研究活细胞中的DNA含量和在各细胞周期的分布有多种应用场景，如在物理、化学或生物因素影响下检测细胞生长状态、监测细胞凋亡以及研究肿瘤状况和抑制基因的机制。活细胞通常处于三个主要的细胞周期：G0/G1期（每个细胞都有一组成对染色体）、S期（DNA合成期，DNA含量不等）和G2/M期（细胞分裂之前，每个细胞都有两组完整的成对染色体）[1-4]。DNA含量可以由DNA特异性荧光染料进行测量，这些染料的发射激光信号强度与DNA含量成正比，然后流式分析可以得出不同细胞周期阶段的分布直方图。通常使用非通透性核酸染料对固定或破膜的细胞进行分析，但也可以使用通透性的核酸染料对活细胞进行分析。赛默飞提供很多用于固定细胞的染料，还有一些通透性的核酸染料可供选择。

 

Vybrant™  DyeCycle™  Violet  stain染料是一种DNA特异结合、细胞膜渗透性染料，它可与双链DNA结合后发出荧光，由紫激光激发、可用于分析活细胞中的DNA含量。Vybrant DyeCycle Violet stain染料不仅兼容被广泛配置的的紫激光（图1）激发，而且也可由紫外激光（UV）激发，发射波长为440 nm左右。

 

Vybrant  DyeCycle  Violet  stain染色实验方案十分简单，只需将Vybrant  DyeCycle  Violet  stain染料孵育悬浮细胞，并直接检测其荧光强度，无需离心或其他步骤。这种活细胞染料的染色也兼容同时检测细胞表型，甚至可根据DNA含量进行细胞分选。啮齿动物和人类干细胞会排出Vybrant  DyeCycle  Violet  stain染料。因此可以通过紫光激发实现侧群细胞（Side popμLation, SP）分析或分选[5]。

 

光谱特征

 

Vybrant  DyeCycle  Violet  stain染料的荧光激发和发射光谱如图1所示，这个光谱是在样本中通过Vybrant  DyeCycle  Violet  stain染料与DNA结合得到的。

Vybrant DyeCycle Violet 染料/DNA结合物的荧光激发波峰和发射波峰分别为369 nm和437 nm。

图1.Vybrant DyeCycle Violet stain染料在TrisBorate-EDTA (TBE) Buffer（pH 8.3）

与DNA结合后的荧光激发光谱和发射光谱

 

材料

 

表1. 产品信息

产品	规格	浓度	储存*	稳定性
Vybrant DyeCycleViolet stain染料（#V35003）	200 μL	5 mM溶液溶于去离子水	2-6°C 请勿冷冻 避光	若按指示储存，该试剂盒至少可稳定储存6个月。

实验次数：基于1 mL测试体积，试剂盒可用于200次左右流式实验。

荧光激发/发射波峰：与DNA结合后，Vybrant  DyeCycle  Violet  stain染料为369/437 nm。

 

需要但未提供的材料

• 细胞和培养基
• 流式管

 

实验方案

 

以下优化后的染色实验方案使用Jurkat细胞（人白血病T细胞系）在37°C，含10%胎牛血清（#FBS141）的完全RPMI培养基（#609043）中进行染色。实验方案适用于多数细胞类型。测试样本包含1×106个细胞/mL。实验中所用的培养基或缓冲液、细胞密度、细胞类型或其他因素都可能会对染色有影响，因此在预实验中，根据细胞类型、缓冲液和实验条件，尝试使用梯度染料浓度，从而确定最佳的染色实验方案。在每组实验中，流式实验样本应使用相同细胞数量，避免因样本间细胞数量不同引起荧光信号的显著差异。

 

如果Vybrant  DyeCycle  Violet  stain染料与其他染料组合完成流式多色实验，请先按说明指示将其他染料加到样本中，包括洗涤步骤。Vybrant  DyeCycle  Violet  stain染料是在上机前最后添加，并且在上样分析前不要洗涤或固定样本。

 

常规事项

 

• 为了更好检测DNA含量来分析细胞周期，需注意以下事项：若无培养基，建议使用Hanks' Balanced  Slat Solution (HBSS)（#14175095），而非磷酸盐缓冲液。同时在整个实验中，请勿使用玻璃容器。

 

• 染色前，去除细胞悬液中的团块和杂质。在添加Vybrant  DyeCycle  Violet  stain染料后，在37°C下孵育细胞，请勿洗涤或固定细胞。

 

• 使用细胞活性鉴定染料去除死细胞，比如SYTOX™ Green（# S34860）、SYTOX™ Red（#S34859）或SYTOX™ AADvanced™（#S10274）细胞活性染料或者LIVE/DEAD™可固定细胞活性染料（如Fixable Green（#L34969）/Red（# L34971）/ Far-Red（#L34974）/ Near-IR kit（#L34994 / L34982）。

 

• 提前确认流式细胞仪性能正常，且根据实验目的，建议在低流速下收集到足够的流式数据。在数据分析中，通过设门排除团块、杂质及死细胞，确保数据准确性；在分析DNA含量时，采用线性（Linear）信号查看及分析。还有，Alexa Fluor 488通道和PE通道可能需要补偿调节。

 

• 人类和啮齿动物干细胞会分泌出Vybrant  DyeCycle  Violet染料，这是侧群细胞（Side population, SP）的检测原理；可以使用维拉帕米(Verapamil)、烟曲霉毒素C(Fumitermorgin C)或其他药物阻断分泌过程，可以更加准确地分析这些干细胞中的DNA含量。

 

Vybrant DyeCycle Violet stain染色实验方案

 

以下实验方案经优化，用于将完全培养基（RPMI #609043/ 10%胎牛血清 #FBS141）中悬浮培养的Jurkat细胞在37°C下进行Vybrant DyeCycle Violet stain染色。

 

1.从冰箱中取出Vybrant DyeCycle Violet stain（#V35003）染料，恢复至室温。

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2.用完全培养基调整细胞浓度为1×106 个细胞/mL，按每管1 mL细胞悬液加到流式管中。

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3.在每管中加入1 μL的Vybrant  DyeCycle  Violet  stain染料并充分混匀，使染料终浓度为5 μM。

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4.在37°C下避光孵育30分钟。直至上机采集数据前将细胞始终保持在37°C条件。

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5.不要洗涤或固定样本，直接上机检测样本。在流式细胞仪上，使用405 nm左右激发波长和440 nm左右发射波峰分析样本（图2），Vybrant DyeCycle Violet stain染料也可由紫外激光（UV）激发。

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图2. Vybrant  DyeCycle  Violet  stain染料染色Jurkat活细胞后得出DNA含量分布直方图

G0/G1和G2/M周期的波峰被S期分隔开。该染料由紫光405 nm激发且使用440/40 nm带通滤光片检测

 

参考文献

1.Current Protocols in Cytometry, 7.0.1–7.27.7 (2004)

2.Practical Flow Cytometry, 4th Ed., Shapiro HM,Ed. (2003)

3.Methods Mol Biol 281, 301 (2004)

4.Cytometry A 58, 21 (2004)

5.Stem Cells 25, 1029 (2007).

 

流式细胞术分析核酸是一种常见的应用。DNA含量的检测可以用来研究不同细胞群体的细胞周期和DNA倍体。在特定细胞群中，有三个主要细胞周期：G0/G1期（每个细胞含有一套成对的染色体）、S期（DNA合成期，DNA含量不等）和G2/M期（细胞分裂之前，每个细胞含有两套成对的染色体）[1-4]。可以使用DNA荧光染料对DNA进行检测，信号强度与DNA含量成正比。然后对这些染色细胞群进行流式细胞分析，获得各个细胞周期的直方图。

 

单参数DNA含量分析是一种成熟的检测方法，广泛用于肿瘤学、细胞生物学和分子生物学的研究。通过流式细胞术可实现多色细胞周期研究，可以替代488nm激光器使用其他激光器检测细胞周期，这样使得常用的488nm激光器用于其他靶标的检测。FxCycle™  Violet染料（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二醋酸盐）可被常见的紫色激光激发，也可被紫外UV激光激发。在紫色激光上检测DNA含量，则可以将常用的488 nm激光用于检测其他指标，例如细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶、细胞周期检查点、核蛋白和增殖标记物。FxCycle™ Violet染料优先结合dsDNA；这可能与小沟中的AT碱基对相关[5]。FxCycle™  Violet染料与dsDNA结合，可产生约20倍强度的荧[6]。

 

为了长期储存， 5瓶100 μg的固体染料可以在2–6°C下储存；为方便起见，小瓶溶于去离子水的储备液也在2–6°C下储存。

 

开始之前

 

实验中需要但未提供的试剂

• 去离子水

• 固定剂（例如酒精或甲醛）

• 破膜剂（例如Triton® X-100 #HFH10）

• 缓冲液，如磷酸盐缓冲液（PBS # 201054）

 

制备储备液

向染料瓶中加入100 μL去离子水，浓度为1 mg/mL的FxCycle™ Violet染料储备液。充分混匀。于2–6°C下避光储存，此条件下FxCycle™ Violet染料至少可稳定储存6个月。

 

光谱特性

FxCycle™  Violet染料的荧光激发和荧光发射光谱如图1所示。与dsDNA结合后，荧光激发和发射波长分别为358/461 nm。FxCycle™  Violet染料可被流式细胞仪上常用的405 nm紫色激光或者UV激光激发。

图1.FxCycle™ Violet染料与dsDNA结合后的荧光激发和发射光谱。

 

实验方案

以下方案使用Jurkat T细胞系研发，但该方案适用于其他细胞类型。固定破膜剂、细胞密度、细胞类型变化和其他因素都可能影响染色效果。

 

在预实验中，应对特定细胞类型进行测试，梯度测试不同的染料浓度以获得最佳的染色浓度和实验条件。在进行细胞染色之前，应尽量确保去除细胞中的固定剂，但如有特殊需要，可以在添加破膜剂的同时加入FxCycle™ Violet染料进行染色。对于同一组实验，每个流式细胞样本的细胞数量应保持一致，因为样本间细胞数量的差异会导致荧光信号的显著差异。

 

如果用FxCycle™ Violet染料结合其他染料标记的指标进行多色分析，请先按照其他指标的生产商的说明（包括洗涤步骤）染色其他染料。FxCycle™ Violet染色应是最后一个步骤，并且在流式细胞分析之前不要洗涤样本。

 

常规事项

为使DNA含量细胞周期分析达到最佳效果，请注意以下事项：

 

• 染色前去除细胞悬液中的细胞团块

• 在使用前先确认流式细胞仪的功能正常

• 应用荧光通道的线性参数（Linear）放大信号检测DNA含量

• 在低流速下进行采集

• 分析并采集足量的事件（events）用于数据分析

• 当对细胞DNA含量分析细胞周期时， FxCycle™ Violet染料使用前必须先固定细胞

 

染色步骤

1.收集细胞样本。

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2.根据经验证的最佳方法固定细胞。

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3.洗涤细胞。在进行细胞染色之前，尽量将样本中的固定试剂去除干净。

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4.使用合适的缓冲液，调节细胞样本浓度为1×106 个细胞/mL。

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5.制备流式细胞样本，使每个样本含有1 mL细胞悬液。如果实验需要可以选择性地加入破膜试剂进行破膜处理。

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6.向每个样本加入1μL FxCycle™ Violet（货号F10347）染料并充分混匀。

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7.样本在室温或2–6°C下避光孵育30分钟。

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8.使用流式细胞仪分析样本：使用405nm激光器和450/50带通或同等滤光片收集信号。

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9.图2显示了使用FxCycle™ Violet染料进行DNA含量细胞周期分析获得的结果示例。

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图2.HL-60早幼粒细胞经FxCycle™  Violet染料染色后获得的DNA含量直方图。HL-60细胞用酒精固定过夜、洗涤，然后重悬于0.1% Triton® X-100/PBS/1% BSA中，最后在室温下用FxCycle™  Violet染料染色30分钟。S期分布位于G0/G1和G2/M期直方图之间。使用450/50带通滤光片在405 nm激发光下进行分析。