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组织透明
组织透明技术是利用化学或物理的原理与方法将大块组织或完整器官透明化处理的技术，使得光学仪器可直接对组织或器官内的细胞等结构进行观察研究。它可以在不破坏器官完整性的前提下，观察其内在显微结构，避免了切片间的信息丢失，真正实现了细胞等结构的三维成像。目前很多研究人员遇到了各种无法突破的技术瓶颈，限制了他们对目标组织的观察，为此SunJin Lab在实现组织透明方面给我们带来了新希望。
1.组织透明技术
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| 图1.果蝇脑图像 （A）果蝇神经元的表达模式。 神经元树枝状结构由mCD8 :: GFP（绿色）标记，突触前末端用抗突触结合蛋白:: HA Ab（白色）标记，脑结构通过抗DLG免疫染色（蓝色）复染。 （B）光学投影神经元的三维可视化如图A所示。三个轴平行于果蝇脑的主轴。 |
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| 图2.RapiClear1.49透明处理550um小鼠脊髓切片表达YFP神经元的深度成像。 用25倍镜头拍摄。 （A）矢状剖面。 （B）冠状切面。 样品由中央研究院的Chia-Ming Lee博士提供。 |
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| 图3.为在550um小鼠脑切片海马神经元中表达YFP的深度编码投影图像。 （A）样品用RapiClear1.49透明剂透明，25x镜头成像。 （B）用RapiClear1.52透明样品，63x油镜头成像。 样品由中央研究院的Chia-Ming Lee博士提供。 |
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| 图4.胰岛微结构，血管系统和神经支配的成像。 绿色（标记凝集素）血管，蓝色胰岛（标记胰岛素）和洋红色神经（标记TUJ1）。 图片由Shiue Cheng教授（Tony）Tang提供。 |
RapiClear的特点：
& 兼容性：兼容各种内源荧光蛋白，亲脂示踪剂，核酸染色剂和Alexa Fluor染料。
& 简便：样品可以直接从缓冲溶液转移到RapiClear试剂中进行透明化。如果样品重新浸入缓冲溶液中，透明效果是可逆的。
RapiClear适用于什么样本？该如何选择使用？
| 样品 | 产品 | |||
| 动物 | 昆虫 | 果蝇，蝗虫，蟑螂等的组织 | Rapiclear 1.47 | |
| 小鼠 | 组织切片（厚度） | ＜0.5mm | Rapiclear 1.47 | |
| >0.5mm | Rapiclear 1.49Rapiclear 1.52 | |||
| 器官 | 脑，肾脏和心脏 | Rapiclear 1.55 | ||
| 胃，肠，肝，肺，胰腺，皮肤等 | Rapiclear 1.52 | |||
| 大鼠 | 组织切片（厚度） | ＜0.5mm | Rapiclear 1.47 | |
| >0.5mm | Rapiclear 1.49Rapiclear 1.52 | |||
| 斑马鱼 | 幼鱼 | Rapiclear 1.47 | ||
| 成年鱼 | Rapiclear 1.49 | |||
| 生物材料 | Matrigel,collagen matrix,agarose | Rapiclear 1.47 | ||
| 植物 | 拟南芥（A.thaliana），水稻，烟草等的组织 | Rapiclear 1.47 | ||
不同样本透明所需时间：
iSpacer®（成像垫片）
透明剂的使用还需要搭配一种简单易用的小工具即 iSpacer，它能让您的实验操作更方便。 iSpacers由不同厚度的胶带制成。 通过简单地将间隔物按压到显微镜载玻片或盖玻片上，形成密封的防水孔以包含RapiClear®并防止蒸发。 在不压缩的情况，这些孔的形状比较稳定，其厚度足以支撑样品自由浮动，以便在分辨样品内部的精细结构。 样品和垫片可以夹在两个盖玻片之间。 同时，iSpacers可以堆叠到不同的深度，直接用于光，荧光或共聚焦显微镜。
面对不同类型的样本，iSpacer的规格也是多种多样：
| 货号 | 产品 |
| IS001/IS010 | 单孔，约100μl工作体积，26×16mm，0.2mm深，50片/250片 |
| IS002/IS011 | 单孔，约250μl工作体积，26×16mm，0.5mm深，50片/250片 |
| IS003/IS012 | 单孔，约500μl工作体积，26×16mm，1.0mm深，50片/250片 |
| IS004/IS013 | 单孔，约1.5ml工作体积，26×16mm，3.0mm深，10片/100片 |
| IS005/IS014 | 单孔，约3.5ml工作体积，26×16mm，7.0mm深，10片/50片 |
| IS006/IS015 | 四孔，约12μl/孔 工作体积，7mm直径，0.18mm深，50片/250片 |
| IS007/IS016 | 四孔，约15μl/孔 工作体积，7mm直径，0.2mm深，50片/250片 |
| IS008/IS017 | 四孔，约35μl/孔 工作体积，7mm直径，0.5mm深，50片/250片 |
| IS009/IS018 | 四孔，约75μl/孔 工作体积，7mm直径，1.0mm深，50片/250片 |
RapiClear® CS mounting solution&mounting gel（透明剂&封片胶）
SunJin Lab又推出一种更适合较大器官的透明剂，即使在几毫米的深度，样品图像质量也可以达到细胞水平分辨率。RapiClear CS是一种水溶性透明剂，其折射率与CLARITYTM（斯坦福大学）水凝胶组织杂交体相同（RI = 1.45nD）。 浸入RapiClear CS后，脂质提取的水凝胶组织变得均匀透明。
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| 图5.用抗TH抗体标记的小鼠脑，采用Lightsheet Z1（Zeiss）成像揭示了多巴胺能神经元网络。 |
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| 图6. RapiClear CS透明剂处理前后，Thy1-eYFP小鼠脑的透射白光和荧光图像。 |
2. iSpacer 垫片使用方法
iSpacers由不同厚度的胶带制成。 通过简单地将间隔物按压到显微镜载玻片或盖玻片上，形成密封的防水孔以包含RapiClear 并防止蒸发。 在不压缩的情况，这些孔的形状比较稳定，其厚度足以支撑样品自由浮动，以便在分辨样品内部的精细结构。 样品和垫片可以夹在两个盖玻片之间。 同时，iSpacers可以堆叠到不同的深度，直接用于光，荧光或共聚焦显微镜。
具体操作步骤如下：
(A) 用无尘纸清洁载玻片及盖玻片 (大小: 22 x 30mm, 24 x 32mm, 或24 x 40mm) ；
(B) 撕掉 iSpacers上面的保护膜；
注: 同样应用于货号# IS004 和IS005iSpacer。
(C)将iSpacer粘性面朝下贴在载玻片或盖玻片的干燥表面上。 轻轻按压密封；
(D) 撕掉 iSpacers另一面上面的保护膜；
(E)可通过添加多个垫片增加样品孔深度。
(F) 撕掉增加的垫片保护膜；
(G) 在样品孔中加入适量的RapiClear；
(H) 将样品放入孔中；
(I) 用RapiClear填满孔；
(J) 盖上盖玻片，密封好样品；
(K) 轻轻按压盖玻片边缘，以确保安全密封；
(L) 用无尘纸擦除多余液体；
(M) 通过Neo-Mount （Merck，目录号109016）可以密封垫片外区域，在两个盖玻片之间形成硬膜。
根据您的实验需要，选择合适的iSpacer:
垫片选择
Single-sided sticky
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货号 |
孔数 |
规格 |
体积 |
包装 |
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1 |
26 x 16 mm, 0.15 mm deep |
75ul |
50/pack |
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1 |
26 x 16 mm, 0.15 mm deep |
75ul |
250/pack |
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|
1 |
26 x 16 mm, 0.2 mm deep |
100ul |
50/pack |
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|
1 |
26 x 16 mm, 0.2 mm deep |
100ul |
250/pack |
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|
1 |
26 x 16 mm, 0.5 mm deep |
250ul |
50/pack |
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|
1 |
26 x 16 mm, 0.5 mm deep |
250ul |
250/pack |
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1 |
26 x 16 mm, 1.0 mm deep |
500ul |
50/pack |
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|
1 |
26 x 16 mm, 1.0 mm deep |
500ul |
250/pack |
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4 |
7mm diameter, 0.15 mm deep |
12ul/each |
50/pack |
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4 |
7mm diameter, 0.15 mm deep |
12ul/each |
250/pack |
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4 |
7mm diameter, 0.2 mm deep |
15ul/each |
50/pack |
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|
4 |
7mm diameter, 0.2 mm deep |
15ul/each |
250/pack |
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4 |
7mm diameter, 0.5 mm deep |
35ul/each |
50/pack |
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4 |
7mm diameter, 0.5 mm deep |
35ul/each |
250/pack |
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4 |
7mm diameter, 1.0 mm deep |
75ul/each |
50/pack |
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4 |
7mm diameter, 1.0 mm deep |
75ul/each |
250/pack |
Double-sided sticky
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货号 |
孔数 |
规格 |
体积 |
包装 |
|
1 |
26 x 16 mm, 0.05 mm deep |
25ul |
50/pack |
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1 |
26 x 16 mm, 0.05 mm deep |
25ul |
250/pack |
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|
1 |
26 x 16 mm, 0.25 mm deep |
125ul |
50/pack |
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|
1 |
26 x 16 mm, 0.25 mm deep |
125ul |
250/pack |
|
|
1 |
26 x 16 mm, 3.0 mm deep |
1.5ml |
10/pack |
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1 |
26 x 16 mm, 3.0 mm deep |
1.5ml |
100/pack |
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|
1 |
26 x 16 mm, 7.0 mm deep |
3.5ml |
10/pack |
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|
1 |
26 x 16 mm, 7.0 mm deep |
3.5ml |
100/pack |
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4 |
26 x 16 mm, 0.05 mm deep |
4ul/each |
50/pack |
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4 |
26 x 16 mm, 0.05 mm deep |
4ul/each |
250/pack |
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4 |
7mm diameter, 0.25 mm deep |
18ul/each |
50/pack |
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4 |
7mm diameter, 0.25 mm deep |
18ul/each |
250/pack |
3.小鼠脑组织透明处理技术
不同类型的小鼠脑样本适用不同的RapiClear组织透明试剂，具体请参照下表：
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样本类型 |
样本厚度 |
RapiClear（RC） |
透明时间 |
备注 |
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切片 |
＜500μm |
数小时 |
- |
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500-1000μm |
数小时 |
- |
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＞1000μm |
数周 |
需与CLARITY配合使用 |
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整脑 |
数周 |
需与ScaleB4 solution一起用 |
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数周 |
抗体染色效果与透膜厚度有关 |
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以≤1000μm厚度为例，小鼠脑切片透明化实验流程
1. 麻醉小鼠，并使用预冷的1×PBS每分钟10mL灌注小鼠，直到流出的PBS无色为止。
2. 用预冷的4%PFA灌流固定。剥离脑组织并将其浸泡在20mL PFA中。
3. 将脑组织置于PFA，4℃轻轻振荡过夜。
4. 用PBS清洗组织，置于摇床室温20分钟。
5. 脑组织可通过振荡切片机，冰冻切片或组织切片模具手动切片。
6. 将切片置于12孔板中，加入4%PFA，室温处理2小时。
7. 用PBS室温洗涤3次。
8. 将样本转移至2%PBST溶液（含2% Triton-X100），室温过夜透化。
9. 可选步骤：免疫染色
9-1. 加封闭缓冲液，置于振荡器或摇床4℃过夜。
9-2. 加入一抗置于摇床，4℃孵育3-5天。
9-3. 室温清洗样本，两次，每次不少于1小时。将样本置于清洗缓冲液（含3% NaCl 和0.2% Triton-X 100 的PBS）4℃摇床过夜。
9-4. 加入二抗，置于摇床，4℃孵育1-2天。
9-5. 室温清洗样本，两次，每次不少于1小时。将样本置于清洗缓冲液4℃摇床过夜。
10. 可选步骤：DAPI染色
10-1. 加入DAPI，4℃摇床过夜。DAPI（Invitrogen D3571,制备1mg/ml 储存液）以1:2000稀释后使用。
10-2. 用PBS清洗样本3次，每次20分钟。将样本置于新鲜PBS，4℃摇床过夜。
11. 用无尘纸吸去样本表面多余的PBS。
12. 加入1mLRapiClear 1.47或RapiClear 1.49透明试剂（透明试剂可重复使用，不要超过3次），置于摇床，数小时后观察透明程度。37℃预热透明试剂可有助于试剂渗透。样本透明后可进行观察，或置于室温数周不影响成像品质。
13. 将iSpacer粘在载玻片或盖玻片上，将样本置于iSpacer孔内，加入新鲜透明试剂，盖上盖玻片。用无尘纸吸去iSpacer周围多余液体。封片。
14. 用共聚焦显微镜或双光子显微镜观察。
4. 小鼠脊髓透明化方法
5. RapiClear透明胰腺组织
胰岛是分布于胰外分泌部腺泡间的内分泌细胞团，含有丰富的神经血管，以调节激素分泌。早在Paul Langerhans发现胰岛的文献中，就已经描述了胰岛微结构，脉管系统和神经分布间的内在联系。在过去的100年中，由于2D组织学无法描述纷繁复杂的神经网管结构，胰腺3D的结构观察不透明性源于存在大量膜结构（主要是内质网和囊泡），其折射率比浸泡组织溶液如盐水或甘油的折射率高得多。折射率的不一致会引起散射，导致显微镜中光子穿透性差，因此，检查疾病（如肥胖症和糖尿病）中胰岛神经血管网络仍然是一项巨大挑战，直到透明技术出现......
RapiClear®1.52（RC152）组织透明试剂具有1.52的超高折射率（nD = 1.52），达到脂质的折射率，使荧光显微镜光子以最小的散射穿过厚的胰腺样本。 当使用共聚焦显微镜观察RC152处理的样本，焦深大于500 µm，使胰岛微环境的3D可视化成为可能，在探索代谢性疾病中的胰岛神经血管重塑研究中至关重要。
RapiClear®1.52透明试剂特点：
- 样品可以直接从水、缓冲溶液或甘油转移到RapiClear®1.52透明剂中。
- 如果样品重新浸入水或缓冲溶液中，透明效果是可逆的。
- RapiClear®1.52即用型，无需离心。
- RapiClear®1.52使得在组织表面下方1~5 mm处目标清晰可见。
- RapiClear®1.52是一种抗冻液体。RapiClear®封片后，样品可在-20℃下长期保存。
实验方法：
1、4%多聚甲醛灌注小鼠。
2、分离胰腺，用4%多聚甲醛再次固定，15℃，40min。
3、用振荡切片机切400μm组织。
4、组织用2% Triton X-100处理15℃，2h
5、PBS洗涤切片，浸入封闭缓冲液（2% Triton X-100, 10% normal goat serum, and 0.02% sodium azide in PBS）。
6、一抗染色，15℃，1天。
7、DAPI 核染色，室温，1h。
8、加入RapiClear 1.52 透明处理。
9、封片，共聚焦显微镜观察。
染色结果：
6. 整个皮肤组织透明
鳞状细胞癌（Epidermal carcinomas），即基底细胞癌（Basal Cell Carcinomas，BCC）和鳞状细胞癌（Squamous cell carcinomas，SCC）为人类常见恶性肿瘤。与这些癌症最相关的环境因素是紫外线（Ultraviolet）辐射，紫外线B（Ultraviolet-B）可导致直接诱变（Grimbaldeston等，2006年；Hart等人，2001；Halliday和Lyons，2008年）。长期光损伤的皮肤，表皮的整个区域都受到影响，导致出现多个肿瘤区。最近研究表明暴露在阳光下的正常皮肤，会发生基因的大量突变，包括已知的癌基因通常在SCC中找到（Martincorena和Campbell，2015年），证明暴露于紫外线的表皮细胞内潜在致癌能力。但是也可能提示突变不是引发肿瘤形成的唯一必要条件，因为即使带有致癌突变，皮肤仍保持正常。
为了更好地了解紫外线（UV）照射对皮肤癌变初期的影响，我们检查标记的角质形成细胞斑块代表小泡间表皮（Interfollicular epidermis）中的克隆，并测量在UVB照射下它们的大小变化。多色谱系示踪显示在长期照射下皮肤上，靠近毛囊（HFs）的斑块增大，而远离毛囊的斑块不变。UVB中断后，HFs附近的斑块大小显著下降。增殖细胞的解剖学差异对研究基底细胞癌（BCC）的起源细胞有重要意义。紫外线诱导鼠BCC模型显示BCC斑块在HF附近出现更频繁，更大且更具侵入性。这些发现对预防表皮癌有重要意义。
研究思路和方法
采用UVB照射3-10周小鼠，每周3次，且每两周增加0.5分钟照射时间，取3/5/8/10周不同时间点的毛发周期阶段的休止期，收集小鼠背部皮肤样本，做免疫组织化学染色及整个外显子组测序。
实验方法
1、处死小鼠，剃去毛发，收集皮肤组织样品
2、在4％PFA中固定2小时。
3、固定后，将整块背部皮肤样品在4℃下透膜并封闭过夜（封闭液1xPBS +0.5% TritonX， 2% BSA，20％正常山羊血清，1% DMSO和100mM 马来酸）。
4、在4℃下孵育一抗（ rabbit anti-keratin17和rabbit anti-keratin14）24小时。
5、用1:500稀释的Alexa Fluor 647 (Invitrogen)和Alexa Fluor 568 (Invitrogen) 二抗，4℃孵育24小时。
6、将整个皮肤组织样品在 0.2 mg/ml DAPI中复染，4℃孵育过夜。
7、在 组织透明试剂RapiClear 1.52 中透明化处理3-6小时（SunJin Lab）。
8、将样品用防淬灭封片剂封片， 用Zeiss LSM 710共聚焦显微镜扫描，3D成像。
温馨提示：
1、对于较厚组织样本的荧光染色，荧光稳定性至关重要，因此建议选用稳定且信噪比较高的荧光染料，如Alexa Fluor 及Alexa Fluor Plus 系列染料。
2、选择一种好口碑的组织透明试剂
SunJin Lab RapiClear 是一种无毒的水溶性组织透明试剂，含有防淬灭成分，染色的透明样品可以稳定储存两年。
实验结果
显微成像显示 z 轴上的整个皮肤的 2D 光学截面，其中显示了附着或侵入HFs的典型K17 + patches（绿色）。白色虚线表示表皮和真皮之间的界限（比例尺，50mm）。
7.透明化小鼠骨髓（Bone marrow，BM）的3D成像
小鼠骨髓（BM）切片
- 1
- 22
- 33
- 11
- 22
- 33
-
分离小鼠股骨，用PBS冲洗。
-
将分离好的股骨放入含2%多聚甲醛的PBS中， 4°C 固定 6 小时。
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取出股骨置于30% 蔗糖中，4°C脱水 72 小时。
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OCT包埋，并在液氮中快速冷冻。
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用振荡切片机做横切和纵切。
BM免疫染色和组织透明
-
用PBS洗涤骨切片 3 次，每次 5 分钟。
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将切片置于封闭液（含0.2% Triton X-100、1% BSA和10%驴血清的PBS）中， 4°C 孵育过夜。
-
将切片用含一抗的封闭液在4°C下孵育 3 天。
-
用PBS洗涤过夜。
-
将切片用含二抗的封闭液在4°C下孵育 3 天。
-
免疫染色后，将切片用 PBS 洗涤过夜。
-
将切片转移至RapiClear 1.52 中孵育至少 6 小时。
-
3D显微成像。
结果展示：
3D动画效果：
8.类器官（Organoid）的透明方案
1. 用4%新鲜多聚甲醛固定类器官，置于4℃摇床4-6小时。
2. 用PBS室温下洗涤3次，置于摇床，每次30 min。
3. 样品中加入含2% PBST（2% Triton X-100的PBS含 0.05% 叠氮化钠） 的5ml 管中置于摇床室温孵育2 天
4. 用PBS室温下洗涤3次，置于摇床，每次30 min。
5. 免疫荧光检测简易步骤
- 封闭液封闭（Blocking）, 2天；
- 一抗, 1:200稀释，孵育4 天；
- 二抗,1:200稀释，孵育3 天；
抗体的稀释浓度可根据不同厂家抗体要求进行稀释。
注：免疫荧光操作过程中，可将样品置于2mL管中，15℃摇床孵育一抗和二抗。
6. 样品转移至含RapiClear的2mL管中，RapiClear可反复使用数次。
7. 将透明的样品转移至载玻片，透明试剂中含抗淬灭封片剂，加RapiClear封片即可。
8. 共聚焦成像。较常用显微镜如Zeiss 25x/0.8 multiple immersion (WD 0.57mm), Leica 20x/0.75 multiple immersion (WD 0.68mm), Nikon 25x/1.05silicone immersion (WD 0.55mm), Nikon 20x/0.95 water immersion (0.95mm WD), and Olympus 30x/1.05 silicone immersion (WD 0.8mm)，均可获得较高品质的3D图像。
直径1.2mm之类脑器官(organoid)使用RC149进行透明化
Organoid神经元表达GFP荧光蛋白的景深影像。