单克隆抗体制备

单克隆抗体：由一个B细胞克隆或其杂交瘤或通过分子生物学手段克隆构建单个抗体基因转染的细胞系产生的，只能识别一种抗原表位的高度均一的蛋白抗体。

1975年，Georges J. F. Kolhler（德国）和 César Milstein（英国和阿根廷国籍）发表了：Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity，这篇文章第一次阐述了单克隆抗体的制备（抗绵羊红细胞单克隆抗体），两人于1984年与另一位科学家获得诺贝尔生理学和医学奖，遗憾的是Georges J. F. Kolhler比较不幸，48岁时死于实验室火灾事故。

制备单抗主要在于需要制备出一个能够稳定无限遗传的能分泌抗体的B细胞。所以制备单抗需要解决两个基本问题：一个是需要能分泌抗体的B细胞，另一个问题是保证细胞能够稳定遗传。前一个问题，事实上就是免疫动物的问题，后一个问题，就是将B细胞与瘤细胞融合筛选的问题。免疫动物的问题和制备多抗大同小异，后一个问题是制备单抗的核心问题。

首先获得能分泌抗体的B细胞。当成功免疫动物后，便可杀死动物取得脾脏，里面含有我们需要的能分泌抗体的B细胞，但是此B细胞不能无限增殖。为了解决细胞能够稳定传代，需要将B细胞与瘤细胞融合，这样得到的杂交瘤既可以分泌抗体，又可以像肿瘤细胞一样无限增殖。

在B细胞和瘤细胞二者融合过程中，除了B细胞与瘤细胞能融合外，B细胞自身、瘤细胞自身都能发生融合，此外还有多个B细胞与多个瘤细胞融合的情况（这种细胞能稳定存活的机率极小)以及未融合的细胞。B细胞或者B细胞自身融合后，仍然不能无限增殖，在增殖数代后就会死亡，因此如何筛选出B细胞和瘤细胞的融合细胞是问题的关键，为此，科学家在整个单抗制备中开发了HAT选择培养基的策略来筛选成功进行B细胞和瘤细胞融合的细胞。

 核酸的合成是细胞遗传的必备条件，而核酸的合成分为主要合成途径和旁路合成途径（补救合成途径）。核酸的主要合成途径中甘氨酰胺核苷酸被甲基化为甲酰甘氨酰胺核苷酸，这一过程的甲基由N¹⁰-甲酰四氢叶酸完成，甲基化完成后它变为四氢叶酸，在酶的催化下，四氢叶酸可被甲酸经ATP活化而甲基化，重新回到N¹⁰-甲酰四氢叶酸。另外，胸腺嘧啶核苷酸的合成中也有类似的甲基化，此过程中，N⁵N¹⁰-亚甲基四氢叶酸转化为二氢叶酸。二氢叶酸也可以重新转化为N⁵N¹⁰-亚甲基四氢叶酸。

嘌呤类似物（如8-氮杂鸟嘌呤）对瘤细胞进行筛选，嘌呤结构类似物可以参与核酸的旁路合成，但是合成出来的核酸不像正常的核酸那样具有完整的功能，因此这种细胞就会死去，于是存活下来的细胞都不能进行旁路合成核酸，其本质是旁路合成的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT)突变，这种细胞被称为HGRPRT缺陷型(HGPRT^-)，和B细胞融合的瘤细胞即是HGPRT^-细胞。

叶酸的结构类似物，如氨基蝶呤、氨甲蝶呤可以和二氢叶酸还原酶结合，从而阻止了二氢叶酸向N⁵N¹⁰-亚甲基四氢叶酸的转化，因此可以抑制胸腺嘧啶核苷酸的生成。另一方面，由嘌呤合成过程中产生的四氢叶酸也不能重生N10-甲酰四氢叶酸，于是嘌呤的合成路径也中断，这样就达到了阻止核酸主要途径合成的目的。

由于B细胞和瘤细胞（HGPRT-）融合后既能进行主要途径合成核酸，也能进行旁路合成，而瘤细胞则只能进行主要途径合成核酸，所以只需要阻断核酸的主要途径，那么未融合的瘤细胞和瘤细胞自身融合的细胞将会死去，而只有B细胞和瘤细胞的融合细胞能利用旁路合成而得以存活。所以，只需要在培养基中添加氨基蝶呤（A）（或氨甲蝶呤），同时加入次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶核苷酸（T）就可以选择出B细胞和瘤细胞的杂交瘤了，这也就是大家所知道的HAT选择培养基。

不管是制备单抗还是多抗，抗原的设计与制备都是一个非常重要的问题，设计或者制备得不好的抗原有可能完全不能免疫出抗体来。一个良好的抗原必须具体的条件：

（1）分子足够大。对于多肽或蛋白质类的抗原来说，一个抗原决定簇（又叫表位，epitope），通常由6-8个氨基酸残基组成。而平均每5-10kD才有一个表位，因此分子太小的多肽或蛋白是很难有一个表位的。

（2）外源性强。在个体形成的早期就对自身物质形成了免疫耐受，因此如果和机体内的物质完全一样或者是相似就很难引起机体的免疫应答。如果是利用免疫赦免区的成份（如大脑、眼球、睾丸内部成份）则不必考虑外源性。

（3）结构尽量复杂。简单重复的物质是不具有免疫原性的，拿明胶来说，它的分子量非常大，而且外源性也很强，但是组成明胶的氨基酸多为直链氨基酸，在体内容易被降解，因此它的免疫原性很弱。类似地，淀粉、核酸、多聚Lys的免疫原性也很弱。

（4）可降解性好。作为抗原，必须是可以降解的，塑料、不锈钢等难降解的物质免疫原也很弱。由D-型氨基酸组成的物质免疫原性也很弱，同样是因为机体不能降解D-氨基酸组成的蛋白或多肽。

常用的抗原可以通过以下方式制备：

（1） 纯化的天然蛋白质。 由于天然的蛋白存在修饰，而且结构比较复杂（除了线性表位还有结构表位），因此天然的蛋白质是很好的抗原。但是天然的蛋白很难达到较高的纯度，这给免疫和后面的纯化带来了不少麻烦，而且只适合在机体细胞内表达量比较高的蛋白。有一个很典型的例子就是大家使用的二抗，就是从一种动物血清中分离出抗体，然后用它作抗原（有的需要酶解分离出重链和轻链）免疫另一种动物。

（2）纯化的重组蛋白。相对于天然蛋白来说，重组蛋白比较容易获得得较高的纯度，而且鉴定也比较方便，整个生产过程更容易掌握。值得注意的是重组蛋白为了纯化的方便，通常需要带一段标签（如GST、6*His、Myc、MBP、Flag、Fc等)，在免疫中动物体通常会产生这些标签的抗体，在后面的纯化过程中需要去掉这些标签的抗体，比如说可以使用对应的另一种标签的重组蛋白纯化抗体，或者先用纯标签蛋白吸附掉血清中的标签抗体，然后再用重组蛋白纯化目的抗体。6*His这个标签比较小，而且免疫原性弱，因此由它产生的抗体几乎可以忽略，如果用它作为重组蛋白标签就不需要考虑去掉由标签产生的抗体。另外，重组蛋白因为不存在修饰，也不存在高级结构，因此最终生产出来的抗体可能无法识别天然蛋白，难以用于某些实验。

（3）人工合成多肽。很多蛋白属于家族蛋白，而这些家族内的蛋白相似度都很高，以Actin（肌动蛋白）家族来说，alpha-actin、beta-actin、gamma-actin之间的相似度都很高，相互之间只相差几个氨基酸，另外，不同物种之间的Actin同源性也极高，如果用对应的天然蛋白或者重组蛋白免疫动物往往不能产生出抗体，或者生产的抗体可以同时识别这三种肌动蛋白，此时最好的解决办法就是人工合成它们之间不相同的区域作为抗原进行免疫。值得注意的是，根据前面说的，如果分子太小是很难引起机体发生免疫反应的，所以合成好多肽后还需要将多肽连在一个大的载体上以增加其免疫原性，常用的载体有：BSA（牛血清白蛋白）,RSA(兔血清白蛋白),HSA（人血清白蛋白），OVA（卵清蛋白），GST（谷胱甘肽S转移酶），KLH（Knoweyhole Limpet Hemocyanin，钥孔戚血蓝蛋白），MAP（多价抗原肽，主要指多聚Lys）。设计抗原时还需要注意：

    (a)序列上的外源性。设计的多肽序列不能在被免疫的动物体内存在相同的序列，否则你的多肽的部分很难引起免疫反应。关于同源性，可以用Blast去查一下。

 （b)亲水性。蛋白质总是倾向于将亲水部分暴露在外而将疏水部分隐藏在内部，因此设计的多肽应该尽量亲水以便更好地引发免疫反应。DNassist，GCG，ProtScale等软件都可以对多肽序列的亲水性进行预测。

（c)N端与C端的选择。一般来说末端的肽段比中间的肽段好（暴露充分），对于膜蛋白来说，C端疏水性比较强，宜选择N端。

（d）氨基酸的各类。序列中不能含有太多的Pro（脯氨酸),一般可以含有1-2个Pro。另外，尽量包含MHCⅡ 类分子偏好的氨基酸Asp，Tyr，Phe，同时避免容易发生糖基化和磷酸化的位点的氨基酸。

（e）为了偶联载体，通常需要多加一个氨基酸作为“桥”，目前用得比较多的是Cys，它应该加在对抗体产生不重要的那一端。

（f）多肽的长度。为了能够达到一个表位的跨度，设计的多肽不能少于6个氨基酸，通常的要求是8-20个氨基酸，如果设计的多肽太长则可能会形成二级结构，同时合成多肽的成本也比较高。

 

（4）小分子物质。主要是小分子药物，分子量一般不超过1000Da，分子量小于300Da的分子很难获得高亲和力的抗体。含有芳香环的小分子更容易引起免疫反应，但是和人工和成的肽一样，小分子药物也属于半抗原，也需要连接载体才能够进行免疫动物。

（5）组织、全细胞或细胞组分。当我们不清楚自己需要的抗原，比如说想制备出肿瘤特异性抗原的抗体的时候，往往需要以组织、全细胞或者细胞组分作为抗原进行动物免疫。如果以组织作为抗原，则需要切除新鲜的组织，用生理盐水洗干净，然后用滤网和研杵将其分离成单个细胞。 如果是以全细胞作为免疫原，则需要洗去培养基中的血清，建议直接以完整的细胞作为免疫原而不将其破碎，因为完整的细胞具有更强的颗粒性和外源性。组织来源的细胞和人工培养的细胞作为免疫原时宜用腹腔免疫的途径进行动物免疫，而不建议用皮下免疫。对于细胞组分作为抗原，重点则在细胞组分的分离上面。细胞膜和细胞质的分离可以采用低渗法（只需要配一个低浓度的缓冲液，另外加入MgCl₂可以稳定细胞核使其不破碎），也可以加入Ca²⁺进行匀浆，然后再离心，细胞膜就在下面形成沉淀。细胞内部细胞器的分离则主要依靠密度梯度离心。有些细胞器的密度相差比较近，因此可能需要更细的密度梯度离心。有时候也可以采用一些特别的方法进行辅助，如线粒体和过氧化酶体沉降系数很接近,用密度梯度离心的方法不太容易分开，于是可以往老鼠体内注射Triton WR1399,这种去垢剂不能被老鼠代谢掉而积累在肝脏的线粒体内，于是这时候的线粒体密度就变小了，便容易与过氧化物酶体分开了。有关利用细胞进行动物免疫的资料大家可以参考一下相关文献。

    总之，不管是哪一种方式的抗原，纯度都是越高越好，纯度越高，非目的性的免疫反应就小，目的抗体在抗血清中占的比例也就越高。最后需要注意的是，作为抗原，不能有太强的毒性，否则动物会死亡。通常在抗原制备中经常会用到去垢剂，但是免疫动物之前必须确保不含去垢剂，否则很容易引起动物死亡的，尤其是采用静脉加强免疫时，很低浓度的去垢剂就能引起动物的死亡。

制备好抗原后，就要进行动物免疫了。免疫这一步除了动物自身的因素外，还要有良好的免疫计划才能得到更好的免疫效果。

为获得较好的免疫效果，需要可从如下几个方面探讨。

1. 动物的选择：

常见的可以用来制备抗体的动物有：小鼠（Mouse）、大鼠(Rat)、豚鼠(Guinea pig)、仓鼠(Hamster)、兔(Rabbit)、绵羊(Sheep)、山羊(Goat)、马(Horse)、驴(Donkey)、奶牛(Cow），还有的用鸡或者鸭的。选择动物主要考虑两个问题：

（a）能否具有较好的免疫效果。特别是对于抗原是蛋白质的情况，为了保证免疫成功，就要求宿主动物与抗原来源物种之间需要有较远的亲缘关系，如果不太确定亲缘关系的远近，可以把抗原的序列与被免疫的动物相应的蛋白的序列进行一个对比，优先选择同源性较低的物种进行免疫。

（b）考虑抗血清产量的问题，其实很多情况下需要的血清量就很大程度上限制了选择余地。根据实验目的不同，抗血清的用量也有所不同。比如说只想做几次Western Blot，只需要一点点血清就够了，此时就可以选用小鼠这样的小动物；而如果想生产二抗作为商业使用，则可选用羊、驴、马这样的大型动物，大型动物还可以进行多次放血，以提高动物的利用率。下表列出了几种常见的物种以及它们的血清产量：

物种	抗血清产量（含血液中其它成份）
小鼠	每次可采0.1-0.2ml，每月可采两次。也可以一次放血，产量约为1-1.5ml。
豚鼠	每次可采1-2ml，每月可采两次。也可以一次放血，产量约为10-15ml。
兔	每次可采20ml，每月可采两次。也可以一次放血，产量约为100ml。
山羊	每次可采血800ml，每月可采两至三次。
马	每次可采血3L，每月可采两次。一年可以采10L以上。

目前主流做单抗的动物主要有小鼠、兔、大鼠。而且除了Epitomics公司外，其它单位是不可以制备兔单抗的（已申请专利）。另外需要指出的是，实验动物也由相应的机构繁殖和保种，选择动物应该使用特定的动物品系，以保证实验的稳定性。

2. 免疫佐剂（Adjuvant）：

免疫佐剂主要有两个作用：一是刺激机体引起免疫反应；另一个作用是将抗原包起来延缓释放，起到相当于多次刺激的效果。可以用来制备抗体的免疫佐剂主要有这么几类：铝盐、油乳、脂质体、CpG、细胞因子、经过处理的微生物或其代谢物。目前应用得比较广泛的商品化佐剂主要有三种：弗氏佐剂（Freund's Adjuvant）、Ribi Adjuvant、Titermax。弗氏佐剂是应用最多的佐剂，分为弗氏完全佐剂（ Freund's Complet Adjuvant,FCA）和弗氏不完佐剂（Freund's Incomplete Adjuvant,FIA）， 弗氏完全佐剂由石蜡油和羊毛脂以及结核分枝杆菌的细胞壁成分组成，它是细胞免疫的刺激剂。弗氏不完全佐剂不含分枝杆菌，其它同弗氏完全佐剂。弗氏不完全佐剂仅能刺激体液免疫。

通常在免疫动物时，先使用弗氏完全佐剂进行首次免疫，然后用弗氏不完全佐剂作为加强免疫，二者使用前都需要与抗原进行完全乳化。弗氏佐剂会引起动物局部肉芽肿或者无菌性脓肿，人体接触可能导致风湿病，误入眼睛可能造成失明，因此在操作时需要注意防护。

Ribi佐剂则采用可被代谢的角鲨烯代替矿物油，同时它也含有分枝杆菌的成份，与弗氏佐剂相比，它毒性小，可以减小动物的局部接种反应，但是同样可以产生高亲和力的抗体（抗原为蛋白质）。

Titermax不像弗氏佐剂和Ribi那样是油包水的结构，而是由角鲨烯和非离子型嵌段聚合物组成，此聚合物是由疏水性的聚氧丙烯和亲水性的聚氧乙烯形成的异分子多聚体组成的。由于同时存在亲水部分和疏水部分，故可以和抗原形成稳定的乳浊液。Titermax毒性低，但是价格贵，而且对于弱免疫原性的抗原能否引起机体的免疫反应尚存在争议。

佐剂和抗原的乳化： 

大部分佐剂在使用前都需要乳化，怎么样才算乳化好了？对于弗氏佐剂这类油包水结构的佐剂来说，乳化完成后，可以取一滴乳化过的液滴滴在一杯清水里，看看此液滴是否分散，如果不分散则表明乳化完全，否则还要接着乳化。关于乳化的方法，比较好用的有三种：第一种比较费时间，就是将抗原和佐剂放在EP管里，然后用枪反复吹打，然后放在涡旋仪上反复涡旋。第二种方法就是将抗原和佐剂用枪混合后放在超声破碎仪下超声，这个方法比较快速，但是需要一个配有小探头的超声破碎仪。第三种方法也就最简单最常用的方法了：准备好两个玻璃注射器和一个鲁尔接头，将抗原和佐剂用枪在EP管内混合好，然后吸入一个注射器内，再用鲁尔接头将另一个注射器与它接上，把抗原和佐剂来回在两个注射器内推动，两分钟左右就可以完成乳化工作。

3. 免疫方案：

（1）免疫部位：常见的免疫部位有皮下、肌肉、腹腔、脚垫、静脉、脾脏。大型动物多为皮下或肌肉免疫，小型动物可采用后面的免疫部位。制备多抗时，整个流程可采用同一种免疫部位，也可以多种部位联合使用，但是初次免疫都建议在皮下进行。在制备单抗时，甚至还可以将脾脏取出进行体外免疫，脾脏免疫最大的优势就是可以大大减小免疫剂量并缩短周期，而且还可以解决高同源性蛋白无法免疫成功的问题。但体外免疫不能形成完整的免疫应答反应，抗体无法成熟，所产生的抗体全部为IgM，不能产生其它类型的抗体。

(2)免疫形式。抗原通常需要与佐剂混合充分后才进行免疫，也有改进不用佐剂的方法，比如可以将抗原跑SDS-PAGE胶，然后将胶进行磨碎充分即可进行免疫，这样可以将抗原(蛋白质类抗原)纯化，而且还可以延缓抗原的释放。也有人将抗原从SDS-PAGE胶上转移到NC膜上或者PVDF膜上然后将其磨碎进行免疫，还有人将抗原连接到琼脂颗粒等固相载体上，这样可以增加抗原的颗粒化程度，也可以增大抗原与机体免疫应答系统的接触。

（3）免疫剂量。免疫剂量根据被免疫的动物、免疫部位以及抗原的本身的特性相差很远。如果用兔制备多抗，首次免疫（皮下）一般在200-1000ug之间，对于大鼠，首次免疫（皮下）为100-500ug，对于小鼠， 首次免疫（皮下）一般在10-100ug之间，加强免疫一般为首次免疫剂量的20%-50%。尾静脉或脾内方式加强则可减至几微克至十微克。对于体型比较大的动物可酌量增加（不能按照体重比增加)，具体的用量请大家参考文献。 

（4）免疫周期。首次免疫后，一般在10-15d左右抗体的产量会达到一个峰值，但是此时抗体亲和力不够，大部分都是IgM，因此需要进行加强免疫，加强免疫一般在首次免疫后三至四周进行。第二次、第三次加强免疫间隔可以缩短至2-3周。这个时间不太能长也不能太短，太短起不到加强的效果，而且还容易引起免疫耐受，如果相隔太久，则前面的免疫将失去初步刺激的效果。如果是采用脾内免疫，则可以在一定程序上缩短免疫周期。 

 

 关于操作的问题，只作一下简单的介绍，具体如何进行，需要在有相关经验的实验员指导下进行，也可以在网上找到相关视频进行学习。

（1）皮下注射。皮下注射的操作有点像给人接种疫苗，即挑取动物的皮肤，将混好佐剂的抗原直接注射。一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。皮下操作一般由两人进行，一个协助固定小鼠，另一个进行免疫操作。

（2）腹腔注射。腹腔注射比较简单，只需要一人操作，操作者由左手抓住小鼠尾巴和颈部皮肤，将小鼠翻转过来，腹部向上，将抗原直接注射到腹腔。如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。

（3）尾静脉注射。尾静脉注射是技术要求最高的一种注射方式，操作者需要固定小鼠，然后将抗原注射到小鼠尾部静脉（正中间那根血管）。小鼠尾静脉比较细小，一般新手很难操作成功，需要在其它小鼠身上多次尝试才可以进行免疫操作。静脉注射抗原对抗原的要求更高，抗原必须不含去垢剂和其它有毒成份，否则极容易引起动物死亡，而且免疫剂量也不宜过大。

（4）脾内注射。脾内注射是效果最好的免疫方式，因为这种方式使得脾细胞直接与抗原接触，所以很容易引起免疫应答反应。具体操作方法：先用乙醚或戊巴比妥钠进行麻醉，乙醚麻醉过程比较简单，技术含量低，对于初学者比较适用，推荐。事先准备一块棉花，将少量乙醚倒在棉花上，用一烧杯倒扣住，将小鼠也扣在烧杯下，一般在一分钟内小鼠就可以晕到，此时将小鼠取出，用胶带固定在木板或实验台上（腹部向下，背面向上。无需无菌），用手术剪刀剪开背部左侧皮肤（大至就是脾脏所在的位置，不要剪开内膜），剪开小口后，用手将剪口撕大看到腹膜内脾脏即可用注射器刺穿腹膜，插入脾脏，直接注射抗原，抽出注射器。然后用胶水（推荐AB胶，五金店有卖的）将剪口周围的毛粘好，胶干后在伤口周围涂上抗生素即可，无需要无菌操作。由于需要用到胶水，所以手术前不要用酒精消毒。

完成首次免疫和加强免疫后，可以取出少量血清进行效价检测，达到足够高的效价后即可进行冲击免疫，冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。

在单抗制备过程中，除了通过免疫动物得到可分泌抗体的B细胞外，还可以将未免疫的小鼠脾脏取出，在体外进行免疫，从而大大加快制备周期，其基本方法是：取出未免疫小鼠的脾脏，处理成为单个细胞，然后在完全培养基中培养，同时加入一定浓度的抗原刺激其产生抗体。需要注意的是，这种方法由于不存在完整的免疫应答路径，所以只能产生出亲和力不成熟的IgM型的抗体，大部分实验中基本不能使用这种抗体（除非是专门研究IgM抗体特性）。

免疫小鼠：取 6~8 周龄 Balb/C 雌鼠，基础免疫 2 周，静脉再加强免疫一次，3 天后用于融合。

此节将介绍制备单抗的培养基体系。

 RPMI 1640培养基（Roswell Park Memorial Institute Medium 1640） （下面简称1640）

最初是Roswell Park Memorial Institute用来培养人的淋巴细胞的培养基，后来被广泛地应用到大部分悬浮细胞的培养中（1640培养基配方）。商品化的1640大多以固体形式出售，也有少数是配好的液体。有的商品化1640中不含碳酸氢钠（稳定pH作用）、不含HEPES（稳定pH作用）、丙酮酸钠（提供碳源）、谷氨酰胺，配制前需要仔细阅读说明书，按照说明书的要求加入需要额外加入的成份，尤其是谷氨酰胺，它是细胞增殖必不可少的成份，而且谷氨酰胺特别容易分解，配制完培养基后应该尽快用完，暂时不能用完的放在4℃或者-20℃保存。大部份商品化的1640培养基中都含有酚红作为酸碱指示剂，1640的pH为7.2-7.4，指示剂显示为红色（如果偏酸则显黄色，偏碱则呈紫色）。

DMEM培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium） 

DMEM是在Basal Medium Eagle的基础上改进的，最初用于鼠胚胎细胞的培养，后来广泛地应用于各种贴壁细胞的培养或者发酵罐培养。与1640培养基相比，DMEM培养基营养更为丰富。DMEM培养基有两种类型，一种是高糖型，主要用来培养高密度悬浮细胞，另一种是低糖型，主要用来培养普通的贴壁细胞，点击这里查看DMEM培养基配方。与1640培养基一样，商品化的DMEM培养基使用之间也要按照说明书的要求添加指定的成份。

由于单抗制备（小鼠）中的杂交瘤细胞是半贴壁型的细胞，因此上述两种培养基都可以用来培养杂交瘤细胞。但是这些培养基并不能直接使用，而在使用之前需要加入15%-20%胎牛血清，胎牛血清可以为细胞提供更多的生长因子和激素等活性物质，添加了胎牛血清的培养基称为完全培养基，否则称作不完全培养基。

在单抗制备中，由于需要进行选择性杀死非目标细胞，所以使用添加HAT的选择性培养基，通常HAT中，H（次黄嘌呤）的浓度为1×10^-4M，A（氨基蝶呤）为4×10^-7M，T（胸腺嘧啶）为1.6×10^-5M，在HT培养基中，只需要不加氨基蝶呤，其它都同HAT。另外，在细胞培养中，一般都加入抗生素防止细胞污染，通常用的抗生素有青霉素（100U/ml）和链霉素（100ug/ml）、四环素(50ug/ml)、庆大霉素（50ug/ml），其中青霉素和链霉素联合使用较为常用，俗称“双抗”。由于细胞培养中几乎所有的成份对高温都不稳定，所以绝对不能使用高温灭菌，而是采用0.22um滤膜过滤除菌。通常，先配好不完全培养基（要加抗生素），然后在超净台上抽滤、分装，取少量分装的培养基加入至液体LB培养基里37℃培养过夜进行无菌测试，其它的培养基则放在-20℃保存。确认培养基无菌后才能使用。

HT、HAT则配成相应的母液（可用PBS配制，也可以用不完全培养基配制，一般配为50×浓度保存）。培养基使用前根据需要加入HAT或HT以及血清才可以使用。

HAT 培养基的制备 

[贮备液成分]100× 次黄嘌呤（Hypoxanthine: H） 胸腺嘧啶核苷（Thymidine: T） 氨基喋呤（Amiropterin: A）

 [HT 贮备液制备]

1．称取 136.1 mg H，38.8 mg T。

2．依次溶解在 100ml 双蒸水中，H 难溶，可加温 50~80℃促溶。

3．用 0.22 微米滤膜滤过除菌，每瓶分装 2~5ml，-20℃冰箱贮存。

[A 贮备液制备 ]

1．称取 17.6mg A 到 90ml 双蒸水中。

2．滴加 1M NaOH 溶液并不断摇动，直至完全溶解，再滴加等量 1M HCl 溶液，恢复 pH 在 7.0 左右。 

3．补足双蒸水至最终体积 100ml。

4．0.22 微米滤膜滤过除菌，分装，-20℃冰箱贮存。

使用时，每 100ml 培养液（含血清）加 1ml HT 贮备液和 1ml A 贮备液。

      在体外培养细胞实验中，对于难培养的细胞或者数量较少的细胞，常常需要预先在培养瓶或培养板底部加入一些活的原代细胞或者静息的肿瘤细胞以辅助目的细胞的生长，这就是饲养层细胞。饲养层细胞可以减小培养瓶或培养板对细胞的毒害作用；另外，饲养层细胞可以释放出一些必要的生长因子，可以促进目的细胞的生长。总之，饲养层细胞可以为难培养的细胞提供一个比较适宜的生长环境以支持细胞的生长。在单抗制备过程中，刚刚融合的细胞和克隆化的细胞都比较难以生长，因此都需要添加饲养层才能较快地生长。

作为饲养层细胞，来源有两种，一种是动物体内天然的细胞，另一种是经过处理的静息的肿瘤细胞。单抗制备中可以使用的饲养层细胞有这么几种：

（1）腹腔巨噬细胞。巨噬细胞不仅可以作为饲养层，而且它还可以吞噬掉死亡的细胞碎片，起到环境清理的作用。其制备方法是：杀死小鼠，用酒精浸泡数分钟，取出小鼠放在解剖板上，用大头针固定好四肢，在超净台上用一个镊子挑起腹部皮肤，用手术剪刀剪开腹部皮肤，换一把干净镊子夹住腹膜，用另一把镊子捅破腹膜，用巴氏管向腹腔内加两至三管不完全培养基，吹打几次，吸出培养基，吸出的培养基里即含有腹腔巨噬细胞，反复进行两至三次即可基本取彻底。将取出的细胞1200RPM离心5min，去掉上清，向沉淀中加入适量的完全培养基（用于刚融合的细胞需要加HAT，用于克隆化的细胞需要加HT），用巴氏管反复吹打均匀，可用血球计数板计数（一般一只老鼠的腹腔巨噬细胞约为3×10⁶个）。根据计数的结果将巨噬细胞稀释到合适的浓度（以96孔板为例，平均每孔含1×10⁴个巨噬细胞为宜）,稀释好后，用巴氏管吸取此饲养层细胞按合适的体积滴到96孔板或24孔板上（平均每只老鼠的腹腔巨噬细胞可铺两至三块96孔板）。饲养层细胞应在使的前一天制备好，这样才能分泌足够的细胞因子。

（2）脾脏细胞。脾细胞与杂交瘤的来源细胞上有很高的同源性，因此与杂交瘤的“兼容性”较好，是作为饲养层的不错选择。其制备方法和腹腔巨噬细胞过程类似，只是需要剪开腹膜，取出脾脏，用镊子剥去脾脏外的结缔组织，将脾脏放在200目不锈刚细胞筛网上，用5ml注射器的针芯挤压脾脏，使分散的脾细胞通过筛网落入下面的容器（培养皿），用少量不完全培养基冲洗、吹匀脾细胞，收集离心，计数稀释同腹腔巨噬细胞制备过程，一只老鼠的脾脏细胞总数约为2×10⁸-3×10⁸个，以96孔为例，每孔需要约1×10⁵个脾细胞。

（3）胸腺细胞。胸腺与脾脏中的淋巴细胞最初起源相同，只是各自在不同的器官成熟而已。因此胸腺也是作为饲养层的选择之一，而且与脾细胞不同，胸腺细胞不会分泌抗体而对实验产生干扰。其制备过程类似于脾脏细胞饲养层的制备。只是取胸腺的时候不是打开腹腔，而是打开胸腔，胸腺是位于胸腔与心脏同侧的一小块白色器官，取胸腺时不要与肺混淆。其分离过程与脾脏类似。最终用量以96孔为例，每孔需要约5×10⁵个胸腺细胞。

（4）放射线照射的成纤维细胞系。小鼠成纤维细胞系易培养，加之技术比较成熟，所以其应用也较多。具体操作是这样的：将NIH3T3细胞传代至细胞培养瓶，密度不超过50%，用新鲜培养基培养24小时，用胰酶消化下来，用培养基重悬至2-4×10⁶个细胞/ml,用剂量为6000rad左右的60Co γ射线照射，换用新鲜的完全培养基稀释至需要的浓度（以96孔板为例，每孔需要约2×10⁴个细胞）滴在培养板里，此过程需要在使前12小时进行。如果一次制备的这种饲养层较多，还可以将其冻存起来（48小时之内可以放4℃保存，长时间则需在液氮中保存）。除了NIH3T3细胞外，还可以使用STO细胞系或者MEF细胞系制备这种饲养层。由于60Co并不是每个实验室都具备，因此这种饲养层的制备受到设备的限制比较大，一种比较好的解决方法就是用丝裂霉素C处理NIH3T3细胞作为饲养层，其方法是：将NIH3T3细胞传代至细胞培养瓶，密度不超过50%，用新鲜的培养基培养24小时，向培养基中加入丝裂霉素C至终浓度为 10μg/ml，继续培养12小时，弃去培养基，用新鲜的培养基洗涤三次，最后一次洗涤放在37℃进行10-20min，将洗好的细胞用胰酶消化下来， 用完全培养基重悬至合适浓度滴在培养板里（以96孔板为例，每孔需要约2×10⁴个细胞），此过程也应在使用前12小时进行。注意：一定要洗干净丝裂霉素C，否则严重影响杂交瘤细胞的生长。

    需要指出的是，饲养层并不是培养杂交瘤细胞一定必须的，但是它确实可以在很大程度上提高细胞的成活率、加快细胞生长速度，因此强烈推荐使用饲养层。

细胞融合：广义上的细胞融合指两个或者多个细胞的原生质体融合形成一个杂种细胞的过程。广义上的细胞融合可以是同种属的细胞发生，也可以是不同种属的细胞发生。 在单抗制备过程中的细胞融合专指瘤细胞与脾细胞的融合。 在介绍融合技术之前，有必要先了解一下骨髓瘤细胞。

骨髓瘤细胞的选择    

为了便于筛选出成功融合的杂交瘤细胞，需要选择DNA合成主要途径缺陷型的骨髓瘤细胞（HGPRT-或TK-）与脾细胞融合，通常是HGPRT-的骨髓瘤细胞。要得到这种细胞需要做两件事，第一是得到骨髓瘤细胞，第二步是诱导和筛选出HGPRT-的骨髓瘤细胞。一般可以通过向小鼠腹腔内注射碳氢化合物、石蜡或者油类物质而诱发其产生骨髓瘤细胞，通常的做法是注射降植烷（Pristane，又称姥鲛烷）。诱导出骨髓瘤后，在无菌条件下取出此骨髓瘤，用完全培养基培养一段时间后，再用8-氮杂鸟嘌呤或者5-溴脱氧尿嘧啶核苷酸进行筛选即可得到HGPRT- 的骨髓瘤细胞。对于第一步的诱导过程，目前只有BALB/C和N2B品系的小鼠才具有高度的敏感性。目前最常用的骨髓瘤是来自BALB/C小鼠的，为了减小远亲属种系之间的排斥反应，单抗制备中用来免疫的动物品系应该与骨髓瘤来源的品系相同。1972年，Potter第一次从Balb/C小鼠中分离骨髓瘤细胞株MOPC,第一次用于脾细胞融合的骨髓瘤细胞株为P3-X63-Ag8,简称X63或P3，它由Milstain实验室将P3K(源自MOPC)细胞系经8-Aza筛选得到。X63自身不能分泌完整的免疫球蛋白，但是可以合成并分泌γ1重链和κ轻链，因此如果用X63骨髓瘤细胞与脾脏融合，得到的融合细胞除分泌脾细胞的抗体外，还可以分泌X63的γ1链和κ链。后来又从P3K细胞系选育出另一变种P3-NS1-Ag4-1,简称NS-1,它不能合成 γ1重链，能合成κ轻链，但是合成之后在细胞内降解而不能被分泌出来。后来人们又陆续地筛选出完全不产生自身Ig的骨髓瘤细胞系，如最常见的SP2/0。目前可用于融合的小鼠骨髓瘤细胞系种类见下表：

细胞系	简称	来源	染色体数	分泌Ig链
P3-X63-Ag8	P3或X63	Balb/C小鼠MOPC21	65	γ1,κ
P3-NS1/1-Ag4-1	NS1	P3	65	κ(非分泌型)
SP2/0-Ag14	SP2/0	P3和Balb/C脾细胞杂交	72	-
P3-X63-Ag8.653	P3-653	P3	58	-
P3-X63-Ag8-UI	P3UI	P3		-
FO		SP2/0-Ag14克隆	72	-
S194/5.XX0.BU1	S194	Balb/C小鼠		κ(非分泌)
MPC11-X45.6TG	MPC11	Balb/C小鼠	62	IgG2b,κ

用于融合的骨髓瘤细胞在使用前应先置于含有八-氮杂鸟嘌呤或者5-溴脱氧尿嘧啶核苷酸等筛选培养基中培养，以确保骨髓瘤细胞无回复突变，此过程持续两周左右改为正常完全培养基培养。在融合前，骨髓瘤细胞必须保持非常良好的状态才可以保证有较高的融合率，一般保证生长至60-80%左右密度时认为是对数生长强壮期。另一种比较好的解决方案是（以SP2/0细胞为例）：将复苏培养数天的骨髓瘤接种于小鼠皮下，约两周后小鼠皮下就会生长出可见的肉瘤，将此肉瘤无菌取出研磨成单个细胞，计数后也可用于融合。

脾脏单细胞悬液的制备 

完成小鼠的免疫流程后，间接法ELISA测定血清效价在1:8000以上或免疫扩散实验效价在1:16以上时即可进行冲击免疫（详见单抗制备动物免疫一节），冲击免疫完成后96小时内处死小鼠。处死小鼠可采用断颈处死，也可以采用摘眼球放血处死。处死小鼠后，将小鼠浸泡于75%酒精中5分钟，然后用大头针将其四肢固定在干净木板或纸板上（腹部向上），放进超净台，用无菌镊子和剪刀依次剪开皮肤和腹膜，换用另一套镊子和剪刀无菌取出脾脏，放入一小皿中（小皿中事先放好一小块200目细胞滤网），加入几滴不完全培养基，然后用一注射器针芯将脾脏磨成单个细胞，用巴氏管将此细胞转入离心管后，加入适量培养基，离心（1200RPM左右，下同）洗去脾脏中带入的鼠源血清。重复洗一次再用不完全培养基重悬即得到脾细胞悬液。

细胞融合的介导 

自然状态下，细胞之间很难发生融合。1958年，日本冈田善雄利用仙台病毒成功介导动物细胞融合，但是其诱导效率低，而且诱导不稳定，可重复性差。自20世纪70年代起，不断有人发现许多化学试剂也可以使细胞进行融合。主要包括盐类（如NaNO₃、KNO₃、NaCl、MgCl₂、CaCl₂）、聚乙二醇（PEG）、二甲亚砜（DMSO）、甘油-醋酸脂、脂质、Ca²⁺络合物等。后来，人们又发明了电融合和激光融合，更进一步提高了细胞融合的效率。与化学试剂融合相比较，电融合和激光融合效率更高，但是成本也高，操作复杂。因此，目前在单抗制备中都选择化学试剂进行细胞融合，目前最常用的则是聚乙二醇（PEG）融合法，其原理是PEG剥夺细胞周围的水分子，使细胞高度脱水而原生质形成凝集，细胞膜发生扭曲，同时膜内蛋白颗粒易位并凝聚，而膜脂的流动性发生较大改变，相邻的细胞之间细胞膜局部发生融合，之后逐渐扩大，最终发生融合。PEG分子量越大，对细胞的毒害也越大，分子量越小，融合速度和效率也较低下。常用的PEG分子量在200-20000之间，更多地是1000-4000之间，使用前用高温灭菌，再用不完全培养基或PBS配制。

影响细胞融合效率的因素 

影响细胞融合效率的因素有很多，以PEG介导的融合为例，主要的因素有：

（1）参与融合的细胞状态。无论是脾细胞还是骨髓瘤细胞，融合前都必须处于一个非常良好的状态。对于脾细胞，要求动物健康，即取即用，即使有非常特殊的情况，取出脾脏后需要在体外先进行培养一段时间的，也不能超过两至三天。骨髓瘤细胞在使用前至少两周应停止使用筛选培养基（如含8-氮杂鸟嘌呤或5-溴尿嘧啶的培养基），使用前保证骨髓瘤的生长密度为80%左右为宜。

（2）PEG的分子量和浓度。前面说过，PEG的分子量越大，对细胞的毒害作用就越大，但是分子量越小，融合效果也就越小。PEG的浓度也有类似的关系，因此通常使用的PEG浓度一般在30%-60%之间。需要注意的是，当脾脏细胞与骨髓瘤细胞混合离心后，一定要彻底除掉洗涤液，否则会大大改变PEG的有效浓度。

（3)PEG的pH以及作用时间。经验告诉我们，PEG的pH配在8.0-8.2时效果最佳。PEG的作用时间与其分子量成反比，也与其浓度成反比。一般PEG的直接作用时间在一至五分钟。

（4）融合时的温度。细胞融合本质上要涉及细胞膜的流动，而细胞膜的流动速度与环境温度成正比。一般融合时的温度都在37-40℃。

（5）离子环境。有文献报道，在融合的PEG里添加Ca²⁺有利于提高细胞融合的效率。文献报道的Ca²⁺最佳浓度都在50mmol/ml左右。

（6）操作上的因素。将脾细胞与骨髓瘤细胞混合前应将二者充分吹打均匀，离心时速度不可太大也不可太小。如果离心速度太大，骨髓瘤细胞会优先沉淀到离心管底部，如果离心速度太小，则脾细胞可能不能完全被沉淀下去。

  细胞融合操作步骤 

以SP2/0为瘤细胞为例，一个典型的融合过程如下:

 (1) 按前面讲述的方法免疫小鼠，确认免疫成功后，杀死小鼠，按上述方法制备脾脏单细胞悬液，离心之前取少量悬液进行细胞计数，计算出整个脾脏所包含的细胞个数。

（2）融合前一天将SP2/0细胞传代一次，调整好密度，按经验保证在融合时其密度应在80%左右。融合时，将SP2/0从培养瓶上吹下，离心（800RPM左右，下同）弃去培养基，再用不完全培养基或PBS洗涤一次，弃上清再用不完全培养基或PBS重悬，取少量悬液计数。 如果采用小鼠制备骨髓瘤，可按脾脏单细胞悬液制备方法制备成单细胞悬液。取少量悬液计数。

（3）按SP2/0:脾细胞以1:2-1:10的比例取合适量的SP2/0悬液，将脾细胞悬液和SP2/0细胞悬液混合离心（1200RPM），将上清倒干净。用无血清培养基洗涤2-3次，倒掉上清，可以用滤纸吸取残留的上清。

（4）吸取1ml事先预热至37℃的PEG，在1min内滴入脾脏细胞和骨髓瘤细胞的混合体系中。滴加PEG时动作要轻，并且所有操作尽量在37-40℃环境下进行。在 60 秒内加完，同时并不断轻微转动离 心管或用手指轻弹离心管。

（5）在不断转动离心管中加 1ml 无血清培养液，60 秒钟内加完。

（6）静置1min后，在5min内加入20-30ml不完全培养基（无血清），以终止PEG的作用。此时细胞对机械损伤非常敏感。

（7）离心（800RPM,8 min）去掉上清，再用10ml完全培养基（含HTA和胎牛血清，也有在第二天使用HAT培养基的）重悬起融合完成的细胞，将其平均地滴在96孔培养板上（培养板上需在融合前一天滴入饲养层细胞）。平均每个脾脏融合后滴在5-10块培养板上为宜。如果使用半固体培养基培养，可将融合好的细胞混在37℃左右的培养基上，然后倒在平板里培养（这种方法的操作详见“交杂瘤细胞的克隆化”一节。）

 (8)四天后，可以看出培养基颜色变黄，此时应该换液一次，换液后三天时再换一次，显微镜下可以看到克隆形成。继续培养两至三天，便可以检测细胞上清中是否有目的抗体出现。