细胞活性的检测通常是基于细胞膜完整性（膜完整性染料）或细胞功能（如酶活性（酶活性底物）或代谢活性（代谢活性试剂）来检测细胞活性。每种活力检测方法均可提供细胞死活的单一参数读值。也可使用多参数检测（细胞活性检测试剂盒），对细胞健康状况进行多个指标的检测。这些活性检测试剂盒可同时检测活细胞、死细胞和受损/即将死亡的细胞。

    在流式细胞分析和分选实验过程中，死细胞经常会因为可以与许多试剂发生非特异性结合而带来假阳性结果。 因此，从流式细胞仪数据中移除死细胞是帮助确保结果和分析精确的关键步骤。 

    传统的非膜通透的DNA结合染料包括碘化丙啶（PI）（图 1）和 7-AAD以及SYTOX染料。 这些染料可进入细胞膜受损的细胞并与 dsDNA/RNA 发生结合，但它们不能穿透完整的细胞膜；染料结合dsDNA/RNA后可被 488 或 532 nm 激光激发并在 610 nm 以上波长散射，因而广泛用于流式细胞术活性检测。非固定样本进行流式检测时，可根据流式细胞分析结果轻松排除死细胞。 它们还可用于固定细胞 DNA 含量细胞周期分析，但需要加入 RNase。因为该染料结合dsDNA/RNA是非共价结合，所以重悬细胞用的缓冲液中必须含有该染料，以保证死细胞被染色。

    7-AAD（7-氨基-放线菌素 D）可用于替代 PI（碘化丙啶）,排除流式细胞术分析中的无活性细胞。在 2-色分析中，7-AAD可与 PE（藻红蛋白）和 FITC（异硫氰酸荧光素）偶联抗体联合使用。7-AAD 相比于 PI 的优势在于这些发射波长之间的光谱重叠极少。在光谱的远红外范围内检测荧光（650 nm 长通滤光片）。

 

 

图 1. 采用碘化丙啶PI进行死细胞染色。 用 10 uM 喜树碱处理 Jurkat 细胞4小时，然后采用带有 Annexin V Alexa Flour 488 及碘化丙啶PI的死细胞凋亡试剂盒进行染色。 在 Invitrogen Attune 流式细胞仪上采用 488 nm 激发波长以及 530/30 和 575/24 带通滤波器对细胞进行分析，并用标准的 100 uL/min 收集速率进行收集。 死（坏死）细胞相对于凋亡或活细胞具有更高的碘化丙啶水平。

A = 凋亡细胞，V = 活细胞，N = 坏死细胞。

 

    SYTOX死细胞染色剂难以穿透完整的细胞膜且在与dsDNA结合后具有更强的荧光信号，因而成为我们最出色的死细胞染色剂（图 2）。 SYTOX死细胞染色剂在水相介质中不发荧光，因此在使用时仅需直接加入细胞中便可进行观察，并不需要洗涤步骤。该系列染色剂可提供多种颜色形式并兼容多种激光，具有高度灵活性。 这类染色剂可用于多种平台，包括荧光显微镜、流式细胞仪和微孔板。

图2. 用SYTOX 死细胞染色剂进行活细胞gating。 在采用 488 nm和 635 nm 激发光进行流式细胞仪分析前，经热处理和未经热处理的人类外周血白细胞通过anti-human CD3 Alexa Fluor 488 、anti-human CD8 PE以及 5 nM SYTOX Red 死细胞染色剂染色。 (A) 展示两种细胞群分布的直方图 — 死细胞发出明显的  SYTOX Red 荧光信号，而活细胞并无荧光。 (B) 活细胞设门后CD8和CD3染色双参数图。

 

核酸染料:

产品名称	检测平台*	标准滤光片组	激光器 (nm)	Ex/Em** (nm)	货号
碘化丙啶（PI）	FC、FM	RFP	488/532/561	535/617	00-6990-50 225694  P1304MP
TO-PRO-3 Iodide	FC、FM	Cy5	633	642/661	T3605
7-AAD	FC、FM	Texas Red	488/561	546/647	00-6993-50  225693 A1310
SYTOX 蓝色核酸染料	FC、FM	BFP	405	444/480	S11348
SYTOX 绿色核酸染料	FC、FM	GFP	488	483/503	S7020
SYTOX 橙色核酸染料	FC、FM	RFP	561	547/570	S11368
SYTOX 深红色核酸染料	FC、FM、M	Cy5	633	660/682	S11381
SYTOX 蓝色死细胞染料	FC、FM	-	405	444/480	S34857
SYTOX 绿色死细胞染料	FC、FM	-	488	504/523	S34860
SYTOX 橙色死细胞染料	FC、FM	-	561	547/570	S34861
SYTOX AADvanced 死细胞染色试剂盒	FC	-	561	546/647	S10349
SYTOX 红色死细胞染料	FC、FM	-	633	640/658	S34859
SYTOX 死细胞染料组合套装	FC、FM	-	488, 532, 561, 633	多种化合物	S34862
*FC = 流式细胞仪；FM = 荧光显微镜；M = 微孔板
**Ex=激发；Em=发射

 

SYTOX系列产品：

	SYTOX Blue 死细胞染色剂	SYTOX Green 死细胞染色剂	SYTOX Orange 死细胞染色剂		SYTOX AADvanced 死细胞染色试剂盒			SYTOX Red 死细胞染色剂	SYTOX 死细胞试用装染色剂
工作原理	染料进入死细胞内部结合dsDNA,产生高度的荧光；而活细胞不会被染色
激光(nm)	405	488	488	532	488	532	561	633/635	多种
Ex/Em (nm)	444/480	504/523	547/570		546/647			640/658	多种
多重	是
可固定	否
样品类型	活细胞
产品规格	1000次	1000次	1000次		参见下文			1000次	每种 50 次反应
货号	S34857	S34860	S34861		100 个反应 (S10349)			S34859	S34862
					500 个反应 (S10274)

 

 

    排除死细胞可以使免疫细胞分群更为准确,减少死细胞对数据分析的干扰。如下图数据所示，可见排除死细胞后，阳性细胞分群更明确。Invitrogen Molecular Probes LIVE/DEAD （FVD）可固定细胞的死细胞染色剂是一种有助于确认在细胞固定后，仍能够对细胞活性进行准确评估的可固定活性染料。

如上图若设门活细胞（图上蓝色细胞群，可明确区分出有表达因子的细胞群。若不把死细胞去除（图上红色细胞群）则无法明确

 

    LIVE/DEAD （FVD） 可固定的死活细胞染色试剂盒基于荧光反应染料与细胞蛋白（胺）的反应。 这些染料不能穿透活细胞膜，所以仅有细胞表面的蛋白可与染料发生反应，产生微弱染色（图3.活细胞）。 但这些反应染料可穿透受损的死细胞细胞膜并对内部和外部的胺进行染色，从而实现更明亮的染色（图3. 死细胞）。活细胞和死细胞群之间的荧光强度差异通常在50倍以上，因此两者之间可实现完全区分（图 4.A）。 此外，染料与蛋白（胺）之间的共价结合方式使得在通过福尔马林固定后（常用于细胞内的免疫分型以及病原体失活）依然可以保留活细胞和死细胞群之间的差异（图4.B）。

图3. LIVE/DEAD 可固定死活细胞染色原理。  非细胞通透的胺反应染料仅能结合到活细胞的表面，产生非常微弱的荧光。但这些染料可穿透死细胞的细胞膜并与内部的蛋白发生结合，从而产生极强的荧光。

图 4. 固定后 LIVE/DEAD 可固定死活细胞染剂染色分析。 LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死活细胞染色试剂盒用于对活细胞（左侧峰）和热处理 Jurkat 细胞（右侧峰）的混合物进行差异染色。 (A) 中的细胞没有固定；(B)中的细胞在 3.7% 福尔马林中固定后进行分析。 在流式细胞仪上采用 405nm 激发波长及 ~525nm 散射波长分析样品。

 

Live/Dead (FVD)可固定的细胞死活染料特点：

• 灵活— 八个单通道荧光色，灵活满足实验的需求

• 特异— 活细胞和死细胞可被清晰的区分，即便是在固定后也可轻松排除影响结果准确性的死细胞

• 简便性 — 兼容大部分流式抗体染料及免疫分型方案

 

产品名称	检测平台*	标准滤光片组	激光器 (nm)	Ex/Em** (nm)	货号
eBioscience™ Fixable Viability Dye（FVD） eFluor™ 455UV	FC	-	UV	350/455	65-0868-18 65-0868-14
eBioscience™ Fixable Viability Dye eFluor™ 450	FC	-	405	405/450	65-0863-18  65-0863-14
eBioscience™ Fixable Viability Dye eFluor™ 506	FC	-	405	405/506	65-0866-18 65-0866-14
eBioscience™ Fixable Viability Dye eFluor™ 520	FC	-	488	488/522	65-0867-18 65-0867-14
eBioscience™ Fixable Viability Dye eFluor™ 660	FC	-	633	633/660	65-0864-18 65-0864-14
eBioscience™ Fixable Viability Dye eFluor™ 780	FC	-	633	750/780	65-0865-18 65-0865-14
Image-iT 深绿色活力染料	FC、FM	GFP	488	488/515	I10291
LIVE/DEAD 可固定蓝色染料	FC	-	UV	350/450	L34961
LIVE/DEAD 可固定紫色染料	FC	-	405	416/451	L34963
LIVE/DEAD 可固定灰色染料	FC	-	405	405/506	L34989
LIVE/DEAD 可固定水绿色染料	FC	-	405	367/526	L34965
LIVE/DEAD 可固定黄色染料	FC	-	405	400/575	L34967
LIVE/DEAD 可固定绿色染料	FC	-	488	495/520	L34969
LIVE/DEAD 可固定橄榄绿色染料	FC	-	488	479/557	L34977
LIVE/DEAD 可固定橙色染料	FC	-	561	578/602	L34983
LIVE/DEAD 可固定红色染料	FC	-	488、561	595/615	L34971
LIVE/DEAD 可固定远红色染料	FC	-	633	650/665	L34973
LIVE/DEAD 可固定深红色染料	FC	-	633	702/723	L34986
LIVE/DEAD 可固定近红外（775）染料	FC	-	633	750/775	L34975
LIVE/DEAD 可固定近红外（780）染料	FC	-	633	633/785	L34992
LIVE/DEAD 可固定近红外（876）染料	FC	-	808	840/876	L34980
*FC=流式细胞仪；FM=荧光显微镜
**Ex=激发；Em=发射

 

可固定死活染料		LIVE/DEAD Fixable Blue	LIVE/DEAD Fixable Violet	LIVE/DEAD Fixable Aqua	LIVE/DEAD Fixable Yellow	LIVE/DEAD Fixable Green	LIVE/DEAD Fixable Red		LIVE/DEAD Fixable Far Red	LIVE/DEAD Fixable Near-IR
工作原理		LIVE/DEAD可固定细胞死活染色试剂盒是灵活的细胞活性检测染料，可根据细胞膜完整性以及与胺基发生反应来区分活细胞和死细胞。 细胞可被固定以便进行细胞内抗原检测，而不会出现传统细胞染色方法产生的细胞损失。 并可根据流式细胞术结果轻松排除死亡细胞。
数据分析		死细胞发出强烈的荧光，而活细胞的荧光强度极低，两者易于区分。
激光（nm）		UV	405	405	405	488	488	561	633/635	633/635
Ex/Em (nm)		350/450	416/451	450/526	400/575	495/520	595/615		650/665	750/775
货号	80Tests	L34961	L34963	L34965	L34967	L34969	L34971		L34973	L34975
	100Tests	65-0868-14	65-0863-14	65-0866-14		65-0867-14			65-0864-14	65-0865-14
	200Tests	L23105	L34955	L34957	L34959	L23101	L23102		L10120	L10119
	400Tests	L34962	L34964	L34966	L34968	L34970	L34972		L34974	L34976
	500Tests	65-0868-18	65-0863-18	65-0866-18		65-0867-18			65-0864-18	65-0865-18

 

 

CellTrace Calcein（钙黄绿素） AM 染料可被动吸收进入粘附和非粘附的细胞中。 这些膜通透性的酯酶底物可作为活性探测器，检测激活荧光所必需的酶活性，以及相应荧光产物在细胞内发生滞留所必需的细胞膜完整性。 该染料可发蓝色、紫色以及绿色荧光，非常适合于活细胞的短期染色并用于多重流式细胞实验（图 5）。

图 5. CellTrace 钙黄绿素 AM 染色活细胞。 乙醇固定的人B细胞和活B细胞1:1混合，利用钙黄绿素 AM 和Ethidium Homodimer-1 (EthD-1)货号: E1169染色， 5分钟后，用488 nm激发波长进行流式细胞仪分析。 二元频率分布结果显示标记有绿色荧光（530 nm）的活细胞群体和标记有红色荧光（585 nm）的死细胞群体被清晰的区别开来。

酯酶

	CellTrace Calcein Blue, AM	CellTrace Calcein Violet, AM	CellTrace Calcein Green, AM
检测基本原理	CellTrace calcein AM 染料在 AM 酯完整时不发荧光并可穿过所有细胞的细胞膜。 一旦进入活细胞后，活性酯酶将会切除 AM 基团并使得染料产生荧光。 死细胞中的 AM 基团不会被切除并且染料也不会发出荧光。 最佳的使用方式是采用短期标记作为染料，一旦 AM 基团被切除，便可在数小时内被主动转运至细胞外。
读取	活细胞发出高亮度荧光；死细胞荧光可忽略不计
激光(nm)	UV	405	488
Ex/Em (nm)	322/425	400/452	495/515
参考文献	引用文献	引用文献	引用文献
多重	是	是	是
染料相容性	不可与 Indo-1（蓝色）、DAPI 或 Hoechst 33342 一起使用	不可与Pacific Blue 染料、CellTrace Violet 染色剂、 FxCycle Violet染色剂、LIVE/DEAD Fixable Violet 染色剂、BV421 或 eFluor 450 结合使用	不可与 Invitrogen FITC、Alexa Fluor 488、GFP或CellTrace CSFE 染色剂一起使用
可固定	否	否	否
样品类型	活细胞
产品规格	20 x 50 µg	20 x 50 µg	20 x 50 µg
货 号	C34853	C34858	C34852

LIVE/DEAD Violet 细胞活力/活性检测试剂盒

LIVE/DEAD Violet 活性/活力试剂盒提供了一种双色荧光细胞活性和活力检测的方法，其基于对细胞健康公认的标准——即代表细胞活性的质膜完整性以及细胞活力的胞内酯酶活力——对活细胞和死细胞同时进行检测（图 6）。 CellTrace Calcein Violet AM 及LIVE/DEAD Fixable Aqua 荧光反应染料是适用于此应用的最佳染料；这两种染料均利用紫色激光，使得其它激光通道可用其它更为传统的标记。

图6.  染色热灭活及未处理 Jurkat 细胞。 根据 LIVE/DEAD Violet 活性/活力试剂盒中的实验方法对 Jurket 胞进行染色。 采用 405 nm 激光激发对细胞进行

流式分析：450/50 nm 带通滤光器用于calcein violet标记的活细胞 (L)，525/50 nm 带通滤光器用于 auqa 染料标记的死细胞 (D)。

 

活性/活力检测试剂盒

 

LIVE/DEAD Violet 细胞活力/活性检测试剂盒
检测基本原理	LIVE/DEAD Violet 活性/活力试剂盒提供了一种双色荧光细胞活性和活力检测的方法，基于对细胞健康公认的标准——即代表细胞活性的质膜完整性以及细胞活力的胞内酯酶活力——对活细胞和死细胞同时进行检测。
荧光标记	Calcein Violet, AM	LIVE/DEAD Aqua 染色剂
读取	活细胞发出高亮度荧光；死细胞荧光明显更弱	活细胞发出可忽略不计的荧光；死细胞发出高亮度荧光
激光(nm)	405	405
Ex/Em (nm)	400/452	367/526
多重	是	是
染料相容性	不可与  Pacific Blue 染料、CellTrace Violet 染色剂、 FxCycle Violet染色剂、LIVE/DEAD Fixable Violet 染色剂、BV421 或 eFluor 450 结合使用	不可与Pacific Green 染料、F2N12S 凋亡检测试剂盒、AmCyan 或 BV510 一起使用
可固定	否
样品类型	活细胞
产品规格	20 个反应
货 号	L34958

 

活性染色是任何流式细胞术实验的必需组成部分。死细胞可能因非特异性结合抗体而损害数据的完整性；因此，必需从分析中排除死细胞。 

活性染料染色

方案 A：用碘化丙啶或 7-氨基-放线菌素 D (7-AAD) 着染死细胞

方案 B：用钙黄绿素染料着染活细胞

方案 C：用可固定活力染料(FVD) 着染死细胞

- 12 x 75 mm 管中 C1 标准染色

- 96 孔板中 C2 染色

- 在未裂解的全血中用 FVD 进行 C3 染色

- 在含叠氮化物和/或蛋白质的染色缓冲液中用 FVD 进行 C4 染色

- 在抗体混合物中用 FVD 进行 C5 染色

 

方案 A：使用碘化丙啶 (PI) 或 7-氨基放线菌素 D (7-AAD) 着染死细胞

 

碘化丙啶和 7-AAD 可用于着染死细胞，因此可从标准活细胞表面染色方案的分析中排除这些细胞。这些染料不能通过完好的细胞膜，但可以自由进入胞膜受损的细胞。一旦进入死细胞，碘化丙啶就将以化学计量方式嵌插入双链 DNA 或双链 RNA，而 7-AAD 将优先插嵌入双链 DNA。由于这种嵌插由非共价力介导，故这些染料必须仍存在用于重悬细胞以采集数据的缓冲液中，从而死细胞将仍保持被标记。

&通用注释

注释：当需要胞内染色时，碘化丙啶和 7-AAD 都不可用于区分活细胞和死细胞。请参阅下文"用可固定活力染料 (FVD) 着染死细胞，方案 C")，以便用兼容于胞内染色方案的活力染料着染死细胞。

材料

- 活力染料

o 碘化丙啶染色液（货号 00-6990）

o 7-AAD 细胞活力染色液（货号 00-6993）

- 流式细胞术染色缓冲液（货号00-4222/222026/222057）

- 12 x 75 mm 圆底管(货号352058)

 

实验方案

1.细胞的表面抗原染色后，用流式细胞术染色缓冲液洗涤细胞 1-2 次。

2.将细胞重悬于适当体积的流式细胞术染色缓冲液中。

3.每 100 µL 细胞添加 5 µL 碘化丙啶染色液或 7-AAD 染色液。

4.在冰上或在室温孵育 5-15 分钟。切勿洗涤细胞。

o注释：采集期间，碘化丙啶和 7-AAD 必须留在缓冲液中。在添加碘化丙啶或 7-AAD 后，切勿洗涤细胞。

5.通过流式细胞术分析样本。

o注释：应当在初始孵育时间后 4 小时内分析细胞，原因是在碘化丙啶或 7-AAD 长时间存在下造成不利影响细胞的活力。储存在 2–8°C 且避光直至准备好分析为止。

 

B：用钙黄绿素染料着染活细胞

 

钙黄绿素 AM、钙黄绿素紫色 AM 和钙黄绿素蓝色 AM 标记用染料轻松穿过细胞膜，从而选择性地标记活细胞，以借助流式细胞术或荧光显微镜进行分析；凋亡细胞以及胞膜受损的死细胞不留存钙黄绿素。推荐用膜联蛋白 V 或 7-AAD 共染色，以引起活细胞和死/凋亡细胞之间的分辨率最大。

&通用注释

钙黄绿素染料是冻干的并且应在用前复溶于无水 DMSO 中。复溶的染料应在复溶后短时间内使用。为短期储存，请与干燥剂一起储存在 -20°C。避免冻融，并且让小瓶在开封前平衡至室温。

可以在用抗体作表面染色之前或之后用钙黄绿素染料染色。建议应染料应由每位研究者滴定，以便在目的测定法中性能最佳。由于钙黄绿素染料不能留存在胞膜受损的细胞中，故这些染料不兼容于胞内染色方案。请参阅下文"用可固定活力染料 (FVD) 着染死细胞，方案 C")，以便用兼容于胞内染色方案的活力染料着染死细胞。

材料

-钙黄绿素染料

o钙黄绿素 AM (超纯级) (货号 65-0853)

o钙黄绿素紫色 450 AM (货号 65-0854)

o钙黄绿素蓝色 AM (货号 65-0855)

- 无水 DMSO

- [可选] 碘化丙啶染色液 (货号00-6990) 或 7-AAD 活力染色液（货号00-6993）

- 流式细胞术染色缓冲液（货号00-4222/222026/222057）

- 12 x 75 mm 圆底管(货号352058）

 

实验方案

1.如对单细胞悬液和/或表面染色所需那样制备细胞。

2.将 1–5 x 10⁶ 个细胞重悬于适量的流式细胞术染色缓冲液 (0.1–1 mL)中。

3.按所需浓度添加钙黄绿素染料并充分混合。(关于推荐的浓度范围，请参见具体的目标钙黄绿素染料的技术数据表。)

o注释：可能需要制作更稀的染料工作溶液，这可以用流式细胞术染色缓冲液或 PBS 进行。

4.在室温下培养30分钟。避光。

5.添加 2 mL 流式细胞术染色缓存液并且在室温按 400-600 x g离心5分钟。弃去上清液。

6.重复步骤 5。

7.[可选] 着染细胞的细胞表面标志物。请参阅我们最佳方案中存在的 "细胞表面标靶染色，方案 A"。

8.通过流式细胞术分析样本。

 

方案 C：用可固定活力染料 (FVD) 着染死细胞

 

可固定活力染料 (FVD) 明亮地着染胞膜受损的细胞并与细胞蛋白质共价交联，不可逆地从所有种类中标记出死细胞。这允许细胞经历超低温保存、固定和透化程序，而死细胞不损失染色强度，确保死细胞可在后续分析中排除；从而改进数据质量。FVD 以一系列颜色可提供，适用配合 UV、紫色、蓝色和红色激光使用。 

&通用注释

&使用 FVD 时的最佳做法

- FVD 作为高质量无水 DMSO 中配制的预稀释溶液供应。应使它们避光防潮。与干燥剂一起储存在≤–70°C。可以冻融多达 20 次。

- 让小瓶在开封前平衡至室温为了染色最明亮，最好在不含氮化物且不含蛋白质的 PBS 中用 FVD 进行染色。

- 可以在表面染色前后用 FVD 染色。用 FVD 染色后，细胞也可以超低温保存后稍后时间分析。建议每位研究者为目的测定法确定最佳浓度。

- FVD 可以与固定、透化和胞内染色组合使用。FVD 也可用于使用活的未固定细胞的实验中。

- 为了补偿，建议仅使用经 FVD 染色的目的细胞样品

- 如果死细胞百分比预期低于 5%，则建议取出小量细胞等份试液并将它们在 65°C 加热 1 分钟，随后立即置于冰上 1 分钟。在这种处理后，热杀灭的细胞可与活细胞 1:1 组合并且随后用 FVD 染色。

 

替代方案 (方案 C3–C5)

 

* 方案 C3、C4 和 C5 为了易用经历修改，这可能导致死细胞的染色强度降低。如果需要最大染色强度，则应避开这些替代性染色方案。建议每位研究者应确定这些方案修改是否提供足够的死细胞染色强度。

* 可以用 FVD 对未裂解的全血染色。请参阅 "方案 C3 " (下文) 了解详情。

* 可以在不含叠氮化物但含蛋白质的 PBS 中染色。这种方法可能导致死细胞群的染色强度略微降低。参阅 "方案 C4 " (下文)。

* 在含叠氮化物且含蛋白质的 PBS，例如流式细胞术染色缓冲液 (货号00-4222/222026/222057)中染色。这种方法可能导致死细胞群的染色强度显著降低和/或活细胞群的背景染色增加。参见 "方案 C4" (下文)。

* 可以将 FVD 添加至添加到抗体混合物，之后将该混合物添加至细胞。染色前，FVD 停留在混合物中的时间应尽可能少。最好使用不含叠氮化物、含蛋白质的缓冲液稀释抗体混合物和 FVD。参见 "方案 C5" (下文)。

 

材料

- Invitrogen™ 可固定活力染料 eFluor ™ 455 (UV) (货号65-0868) –关闭 UV 激光

- Invitrogen™ 可固定活力染料 eFluor 450（货号65-0863) –关闭紫色激光

- Invitrogen™  可固定活力染料 eFluor 506（货号65-0866) –关闭紫色激光

- Invitrogen™  可固定活力染料 eFluor 520（货号65-0867) –关闭蓝色激光

- Invitrogen™  可固定活力染料 eFluor 660（货号65-0864) –关闭红色激光

- Invitrogen™  可固定活力染料 eFluor 780（货号65-0865) –关闭红色激光

 

实验流程

 

C1.12 x 75 mm 管中标准染色

 

材料

- 磷酸盐缓冲液 (PBS)，不含叠氮化物且不含蛋白质

- 流式细胞术染色缓冲液（货号00-4222/222026/222057）

- 12 x 75 mm 圆底管（货号352058）

1.在 12 x 75 mm 管中制备细胞。

2.在不含叠氮化物且不含蛋白质的 PBS 中洗涤细胞 2 次。

3.将细胞按 1-10 x 10106 个细胞/mL 重悬于不含叠氮化物和不含血清/蛋白质的 PBS 中。

o注释：为细胞染色一致，不推荐按低于 0.5 mL 染色。

4.每 1 mL 细胞悬液添加 1 µL FVD，然后立即涡旋混合。

5.在 2-8°C 孵育 30 分钟；避光。

6.用流式细胞术染色缓冲液或等同物洗涤细胞 1–2 次。

7.根据需要继续实验。

 

C2.96 孔板中标准染色

 

材料

- 磷酸盐缓冲液 (PBS)，不含叠氮化物且不含蛋白质

- 流式细胞术染色缓冲液（货号00-4222/222026/222057）

- 96 孔分析平板

1.在 96 孔板中根据需要制备细胞。

2.在不含叠氮化物且不含血清/蛋白质的 PBS 中洗涤细胞 2 次。完全滗析上清液。

3.通过在不含叠氮化物且不含血清/蛋白质的 PBS 中 1:1,000 稀释，配制 FVD 的工作储备液。制得足够用于 100 μL/孔。作为示例，对于 96 孔，将 10 μL FVD 添加至 10 mL PBS。

4.向每个控添加 100 μL FVD 工作储备液，然后通过抽吸或温和涡旋混合立即混合。

5.在 2-8°C 孵育 30 分钟；避光。

6.用流式细胞术染色缓冲液或等同物洗涤细胞 1–2 次。

7.根据需要继续实验。

 

C3.在未裂解的全血中用 FVD 进行染色

 

材料

- 磷酸盐缓冲液 (PBS)，不含叠氮化物且不含蛋白质

- 流式细胞术染色缓冲液（货号00-4222/222026/222057）

- 红细胞裂解缓冲液，如

o1X RBC 裂解缓冲液 (货号00-4333/212010)，

o10X RBC 裂解缓冲液 (多物种) (货号00-4300)，或

o一步法固定/裂解溶液（10X）（货号00-5333）

- 12 x 75 mm 圆底管（货号352058）

 

1.向 12 x 75 mm 管添加未裂解的全血。

2.每 100 μL 全血添加 1 μL FVD。

3.添加 FVD 后，添加其他的表面染色抗体。

注释：或者，可以将 FVD 按每份样品 1 μL 直接添加至表面染色抗体混合物。这种混合物应紧邻添加至全血样品之前制得。

4.在 2-8°C 孵育 30 分钟，避光。

5.用流式细胞术染色缓冲液洗涤样品 1–2 次。

6.裂解红细胞并根据需要继续实验。

 

C4.在含叠氮化物和/或含蛋白的染色缓冲液中用 FVD 染色

 

材料

- 流式细胞术染色缓冲液（货号00-4222/222026/222057）

- 12 x 75 mm 圆底管（货号352058）

 

1.在 12 x 75 mm 管的流式细胞术染色缓冲液中按 1–10 x 10⁶/mL 制备细胞。

2.每 1 mL 细胞悬液添加 1 µL FVD，然后立即涡旋混合。

3.在 2-8°C 孵育 30 分钟；避光。

4.用流式细胞术染色缓冲液洗涤细胞 1–2 次。

5.根据需要继续实验。

 

C5.在抗体混合物中用 FVD 进行染色

 

材料

- 磷酸盐缓冲液 (PBS)，不含叠氮化物且不含蛋白质

- 流式细胞术染色缓冲液（货号00-4222/222026/222057）

- 12 x 75 mm 圆底管（货号352058）

 

1.在 12 x 75 mm 管的 100 μL 缓冲液中按 1–10 x 10 ⁶ 制备细胞 (参见以下备注)。

注释：为了尽可能提高 FVD 亮度，细胞可以重悬于不含叠氮化物且不含血清/蛋白质 "的 PBS 中(如方案 C1：12 x 75 mm 管中标准染色" [参见上文])。如果最大亮度不重要，细胞可以重悬于流式细胞分析染色缓冲液中 ("方案 C4 ：在叠氮化物和/或含蛋白质的染色缓冲液中使用 FVD 进行染色" [参见上文])。

2.在流式细胞术染色缓冲液中配制所需的抗体混合物。

3.紧邻添加至细胞前，将 FVD 按每份待染色样品 0.5-1 μL 添加至抗体混合物。

4.向细胞样品添加 FVD/抗体混合物。

5.在 2-8°C 孵育 30 分钟；避光。

6.用流式细胞术染色缓冲液洗涤细胞 1–2 次。

7.根据需要继续实验