诺为生物提供有多种细胞增殖检测试剂盒；基于您的研究实验中的细胞数量、细胞类型以及作用机制，选择感兴趣的细胞增殖检测试剂盒。这里有适用于流式检测和成像分析应用（包括微孔板分析和高内涵筛选）的各种类型细胞增殖检测试剂盒。

 

细胞增殖检测基本原理	检测试剂	检测实验原理	检测对象	实验方法
新DNA合成	Click-iT EdU检测试剂盒    BrdU检测试剂盒	在细胞增殖过程，检测加入到新合成DNA的胸苷类似物  终点检测实验 细胞样本或组织样本	当可以检测到胸苷类似物EdU或BrdU时，或者在将药物加到细胞样本中时，进行细胞增殖分析。	流式细胞术  成像分析（包括HCS和酶标仪）
通过染料稀释度进行细胞增殖次数分析	CellTrace细胞增殖试剂盒    CFSE细胞增殖试剂盒	由无毒性染料永久标记细胞，进行活细胞分析  连续多天进行活细胞分析  动力学检测  细胞样本	加入标记染料后，从时间零点开始进行细胞倍增代数检测	流式细胞术
定量分析DNA含量变化	CyQUANT 细胞增殖试剂盒	主要结合DNA的核酸结合染料  终点检测实验  固定细胞或活细胞	与已知细胞数的标准曲线对比，确定细胞内的核酸含量	酶标仪
代谢指示剂，提示细胞代谢变化	刃天青(AlamarBlue, PrestoBlue)细胞活力检测	细胞代谢活性由底物（Resazurin）还原检测到，通过吸光度或荧光值读取  动力学检测	检测细胞还原能力  荧光信号与代谢中的活细胞数量成正比	酶标仪
	CyQUANT MTT 细胞活力检测  CyQUANT XTT 细胞活力检测	细胞代谢活性由底物还原检测到，通过吸光度读取  终点测定实验	检测细胞还原能力  荧光信号与代谢中的活细胞数量成正比	酶标仪

细胞增殖分析是细胞生长和分化研究的关键，在药物开发阶段常用来评估化学药物的毒性和对肿瘤细胞生长的抑制作用。通常根据平均DNA含量或细胞代谢参数进行细胞增殖检测，此类分析可以报告出总细胞数目和活细胞数目，或者测定出单个细胞内的DNA合成情况。

Molecular Probes细胞增殖分析方法可以单独或组合使用，以便通过评估DNA合成情况、监测有丝分裂的阶段或跟踪群体倍增数，监测细胞健康和细胞分裂情况。

Click-iT EdU、Click-it Plus EdU和BrdU检测法比较

	Click-iT EdU试剂盒	Click-iT Plus EdU试剂盒	BrdU
多重	与大多数标准荧光染料（不包括FP和双联体）联用	与所有标准荧光染料（包括GFP和其他FP及敏感的双联体）联用	可变的
基础实验所需的试剂	Click-iT EdU或Click-iT Plus EdU流式细胞检测试剂盒 FIX & PERM 固定和破膜试剂盒		BrdU FIX & PERM固定和破膜试剂盒 Alexa Fluor 488抗-BrdU 抗体 DNase 7-AAD
出结果时间 （标记+检测）	通常 < 90分钟		5小时至过夜
步骤数	6  （无需多个破膜步骤，  不需要 Dnase 处理）		~10
DNA变性	无		需要

 

DNA合成检测分析

 

测定新DNA合成情况是一种精确分析单个细胞或细胞群细胞增殖情况的方法。基于DNA合成情况进行的细胞增殖分析，可以根据修饰的寡核苷酸的掺入情况测定新DNA的合成速率。Click-iT Plus EdU细胞增殖检测利用点击化学法和修饰寡核苷酸的性能，是BrdU染色法检测和定量分析新合成DNA的理想替代解决方案。

利用Click-iT Plus EdU分析测定细胞增殖情况，您还可结合GFP等表达蛋白、R-PE等蛋白标签以及一系列有机荧光染料联合使用，轻松实现多重荧光分析检测细胞增殖。

- 高准确度—明显优于BrdU染色法，且变异系数小（低CV）

- 简单易用—精简的五步实验方案

- 兼容性强—兼容GFP、mCherry、APC、PerCP、PE和其他荧光染料

 

产品选择指南

	Click-iT® Plus EdU Pacific Blue™流式细胞分析试剂盒		Click-iT® Plus EdUAlexa Fluor® 488流式细胞分析试剂盒		Click-iT® Plus EdUAlexa Fluor® 647流式细胞分析试剂盒
分析基本原理	Click-iT Plus EdU细胞增殖检测法是传统的BrdU细胞增殖检测法（将修饰的胸腺嘧啶模拟物EdU掺入增殖细胞中新合成的DNA）的替代解决方案，其采用明亮、光稳定的Alexa Fluor染料通过一种快速、高度特异性的点击反应对细胞进行标记。
读取对象	在EdU孵育期间合成DNA的细胞的细胞核中，积累的荧光信号。
荧光标记	Pacific Blue® 叠氮甲基吡啶		Alexa Fluor® 488叠氮甲基吡啶		Alexa Fluor® 647叠氮甲基吡啶
标准滤光片	DAPI		FITC		Cy®5
激发/发射光谱(nm)	410/455		495/519		650/668
多路复用	采用温和的点击化学法进行细胞增殖检测实验，不会破坏细胞抗原表位（不同于BrdU细胞增殖检测实验方案），且兼容抗体标记、荧光蛋白和常用的细胞染色法。
样品类型	针对活细胞进行了优化，点击检测步骤可放在细胞固定步骤后进行。
包装规格	50次		50次	100次	50次	100次
货号	C10636		C10632	C10633	C10634	C10635

 

	Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 350 流式细胞分析试剂盒	Click-iT Plus EdU Pacific Blue 流式细胞分析试剂盒	Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 488 流式细胞分析试剂盒		Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 流式细胞分析试剂盒	Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647流式细胞分析试剂盒
检测基本原理	作为传统BrdU检测的替代方法，将修饰的胸苷类似物EdU掺入增殖细胞中新合成的DNA中。 使用明亮且光稳定的Invitrogen Alexa Fluor染料，通过快速、高度特异性的点击反应标记细胞。
多重	Click-iT EdU Plus试剂盒具有最大限度的多色检测性能。 温和的点击化学方案不会破坏细胞表位（与BrdU方案不同）并且与标准抗体标记（小分子有机染料，如 FITC 或 Alexa Fluor染料，以及敏感的双联体，例如 Invitrogen R-PE-Cy5或APC-Cy7），荧光蛋白和常见的细胞染色方法兼容。
读取	荧光信号在EdU孵育期间合成DNA的细胞核中积累。
荧光标记	Alexa Fluor 350 吡啶甲基叠氮化物	Pacific Blue 吡啶甲基叠氮化物	Alexa Fluor 488 吡啶甲基叠氮化物		Alexa Fluor 594 吡啶甲基叠氮化物	Alexa Fluor 647 吡啶甲基叠氮化物
激光(nm)	UV	405	488		532 或 561	633/635
Ex/Em (nm)	350/438	410/455	495/519		532 或 561/615	650/668
样品类型	针对活细胞进行了优化，固定之后进行点击检测步骤。
参考文献	引用文献
产品规格	50次	50 次	50次	100次	50次	50次	100次
货 号	C10645	C10636	C10632	C10633	C10646	C10634	C10635

 

Click-iT EdU 流式细胞分析试剂盒背后的科学知识

 

Click-iT EdU 技术的优势在于化学方面 - 独特的小分子和低背景的标记物以及检测基团之间特异性共价反应。 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）是含有炔烃的核苷类似物。 在铜催化反应中，炔与染料标记的叠氮化物反应，形成稳定的共价键。 小分子的叠氮化物试剂可以有效地接触DNA而无需对细胞进行破坏处理。 这样大大地简化了测定，获得的结果与使用传统的BrdU相似（或更好）（图1和图2）。

图1： 使用 Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 488 流式细胞检测试剂盒和FxCycle Violet 染色剂进行细胞增殖分析。 根据 Invitrogen Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 488流式细胞检测试剂盒操作步骤，用 10 μM EdU 处理 Jurkat 细胞1小时并用 Invitrogen Alexa Fluor 488 吡啶甲基叠氮化物染色，然后用Invitrogen Violet 染色剂染色。 使用 488 nm （Click-iT EdU Alexa Fluor 488 染色剂）或 405 488 nm （对于FxCycle Violet 染色剂）激发波长，通过流式细胞术分析细胞。 (A) 显示S期细胞（DNA合成、包括 EdU 掺入）和G2/M或G0/G1细胞明显分离的直方图。 (B) 显示使用 FxCycle Violet 染色剂时的 DNA 含量分布直方图，G0/G1 和 G2/M 期峰由 S 期分割。 (C) 显示共阳性细胞的双参数 Click-iT Plus EdU 和 FxCycle 图，直接测量S期细胞百分比。

图 2. 使用mCherry荧光蛋白和 FxCycle Far Red染色剂进行 Alexa Fluor 488 Click-iT Plus EdU标记。 将表达mCherry的A549细胞使用10 µM EdU处理2小时，并按照推荐的染色方案检测。 图 A 为用 Alexa Fluor 488吡啶叠氮化物标记的细胞的直方图，用于鉴定S期细胞。 图 B 和 C 分别为存在（图B）和不存在铜时（图C）的Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 488 吡啶叠氮化物标记细胞发出的mCherry荧光，证明在点击反应中mCherry荧光保留。 图 D 为 Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 488 和 Invitrogen FxCycle Far Red染色剂染色的DNA含量双参数图；共阳性的细胞处于S期。

 

Click-iT Plus EdU试剂兼容多色检测

 

与初代Click-iT EdU流式细胞检测相比，Click-iT Plus配方具有更好的多色兼容检测能力。 Click-iT Plus EdU检测可与R-PE和R-PE双联体，以及各种荧光蛋白（如GFP和mCherry）配合使用，同时还具有初代Click-iT EdU检测精确、快速的特点。

可与之联用的有：

- 大多数标准荧光抗体

- 敏感的 PE 荧光染料，如PE-Cy7

- GFP、mCherry 和其它荧光蛋白

- 细胞表面和细胞内标记物

 - 细胞周期染料

图 3. 用于评估人类T细胞CD3和DNA链断裂的免疫表型分析实验结果。 Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 488流式细胞检测试剂盒和 Hu CD3 PE-Cy7 荧光的双参数图。

细胞增殖染料稀释分析主要基于细胞膜通透性，荧光团分子、染料进入细胞后，将会共价结合到蛋白质上的氨基基团上，从而使染料能够长时间停留在细胞中。

经过之后的细胞分裂阶段，各个子代细胞会从母细胞中接收到大约一半的荧光染料。采用流式细胞仪对荧光强度进行分析，即可测定出自标记结合起，单个细胞或细胞群所经历的传代数目。

CellTrace™荧光染料可用于在不影响细胞形态和生理特征的前提下，跟踪体内或体外的传代次数。

- 信号长期稳定—染色后可在细胞内保存数天

- 无毒性—目前尚未发现对细胞增殖能力和细胞形态有任何影响

 

产品选择指南

 

	CellTrace™ Violet 流式细胞分析细胞增殖试剂盒	CellTrace™ CFSE流式细胞分析细胞增殖试剂盒	CellTrace™ Far Red流式细胞分析细胞增殖试剂盒
分析基本原理	采用荧光染色剂永久标记细胞，以便在不影响细胞形态和生理特征的前提下跟踪细胞体内或体外传代或分裂情况。
读出方法	细胞群内的荧光强度水平决定了自进行荧光标记起细胞传代的次数。
荧光标记	CellTrace™ Violet	CFSE	CellTrace™ Far Red
标准滤光片	DAPI	FITC	APC
激发/发射光谱(nm)	405/450	495/519	630/661
多路复用
包装规格	1 kit/180次	1 kit	1 kit/180次
货号	C34557	C34554 230850 65-0850-84/65-0850-80	C34564

 

CellTrace细胞增殖试剂盒的工作原理

 

CellTrace细胞增殖试剂盒含有细胞膜通透性非荧光酯，可通过扩散透过细胞膜进入细胞，并与胺基反应形成荧光分子。这种无荧光的酯进入细胞后，可被胞内酯酶转化为荧光产物。活化的琥珀酰亚胺酯与蛋白质中的胺基基团共价结合，使染料能够长时间保留在细胞中。

经过后续细胞分裂阶段，各个子代细胞会从母细胞中接收到大约一半的荧光染料，从而可对体内标记且生长的细胞的荧光强度进行分析。

采用流式细胞仪对细胞群体的荧光强度进行分析，即可测定出自标记细胞起的传代次数（图1）。

 

图1. 细胞标记原理。 (A)通过染料稀释分析细胞增殖. (B) 流式细胞检测分析显示了来自初始细胞群的明亮的同种荧光信号。在后续细胞分裂产生的大量细胞中，每个子代细胞都具有母细胞一半的荧光强度。

 

细胞代数检测更灵敏

 

在体外标记数天或约7-8个分裂周期后，CellTrace染料的信号仍未被细胞的自发荧光覆盖，其信号仍可被检测到。将CellTrace Violet细胞增殖试剂盒和配有紫激光器的流式细胞仪搭配使用时，最多可检测到10代细胞 (图2)。

图2. 人淋巴细胞染色. 使用10 µM CellTrace Violet对人CD8+ T淋巴细胞进行染色，使用OpTmizer™ T细胞扩增培养基在37°C下培养7天。每毫升细胞样本液中加入200 ng小鼠抗人CD3抗体和100 ng白介素-2刺激细胞。

 

用于多重分析实验更灵活

 

CellTrace细胞增殖试剂盒可分别适用于紫光、蓝光、黄光 (561 nm) 和红光激光器，研究人员可将细胞增殖分析与其他活细胞应用（如免疫分型、细胞分选和细胞周期分析）相结合同时检测，从而在单次实验中以最低的消耗获取最大量的数据信息。

CellTrace Violet (图4) 和CellTrace Far Red可与常用的绿色荧光染料，如FITC和Alexa Fluor™ 488或绿色荧光蛋白（GFP）等兼容。

图3. 使用CellTrace试剂追踪细胞传代。 在不同实验条件下追踪细胞增殖的不同代数， (A) 采用CellTrace Violet试剂对刺激7天的人外周血单核细胞(PBMC) 染色； (B) 采用CellTrace CFSE试剂对刺激5天的人T淋巴细胞染色； (C) 采用CellTrace Yellow试剂对刺激11天的人PBMC染色； (D) 采用CellTrace Far Red试剂对刺激5天的人T淋巴细胞染色。同时使用抗人CD3抗体 (货号MHCD0300) 和白介素-2(货号PHC0027)刺激PBMC，只使用抗人CD3抗体 (货号MHCD0300) 刺激人T淋巴细胞。未刺激的母代细胞分别以 (A) 红色峰、(B) 蓝色峰以及 (C)和(D)紫色峰表示。使用SYTOX死细胞染色剂排除每个数据组中的死细胞。使用Attune NxT声波聚焦流式细胞仪进行分析，三种试剂的激发光和检测通道分别如下： CellTrace Violet检测使用405 nm激光: 450/40 nm通道；CellTrace CFSE 检测使用488 nm激光: 530/30 nm通道；CellTrace Far Red 检测使用638 nm激光: 660/20 nm通道。CellTrace Yellow检测使用 561 nm激光:585/16 nm通道。

图4. CellTrace Violet染色剂的兼容性。在培养的非同期骨肉瘤细胞中，CellTrace Violet与GFP的光谱兼容性示例。 (A) 无GFP表达的未染色细胞。(B) 稳定表达GFP的未染色细胞。 (C) 使用5 µM CellTrace Violet染料染色且无GFP表达的细胞。(D)使用5 µM CellTrace Violet染色同时表达GFP的细胞。

 

方案A:利用CellVue®染料标记细胞

 

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CellVue®是一种亲脂性染料，可以用来标记细胞膜，以识别和跟踪被标记的细胞。细胞标记过程快速而稳定，能够与荧光标记的抗体和其他细胞功能标记物并用，用于流式细胞分析和荧光显微镜检查。

 

一般注意事项

 

- Mini CellVue® 试剂盒中含有一瓶染料原液（1mM的乙醇溶液）和一瓶标记介质（稀释液 C）；Midi CellVue C ® 试剂盒内含两瓶染料原液（稀释液 1mM的乙醇溶液）和六瓶标记介质（稀释液 C）；

- 所有过程均在室温下进行。标记过程中不应使用含有叠氮化物或其他代谢抑制剂的试剂。

 

实验步骤

 

注:该方案经过体内或体外细胞标记的测试。因为标记有赖于细胞膜结合染料，因此如果染料浓度过高，或者标记时间过长，都会破坏细胞膜完整性,细胞状态也会较差。应该在单克隆抗体染色之前，利用CELLVUE@染料标记。研究者应该根据实验需要摸索标记的条件和浓度，确保染料发挥最佳性能。

1.利用不含血清的培养基洗涤细胞，去除会干扰细胞标记的血清蛋白质和脂质。

2.小心地倒掉上清液，留下不超过25uL的培养基。

3.用稀释液C重悬细胞，使浓度达到2x10⁷细胞/mL, 禁止涡旋。吹打几次，确保形成单细胞悬液。

4. 标记前用稀释液C制备2X染料工作液。如果染料的终浓度是2uM，需将4ul 1mM染色原液加到1ml稀释液C中，制备4uM染色浓液。为确保标记均匀，不能将染料原液直接加入单细胞悬液中。

5. 快速将1ml细胞加入到1mL2x染色工作液内，吹打混匀样本确保标记均匀。最终细胞浓度应该约为1x10⁷细胞/mL，最终染料溶度应该为2uM。

6. 孵育2-5分钟，孵育期间需混匀几次。孵育时间越长标记越明亮，但是应避免过久对细胞活性产生影响。

7.加入等量的血清孵育1分钟终止标记。

8.离心细胞并弃上清。
9. 使用完全培养基洗涤细胞三次(不用稀释液C)。为降低残留染料的干扰，将细胞转移到新试管中。
10.根据需要进行细胞计数、培养或转移。

 

方案B :利用细胞增殖染料（CPD）eFluor® 450

 

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细胞增殖染料(CPD)eFuor® 670,CPD eFluor@ 450,和5-(和6)羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)是可以监测单细胞分裂的荧光染料。该染料可以在体内跟踪未分裂的细胞数周。该染料与细胞蛋白质形成共价反应。随着细胞分裂，该染料会均分到子代细胞中，荧光强度减为原来的一半。根据使用的染料，我们可以继续观察6-8代细胞。增殖染料标记的细胞可以被含甲醛的固定剂和皂角素的破膜液固定并破膜，例如Foxp3/转录因子染色缓冲液试剂盒(货号 00-5523)或细胞内固定&破膜液试剂盒(货号 88-8824)，然后进行细胞内抗原的分析。

 

材料

 

- CPD eFluor®450 (货号 65-0842)

- 无菌1X PBS

- 二甲基亚砜（DMSO），无水

- 培养基（含≥10%血清）

 

实验步骤

 

1.一管CPD eFluor@ 450中加入126 mL无水DMSO溶解形成10mM染料原液。
注:溶解后,应避光存放在-20℃的条件下,干燥保存。建议在6个月内使用该染料，避免反复冻融。
2.制备需要标记的单细胞悬液。
3.利用PBS洗涤细胞两次，清除所有血清。
4. 在PBS(预热至室温)中重悬细胞，使浓度达到最终所需的两倍。例如，最终浓度为10x10⁶细胞/mL, 则重悬细胞浓度为20x10⁶细胞/mL。
注:最终细胞浓度不应超过10X10⁶细胞/mL。如果标记细胞总数不超过5X10⁶细胞/mL，则使用的PBS不应少于0.5mL。

5.PBS(预热至室温)制备20uM的CPD eFluor@ 450。按照1:1的比例混合CPD工作液和第6步制备的2X细胞悬液。
注:建议将10uM作为标记细胞的起始点;但是，强烈建议根据测试结果确定最佳浓度。
6.涡旋2X细胞悬液，并加入等量的第5步制备的染料溶液。
7.室温避光孵育20分钟。
8.加入4-5体积预冷的完全培养基(含>10%血清)终止标记，并在冰上孵育5分钟。
9.用完全培养基洗涤细胞三次。
10.根据需要进行细胞培养和转移。

细胞活化和增殖
左图: 利用CPD eFluor®450标记人PBMC细胞，并与刀豆蛋白A(ConA)溶液(500X)(货号 00-4978)一起培养3天。使用抗人CD86 PE(货号 12-0869)和细胞活性染料FVD eFluor®660(货号65-0864)染色。设门淋巴细胞及活细胞后进行分析。右图:利用CPDefuor®450标记小鼠脾细胞,并与刀豆蛋白A(ConA)溶液(500X)(货号00-4978)一起培养3天。使用抗小鼠CD86 PE-Cyanine7(货号25-0862)和细胞活性染料FVD eFluor®660(货号 65-0864)染色。设门淋巴细胞及活细胞后进行分析。

 

方案C：羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）

 

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材料

- CFSE(货号 65-0850)
- 无菌1X PBS
- 甲基亚砜(DMSO)，无水完全培养基(含≥10%血清)

 

实验步骤

1.90 μL无水DMSO溶解一瓶DMSO成10mM浓缩原液。
注:溶解之后,应避光存放在-20°℃的条件下,干燥保存。建议在6个月内使用该重组染料，避免反复冻融。
2.制备需要标记的单细胞悬液。
3.利用PBS洗涤细胞两次，清除所有血清。
4.使用PBS(预热至室温)重悬5-10x105细胞/mL。
5.加入CFSE至所需浓度(例如:最终浓度为1uM时，每毫升细胞加入0.2uL5mM原液)。
6.立即混匀，并在室温避光孵育10分钟。

7.加入4-5体积预冷的完全培养基终止标记，并在冰上孵育5分钟。

8.用完全培养基洗涤细胞三次。

9.根据需要进行细胞培养和转移。

注:CFSE的浓度、孵育时间和温度可达到理想的染色强度。但是荧光信号过强会导致补偿难以调整，也可能会干扰细胞的功能。因此，强烈建议根据测试结果确定最佳浓度。

细胞增殖对OVA处理的反应

利用1 μM CFSE标记OT-I小鼠的淋巴结细胞,打入C57BI/6小鼠体内。三天以后，利用抗小鼠/大鼠CD90.1(Thy1.1)PerCP-cyanine5.5(货号 45-0900)和抗小鼠 CD8a eFluor® 450(货号 48-0081)染色小鼠脾细胞，为OT-I细胞设门(左图)。分析OT-I门内(CD8+Thy1.1+)细胞的分裂(右图)，OVA免疫小鼠测定出离散的CFSE峰值(紫色直方图)，而PBS免疫小鼠的未分化细胞为单独明亮的CFSE峰值(蓝色直方图)。