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胚胎干细胞和成体细胞重编程
胚胎干细胞(ES细胞)起源于哺乳动物早期胚胎的全能细胞,是从发育胚胎的胚泡期的内细胞团中分离获得;具有体外无限增殖且保持未分化状态的自我更新特性;胚胎干细胞(ESC)和诱导性多能干细胞(iPSC)是最常研究的两类PSC。iPSC与ESC功能相近,但它是通过成年体细胞中重编程基因(如OCT4、KLF4、SOX2和c-MYC)的异位表达诱导而成。而iPSC能够被诱导分化成有功能的成熟细胞,作为细胞疗法的一种原始材料拥有广阔的前景,可以用于糖尿病、肝脏疾病、帕金森病和阿尔茨海默病等多种疾病的治疗。
1. 多能性干细胞简介
胚胎干细胞(ES细胞)起源于哺乳动物早期胚胎的全能细胞,具有体外无限增殖且保持未分化状态的特性(Evans和Kaufman,1981年;Martin,1981年;Morrison SJ等,1981年)。小鼠未分化ES细胞可在含有细胞因子LIF(白血病抑制因子)的培养基中长期维持(Smith AG等,1988年;Williams RL,1988年)。当从培养基中撤除LIF后,小鼠ES细胞在体外会分化为三胚层来源的各类细胞。与之相反,人类ES细胞的培养无需通过LIF维持其自我更新能力(Thomson JA和Marshall VS,1998年;Shamblott MJ等,1998年)。
血液细胞重编程是通过将Episomal质粒导入人血细胞使之表达多能性因子Oct 4、Sox 2、Klf 4和c-Myc诱导而来,无外源基因的插入整合。在人ES细胞标准培养条件下进行培养时,人iPS细胞与hES细胞表型一致,人iPS细胞表达多能性因子TRA-1-60,SSEA-3和Oct4,并有很强的内源性碱性磷酸酶活性。
2. 胚胎干细胞/多能干细胞培养
待整理
2.1. 小鼠多能干细胞(mPSC): mESC/miPSC细胞培养
待修改
MEF细胞制备
待
2.2. 人多能干细胞(hPSC):hESC/hiPSC细胞培养
待
3. 多能干细胞传代
待
4.多能干细胞冻存和复苏
待
5. 多能干细胞鉴定
胚胎干细胞(ES细胞)的未分化状态以高水平表达POU转录因子Octamer-4(Oct-4)为特征(Pesce M et al., 1998)。Oct-4与多能性之间的密切关联性使得该转录因子成为多能干细胞的核心标志物。未分化的人源及鼠源多能性胚胎干细胞(ES细胞)和胚胎癌干细胞(EC细胞)均表达Oct-4。此外,已知鼠源胚胎生殖干细胞(EG细胞)也可表达Oct-4。在干细胞分化后,Oct-4的表达水平会显著下降。
多能干细胞还可通过多种细胞表面抗原的表达进行表征。SSEA-1(一种碳水化合物抗原)是2型多聚乳糖胺的岩藻糖基化衍生物,出现于小鼠胚胎卵裂晚期阶段。该抗原在小鼠未分化胚胎干细胞(ES细胞)中呈强表达(Solter D, 1978; Gooi HC, 1981)。当小鼠ES细胞分化时,其特征是SSEA-1表达的丢失,在某些情况下可能伴随SSEA-3和SSEA-4的出现(Solter D, 1979)。与之相反,人类ES细胞和胚胎癌(EC)细胞通常表达SSEA-3和SSEA-4而非SSEA-1,其分化过程则以SSEA-3/SSEA-4的下调与SSEA-1的上调为特征(Andrews PW, 1984; Fenderson BA, Andrews PW et al., 1987)。未分化的人类ES细胞还表达与硫酸角质素相关的抗原TRA-1-60和TRA-1-81(Andrews PW, Banting GS et al., 1984)。
iPSC还表达关键转录因子维持未分化的状态,如Nanog和OCT4,它们对细胞分裂、分化和发育至关重要。除了这些转录因子之外,一组特定的细胞表面蛋白(如TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA3和SSEA4)也通常表达于hPSC(人多能干细胞)。使用针对这些多能性标记物的抗体可以实现特定细胞染色和表征分析。
胚胎干细胞多能性标志物:
SSEA-1 | SSEA-3 | SSEA-4 | TRA-1-60 | TRA-1-81 | Oct-4 | Sox-2 | Nanog | c-Myc | |
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Human ESC/iPSC | |||||||||
Mouse ESC/iPSC |
6. 细胞重编程
待
7. 多能干细胞来源类器官研究
待