单克隆抗体制备

单克隆抗体：由一个B细胞克隆或其杂交瘤或通过分子生物学手段克隆构建单个抗体基因转染的细胞系产生的，只能识别一种抗原表位的高度均一的蛋白抗体。

1975年，Georges J. F. Kolhler（德国）和 César Milstein（英国和阿根廷国籍）发表了：Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity，这篇文章第一次阐述了单克隆抗体的制备（抗绵羊红细胞单克隆抗体），两人于1984年与另一位科学家获得诺贝尔生理学和医学奖，遗憾的是Georges J. F. Kolhler比较不幸，48岁时死于实验室火灾事故。

制备单抗主要在于需要制备出一个能够稳定无限遗传的能分泌抗体的B细胞。所以制备单抗需要解决两个基本问题：一个是需要能分泌抗体的B细胞，另一个问题是保证细胞能够稳定遗传。前一个问题，事实上就是免疫动物的问题，后一个问题，就是将B细胞与瘤细胞融合筛选的问题。免疫动物的问题和制备多抗大同小异，后一个问题是制备单抗的核心问题。

首先获得能分泌抗体的B细胞。当成功免疫动物后，便可杀死动物取得脾脏，里面含有我们需要的能分泌抗体的B细胞，但是此B细胞不能无限增殖。为了解决细胞能够稳定传代，需要将B细胞与瘤细胞融合，这样得到的杂交瘤既可以分泌抗体，又可以像肿瘤细胞一样无限增殖。

在B细胞和瘤细胞二者融合过程中，除了B细胞与瘤细胞能融合外，B细胞自身、瘤细胞自身都能发生融合，此外还有多个B细胞与多个瘤细胞融合的情况（这种细胞能稳定存活的机率极小)以及未融合的细胞。B细胞或者B细胞自身融合后，仍然不能无限增殖，在增殖数代后就会死亡，因此如何筛选出B细胞和瘤细胞的融合细胞是问题的关键，为此，科学家在整个单抗制备中开发了HAT选择培养基的策略来筛选成功进行B细胞和瘤细胞融合的细胞。

 核酸的合成是细胞遗传的必备条件，而核酸的合成分为主要合成途径和旁路合成途径（补救合成途径）。核酸的主要合成途径中甘氨酰胺核苷酸被甲基化为甲酰甘氨酰胺核苷酸，这一过程的甲基由N¹⁰-甲酰四氢叶酸完成，甲基化完成后它变为四氢叶酸，在酶的催化下，四氢叶酸可被甲酸经ATP活化而甲基化，重新回到N¹⁰-甲酰四氢叶酸。另外，胸腺嘧啶核苷酸的合成中也有类似的甲基化，此过程中，N⁵N¹⁰-亚甲基四氢叶酸转化为二氢叶酸。二氢叶酸也可以重新转化为N⁵N¹⁰-亚甲基四氢叶酸。

嘌呤类似物（如8-氮杂鸟嘌呤）对瘤细胞进行筛选，嘌呤结构类似物可以参与核酸的旁路合成，但是合成出来的核酸不像正常的核酸那样具有完整的功能，因此这种细胞就会死去，于是存活下来的细胞都不能进行旁路合成核酸，其本质是旁路合成的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT)突变，这种细胞被称为HGRPRT缺陷型(HGPRT^-)，和B细胞融合的瘤细胞即是HGPRT^-细胞。

叶酸的结构类似物，如氨基蝶呤、氨甲蝶呤可以和二氢叶酸还原酶结合，从而阻止了二氢叶酸向N⁵N¹⁰-亚甲基四氢叶酸的转化，因此可以抑制胸腺嘧啶核苷酸的生成。另一方面，由嘌呤合成过程中产生的四氢叶酸也不能重生N10-甲酰四氢叶酸，于是嘌呤的合成路径也中断，这样就达到了阻止核酸主要途径合成的目的。

由于B细胞和瘤细胞（HGPRT-）融合后既能进行主要途径合成核酸，也能进行旁路合成，而瘤细胞则只能进行主要途径合成核酸，所以只需要阻断核酸的主要途径，那么未融合的瘤细胞和瘤细胞自身融合的细胞将会死去，而只有B细胞和瘤细胞的融合细胞能利用旁路合成而得以存活。所以，只需要在培养基中添加氨基蝶呤（A）（或氨甲蝶呤），同时加入次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶核苷酸（T）就可以选择出B细胞和瘤细胞的杂交瘤了，这也就是大家所知道的HAT选择培养基。

不管是制备单抗还是多抗，抗原的设计与制备都是一个非常重要的问题，设计或者制备得不好的抗原有可能完全不能免疫出抗体来。一个良好的抗原必须具体的条件：

（1）分子足够大。对于多肽或蛋白质类的抗原来说，一个抗原决定簇（又叫表位，epitope），通常由6-8个氨基酸残基组成。而平均每5-10kD才有一个表位，因此分子太小的多肽或蛋白是很难有一个表位的。

（2）外源性强。在个体形成的早期就对自身物质形成了免疫耐受，因此如果和机体内的物质完全一样或者是相似就很难引起机体的免疫应答。如果是利用免疫赦免区的成份（如大脑、眼球、睾丸内部成份）则不必考虑外源性。

（3）结构尽量复杂。简单重复的物质是不具有免疫原性的，拿明胶来说，它的分子量非常大，而且外源性也很强，但是组成明胶的氨基酸多为直链氨基酸，在体内容易被降解，因此它的免疫原性很弱。类似地，淀粉、核酸、多聚Lys的免疫原性也很弱。

（4）可降解性好。作为抗原，必须是可以降解的，塑料、不锈钢等难降解的物质免疫原也很弱。由D-型氨基酸组成的物质免疫原性也很弱，同样是因为机体不能降解D-氨基酸组成的蛋白或多肽。

 

常用的抗原可以通过以下方式制备：

（1） 纯化的天然蛋白质。 由于天然的蛋白存在修饰，而且结构比较复杂（除了线性表位还有结构表位），因此天然的蛋白质是很好的抗原。但是天然的蛋白很难达到较高的纯度，这给免疫和后面的纯化带来了不少麻烦，而且只适合在机体细胞内表达量比较高的蛋白。有一个很典型的例子就是大家使用的二抗，就是从一种动物血清中分离出抗体，然后用它作抗原（有的需要酶解分离出重链和轻链）免疫另一种动物。

（2）纯化的重组蛋白。相对于天然蛋白来说，重组蛋白比较容易获得得较高的纯度，而且鉴定也比较方便，整个生产过程更容易掌握。值得注意的是重组蛋白为了纯化的方便，通常需要带一段标签（如GST、6*His、Myc、MBP、Flag、Fc等)，在免疫中动物体通常会产生这些标签的抗体，在后面的纯化过程中需要去掉这些标签的抗体，比如说可以使用对应的另一种标签的重组蛋白纯化抗体，或者先用纯标签蛋白吸附掉血清中的标签抗体，然后再用重组蛋白纯化目的抗体。6*His这个标签比较小，而且免疫原性弱，因此由它产生的抗体几乎可以忽略，如果用它作为重组蛋白标签就不需要考虑去掉由标签产生的抗体。另外，重组蛋白因为不存在修饰，也不存在高级结构，因此最终生产出来的抗体可能无法识别天然蛋白，难以用于某些实验。

（3）人工合成多肽。很多蛋白属于家族蛋白，而这些家族内的蛋白相似度都很高，以Actin（肌动蛋白）家族来说，alpha-actin、beta-actin、gamma-actin之间的相似度都很高，相互之间只相差几个氨基酸，另外，不同物种之间的Actin同源性也极高，如果用对应的天然蛋白或者重组蛋白免疫动物往往不能产生出抗体，或者生产的抗体可以同时识别这三种肌动蛋白，此时最好的解决办法就是人工合成它们之间不相同的区域作为抗原进行免疫。值得注意的是，根据前面说的，如果分子太小是很难引起机体发生免疫反应的，所以合成好多肽后还需要将多肽连在一个大的载体上以增加其免疫原性，常用的载体有：BSA（牛血清白蛋白）,RSA(兔血清白蛋白),HSA（人血清白蛋白），OVA（卵清蛋白），GST（谷胱甘肽S转移酶），KLH（Knoweyhole Limpet Hemocyanin，钥孔戚血蓝蛋白），MAP（多价抗原肽，主要指多聚Lys）。设计抗原时还需要注意：

(a)序列上的外源性。设计的多肽序列不能在被免疫的动物体内存在相同的序列，否则你的多肽的部分很难引起免疫反应。关于同源性，可以用Blast去查一下。

（b)亲水性。蛋白质总是倾向于将亲水部分暴露在外而将疏水部分隐藏在内部，因此设计的多肽应该尽量亲水以便更好地引发免疫反应。DNassist，GCG，ProtScale等软件都可以对多肽序列的亲水性进行预测。

（c)N端与C端的选择。一般来说末端的肽段比中间的肽段好（暴露充分），对于膜蛋白来说，C端疏水性比较强，宜选择N端。

（d）氨基酸的各类。序列中不能含有太多的Pro（脯氨酸),一般可以含有1-2个Pro。另外，尽量包含MHCⅡ 类分子偏好的氨基酸Asp，Tyr，Phe，同时避免容易发生糖基化和磷酸化的位点的氨基酸。

（e）为了偶联载体，通常需要多加一个氨基酸作为“桥”，目前用得比较多的是Cys，它应该加在对抗体产生不重要的那一端。

（f）多肽的长度。为了能够达到一个表位的跨度，设计的多肽不能少于6个氨基酸，通常的要求是8-20个氨基酸，如果设计的多肽太长则可能会形成二级结构，同时合成多肽的成本也比较高。

 

（4）小分子物质。主要是小分子药物，分子量一般不超过1000Da，分子量小于300Da的分子很难获得高亲和力的抗体。含有芳香环的小分子更容易引起免疫反应，但是和人工和成的肽一样，小分子药物也属于半抗原，也需要连接载体才能够进行免疫动物。

（5）组织、全细胞或细胞组分。当我们不清楚自己需要的抗原，比如说想制备出肿瘤特异性抗原的抗体的时候，往往需要以组织、全细胞或者细胞组分作为抗原进行动物免疫。如果以组织作为抗原，则需要切除新鲜的组织，用生理盐水洗干净，然后用滤网和研杵将其分离成单个细胞。 如果是以全细胞作为免疫原，则需要洗去培养基中的血清，建议直接以完整的细胞作为免疫原而不将其破碎，因为完整的细胞具有更强的颗粒性和外源性。组织来源的细胞和人工培养的细胞作为免疫原时宜用腹腔免疫的途径进行动物免疫，而不建议用皮下免疫。对于细胞组分作为抗原，重点则在细胞组分的分离上面。细胞膜和细胞质的分离可以采用低渗法（只需要配一个低浓度的缓冲液，另外加入MgCl₂可以稳定细胞核使其不破碎），也可以加入Ca²⁺进行匀浆，然后再离心，细胞膜就在下面形成沉淀。细胞内部细胞器的分离则主要依靠密度梯度离心。有些细胞器的密度相差比较近，因此可能需要更细的密度梯度离心。有时候也可以采用一些特别的方法进行辅助，如线粒体和过氧化酶体沉降系数很接近,用密度梯度离心的方法不太容易分开，于是可以往老鼠体内注射Triton WR1399,这种去垢剂不能被老鼠代谢掉而积累在肝脏的线粒体内，于是这时候的线粒体密度就变小了，便容易与过氧化物酶体分开了。有关利用细胞进行动物免疫的资料大家可以参考一下相关文献。

    总之，不管是哪一种方式的抗原，纯度都是越高越好，纯度越高，非目的性的免疫反应就小，目的抗体在抗血清中占的比例也就越高。最后需要注意的是，作为抗原，不能有太强的毒性，否则动物会死亡。通常在抗原制备中经常会用到去垢剂，但是免疫动物之前必须确保不含去垢剂，否则很容易引起动物死亡的，尤其是采用静脉加强免疫时，很低浓度的去垢剂就能引起动物的死亡。