个有核细胞。 当使用少于107个单元时，请按照指示使用相同的体积。 当使用更高的细胞数量时，相应地按比例扩大所有试剂体积和总体积（例如，对于2×107有核细胞，请使用所有指示试剂体积和总体积的两倍体积）。
1.确定细胞数。
2.通过加入1mL的1×PBS洗涤细胞，并以300×g离心10分钟。
3.上清液被完全吸出。
4.将细胞重悬于100 µL 1×PBS中。
5.加入了1 µL挥发性固定染料。充分混合样品并在黑暗中于室温下孵育15分钟。
▲注意：较高的温度和/或较长的孵育时间可能会导致非特异性细胞标记。
6.在冰上工作需要增加孵育时间。通过添加1mL PEB缓冲液洗涤细胞，并以300×g离心10分钟。 上清液被完全吸出。
7.重复步骤6。进行表面染色。
下面给出的体积是最多106个有核细胞的体积。当使用少于106个单元时，使用所示的相同体积。当使用更高的细胞数时，相应地扩大所有试剂体积和总体积(例如，对于2×106有核细胞，使用所有指示试剂体积和总体积的两倍)。
1.确定细胞数。
2.将细胞以300×g离心10分钟。
3.上清液被完全吸出。根据相应抗体数据表中提到的稀释度，制备具有所有抗体的预混液。
4.将100 µl抗体预混液添加到细胞中。
5.将细胞重悬，并在黑暗中于4°C孵育10分钟。
6.通过添加1mL PEB缓冲液洗涤细胞，并在4℃以300×g离心5分钟。
7.上清液被完全吸出。
8.将细胞重悬于100 µL PEB缓冲液中，并使用MACSQuant®Analyzer进行流式细胞仪分析。
门控策略显示了对小鼠脾嗜碱性粒细胞的分析。 使用先前描述的面板对来自C57BL / 6小鼠的脾细胞进行染色以鉴定嗜碱性粒细胞。 最初使用FSC-H / FSC-A门控在单个细胞上门控，使用Viobility阴性门控在活细胞上门控（数据未显示）。 CD45 +嗜碱性粒细胞（A）表达CD11b，但不表达T，B和NK细胞谱系标记CD3，CD19和CD335（B）。 在CD11b +细胞中，嗜碱性粒细胞表达CD49b，而缺乏CD117的表达（C）。 在CD49b +细胞中，嗜碱性粒细胞可以通过高亲和力IgE受体（FcεRIα）和CD200R3（D）的共表达来有效鉴定。
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靶标 |
克隆号 |
目的 |
荧光 |
检测通道(nm) (laser) |
货号 |
CD11b |
M1/70 |
嗜碱性粒细胞 |
eFluor 450 |
450/50 (violet) |
48-0112-82 |
CD117 |
2B8 |
细胞类型排除 |
PE |
585/40 (blue) |
12-1171-82 |
CD3 |
17A2 |
细胞类型排除 |
PerCP-eFluor 710 |
655-730 (blue) |
46-0032-82 |
CD19 |
eBio1D3 (1D3) |
细胞类型排除 |
PerCP-Cyanine5.5 |
655-730 (blue) |
45-0193-82 |
CD335 (NKp46) |
29A1.4 |
细胞类型排除 |
PerCP-eFluor 710 |
655-730 (blue) |
46-3351-82 |
CD200R3 |
Ba13 |
嗜碱性粒细胞 |
PE-Cyanine7 |
750LP (red) |
25-2001-82 |
CD49b |
DX5 |
嗜碱性粒细胞 |
APC |
655-730 (red) |
17-5971-82 |
CD45 |
30-F11 |
白细胞 |
APC-eFluor 780 |
750LP (red) |
47-0451-82 |
6.免疫小鼠脾嗜碱性粒细胞流式分析
此应用方案描述了从健康C57BL / 6小鼠脾解离后嗜碱性粒细胞的流式细胞仪分析。 使用gentleMACS™Dissociator可以轻松解离小鼠脾脏，从而迅速获得可行的单细胞悬液，准备进行流式细胞术分析。
染色方案
用Viobility™固定染料标记细胞
Viobility Fixable Dye预先进行了重组。 将小瓶加热到室温以避免水凝结。 通过向染色小瓶中添加100 µL无水DMSO，重构一小瓶冻干的Viobility Fixable染料，并混合直至完全溶解。 将溶液等分，并在无水（干燥剂）条件下于–20°C储存，并避光长达一个月。
下面给出的体积最多可容纳107个有核细胞。 当使用少于107个单元时，请按照指示使用相同的体积。 当使用更高的细胞数时，相应地扩大所有试剂的体积和总体积（例如，对于2×107有核细胞，请使用所有指示试剂体积和总体积的两倍体积）。
1.确定细胞数。
2.通过加入1mL的1×PBS洗涤细胞，并以300×g离心10分钟。
3.上清液被完全吸出。 将细胞重悬于100 µL 1×PBS中。
4.加入了1 µL挥发性固定染料。
5.充分混合样品并在黑暗中于室温下孵育15分钟。 ▲注意：较高的温度和/或较长的孵育时间可能会导致非特异性细胞标记。
6.在冰上工作需要增加孵育时间。 通过添加1mL PEB缓冲液洗涤细胞，并以300×g离心10分钟。 上清液被完全吸出。
7.重复步骤6。
8.进行表面染色。
表面染色
下面给出的体积用于多达106个有核细胞。 当使用少于106个单元时，请按照指示使用相同的体积。 当使用更高的细胞数时，相应地按比例增加所有试剂的体积和总体积（例如，对于2×106有核细胞，请使用所有指示试剂体积和总体积的两倍体积）。
1.确定细胞数。
2.将细胞以300×g离心10分钟。 上清液被完全吸出。
3.根据相应抗体数据表中提到的稀释度，制备具有所有抗体的预混液。
4.将100 µl抗体预混液添加到细胞中。将细胞重悬，并在黑暗中于4°C孵育10分钟。
5.通过添加1 mL PEB缓冲液洗涤细胞，并在4℃以300×g离心5分钟。 上清液被完全吸出。
6.将细胞重悬于100 µL PEB缓冲液中，并使用MACSQuant®Analyzer进行流式细胞仪分析。
流式分析图
门控策略显示了对小鼠脾嗜碱性粒细胞的分析。 使用先前描述的面板对来自C57BL / 6小鼠的脾细胞进行染色以鉴定嗜碱性粒细胞。 最初使用FSC-H / FSC-A门控在单个细胞上门控，使用Viobility阴性门控在活细胞上门控（数据未显示）。 CD45 +嗜碱性粒细胞（A）表达CD11b，但不表达T，B和NK细胞谱系标记CD3，CD19和CD335（B）。 在CD11b +细胞中，嗜碱性粒细胞表达CD49b，而缺乏CD117的表达（C）。 在CD49b +细胞中，嗜碱性粒细胞可以通过高亲和力IgE受体（FcεRIα）和CD200R3（D）的共表达来有效鉴定。
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Specificity |
Clone |
Purpose |
Fluorochrome |
货号 |
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M1/70 |
Basophils |
eFluor 450 |
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2B8 |
Cell type exclusion |
PE |
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|
145-2C11 |
Cell type exclusion |
PE-eFluor 610 |
||
|
eBio1D3 (1D3) |
Cell type exclusion |
PE-eFluor 610 |
||
|
29A1.4 |
Cell type exclusion |
PerCP-eFluor 710 |
||
|
Ba13 |
Basophils |
PE-Cyanine7 |
||
|
DX5 |
Basophils |
APC |
||
|
30-F11 |
Leukocytes |
APC-eFluor 780 |