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单细胞基因表达检测-RNA-FISH和流式FlowRNA

目前,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)和免疫组化(Immuno Histo Chemistry,IHC)是进行生物标志物(DNA/RNA和蛋白)检测的最常用的方法。但它们都有其各自的技术局限性:

聚合酶链式反应(PCR)用于检测DNA和RNA虽然灵敏度高,但在提取核酸的过程中,RNA部分降解、低峰度基因表达的RNA不可避免的会出现丢失,导致无法检测。而且PCR只是检测了细胞内核酸的平均水平,无法对核酸进行单细胞水平的定位检测。

免疫组化(IHC)主要是利用抗原与抗体特异性结合原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内的抗原(多肽和蛋白质),并对其进行定位、定性及定量的研究。由于需要特异性抗体,因此对于一些没有特异性抗体的蛋白,采用免疫组化检测显然不可能;即使可以制备抗体,也需要花费几个月的时间来完成。对于一些低浓度表达的分泌性蛋白信号,免疫组化的敏感性也比较差。另外,对于保守性比较高的基因家族,往往由于抗体的特异性较差而无法检测出基因家族内蛋白的差异性。

对于基因及功能的检测,一般通过检测DNA和蛋白来实现。然而,不是所有的RNA都编码蛋白,部分RNA可能只是参与了基因调控和其它广泛的细胞活动。而且RNA表达的变化可能不是源于DNA的变化,也不一定引起蛋白质水平变化(如长链非编码RNA(LncRNA))。因此,检测RNA最好的方法是能进行原位检测,精确定位其在细胞和组织微环境中位置并进行定量分析

RNA原位杂交(ISH)技术的出现解决了PCR无法对细胞或组织内靶RNA定位,免疫组化(IHC)非特异性结合和传统原位杂交中可能出现的一系列问题。

ViewRNA、Primeflow RNA技术由双“Z”探针设计,

(1)其具有高度特异性、极高的信噪比的特点;

(2)同时能够在单细胞单分子水平同时定位、定量分析多个RNA的表达;

(3)可在保持组织和细胞形态的条件下,单细胞单分子水平对细胞内RNA进行定位、定量的分析方法;

(4)该技术解决了PCR无法定位,免疫组化(IHC)非特异性结合和传统原位杂交中可能出现的一系列问题;并且可以与免疫组化(IHC)结合应用,检测RNA与蛋白的表达情况。

ViewRNA.png

RNA-FISH可用于多种类型样本检测分析:

  • 缺乏有效抗体的蛋白抗原检测(如:斑马鱼、肿瘤干细胞CD133检测);

  • 稀有珍贵样本中基因表达分析;

  • 同源基因家族筛查;

  • LncRNA(长链非编码RNA)检测;

  • 样本中部分降解RNA的检测;

  • 嵌合体分析;

  • RNA单细胞单分子水平定位、定量分析;

  • 测序后的基因表达结果验证;

  • 多基因表达的定量、定位分析;

  • 感染性RNA病毒检测等

联系我们(010-57438396或xieyl@nwbiotec.com, heyy@nwbiotec.com)获取FISH-Flow  Nature Protocol: 

FISH-Flow, a protocol for the concurrent detection of mRNA and protein in single cells using fluorescence in situ hybridization and flow cytometry. Nat Protoc. 2017 June ; 12(6): 1245–1260.


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