邻位连接技术(proximityligationassay,PLA)采⽤核酸适配体(aptamer)或单/多克隆抗体-核酸复合物作为邻位连接探针(proximityprobes)。当⼀对邻位探针同时识别同⼀个⽬标蛋⽩分⼦或互作的两个蛋白时，它们将在空间位置上相互临近，通过连接反应形成⼀段可扩增的DNA标签序列，该标签序列能够反映待测蛋⽩的种类及浓度。该技术将对蛋⽩质的检测转变为对DNA核酸序列的检测，实现了特殊蛋⽩质的检测，定量及定位。

图1.ProQuantum免疫检测工作原理。

A. 寡核苷酸引物偶联的抗体与分析物的结合

每个试剂盒中提供了两种抗体偶联物：3´末端寡核苷酸和 5´末端寡核苷酸，每种偶联至靶标特异性抗体。当抗体对与蛋白的两个不同表位结合时，3´和 5´引物会非常接近。

B.通过 DNA 连接酶连接两端引物，并通过 Applied Biosystems TaqMan qPCR 试剂盒进行扩增

只有当抗体对与蛋白结合时（A），对应的两端引物才能与互补的夹板引物结合，并随后通过 DNA 连接酶彼此连接（B）引物，连接后通过 95°C 热灭活使连接酶、抗体和其他蛋白质变性，仅留下 100 个碱基的链接引物，其浓度与第一阶段抗体-蛋白结合的水平相同。将该链接引物使用 Taq Man 检测试剂盒进行40 个 qPCR 循环的信号扩增。

• 高灵敏度 — 相比传统方法，以更高的灵敏度检测低水平表达的蛋白；

图2.分析灵敏度。检出限（LOD）定义为高出背景2个标准偏差。对比多个人类细胞因子靶标的LOD的比较表，ProQuantum平台的灵敏度比ELISA高约10-1,000倍。

• 动态线性范围广 — ≥5对数单位，尽可能减少样品稀释步骤，确保样品浓度在该范围内；

图3.广泛动态线性范围。ProQuantum检测的标准曲线比ELISA标准曲线广，低浓度分辩率更好。

• 样品消耗量小— 仅需使用2–5 µL样品；

• 工作流程快速、简单 — 从样品到获取结果的时间通常为2小时，无需清洗步骤，只需1小时即可完成孵育；

图4.相比于ELISA的检测运行时间。

• 无需购买专用仪器 — 可在任何qPCR仪器上运行；

• 直观的云分析软件 — 全面进行数据分析和统计分组对比。

Duolink®邻位连接检测（PLA）实现了对内源性蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）和翻译后修饰的研究，为单一事件提供了可通过显微镜或流式细胞仪进行可视化的荧光信号。为了实现对蛋白质间相互作用的研究，Duolink® PLA技术使用了一对带有寡核苷酸标记的抗体，当它们相距在40nm以内时，可进行滚圈扩增并在添加标记探针后产生特异性荧光信号。

Duolink® PLA可提供四种不同颜色的荧光用于流式细胞仪和显微镜检测，对细胞中多组蛋白质间的相互作用实现可视化。借助Duolink® PLA技术的放大能力和诸多优势，发现任何科研突破机会： 

- 可视化蛋白互作——包括稳定和瞬时两种

- 可视化翻译后修饰

- 内源蛋白——无需表达或遗传操作

- 高特异性——使用两种抗体/探针消除假阳性

- 无需特殊设备——可提供基于标准免疫荧光和流式细胞术的方法

Duolink®邻位连接技术(PLA)是一种高特异性、高灵敏地原位检测内源性蛋白、蛋白修饰和蛋白互作的强大工具。该技术可轻松检测和定位未改造细胞和组织内单分子级别的蛋白靶标。一般先使用不同种属来源的两种一抗检测两个蛋白靶标（图1A）（见文末）。接着用一对寡核苷酸标记的二抗（PLA探针/邻位探针）结合一抗（图1B）。再加入连接寡核苷酸，当一对邻位探针足够贴近（<40nm）时，连接寡核苷酸会与邻位探针对互补杂交，在连接酶的作用下形成封闭的环状DNA，作为滚环扩增(RCA)的模板（图1C）。接着DNA聚合酶以PLA探针为引物，以上述环状DNA为模板，通过RCA反应合成连环序列（图1D）。这使仍与PLA探针相连的序列信号扩大1000倍，方便进行信号定位。最后，用标记寡核苷酸与扩增子内的互补序列杂交（图1E），在荧光显微镜下表现为散点（PLA信号），实现可视化和定量分析（图1F）。Duolink® PLA技术可结合免疫荧光（即绿色、红色、远红或橙色检测）或免疫组化（即过氧化物酶催化反应）检测贴壁细胞、细胞离心涂片和组织切片。此外，Duolink® PLA技术还可结合流式细胞术检测血液或悬浮细胞，也可采用多孔板（例如，96或384孔板）搭配高内涵筛选成像仪进行高通量分析。Duolink® PLA的高特异性、灵敏度和多功能性使其成为信号通路分析、药物筛选、IC50 测定和靶标验证的理想选择。

图 5.Duolink® PLA 反应图示。((A)) 两种一抗蛋白特异性识别细胞中的目的蛋白。黄色和绿色小球代表单个蛋白的两个表位或两个互作蛋白的表位。(B)偶联寡核苷酸的二抗（PLA探针）结合一抗。(C)当两个PLA探针比较接近时，连接寡核苷酸杂交并连接PLA探针。(D)连接得到的封闭、环状DNA模板被DNA聚合酶扩增。(E)标记荧光染料的互补检测寡核苷酸与扩增子的重复序列杂交。(F)通过荧光显微镜检测到的PLA信号为离散光点，实现对蛋白或蛋白互作的胞内定位。

* 无需过量表达或基因操作

* 高特异性（更少的假阳性）

* 滚环扩增带来的单分子灵敏度

* 可实现相对定量

* 无需特殊仪器

* 比FRET更快捷简单

* 与Co-IP相较有更好的准确度

* 随时可发表的结果

&应用 PLA 检测蛋白质

· 检测细胞因子、酶、受体、肿瘤标志物及病原体

&应用 PLA 检测蛋白质间相互作用

· 蛋白质之间相互结合

· 蛋白质的翻译后修饰

&应用 PLA 检测 DNA-蛋白质间相互作用

· 转录因子与 DNA 的相互作用

1.检测稳定、瞬时和微弱的蛋白互作（可视化）

图6.在TIME细胞中，使用VEGF刺激前后不同时间段内，对原位的VE-PTP/VEGFR2复合物（红色斑点）进行检测。

2. 检测EGFR和HER2二聚化

图 7.Duolink® PLA检测EGF诱导的EGFR:HER2二聚化。在EGF处理的固定SK-OV3细胞玻片中加入小鼠抗EGFR和兔抗HER2抗体(A, E)、仅抗EGFR抗体(B, F)、仅抗HER2抗体(C, G)或只有抗体稀释剂(D, H) ，37 °C孵育2小时(A-D)或4 °C孵育过夜(E-H)。接着用抗兔PLUS和抗小鼠MINUS PLA探针进行Duolink® PLA实验。使用DAPI（蓝色细胞核）与Cy5（红色PLA信号）滤光片每孔随机采集10张20倍放大图像。图像来自5个独立实验的代表性结果。

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