​ - 方案A：用PI或7-AAD染色死细胞

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PI和7-AAD可用来染色死细胞，标准的细胞表面染色分析中用来排除死细胞。该染料不能通过完好的细胞膜，但可通过已破坏的细胞膜进入胞内。PI进入死细胞后，嵌入双链DNA或双链RNA中，而7-AAD则优先嵌入双链DNA。因为该嵌合使非共价结合，所以重悬细胞用的缓冲液中必须含有该染料，以保证死细胞被染色。

注：PI和7-ADD均不适用于胞内染色。

材料

• 活性染料

• PI染料(货号 00-6990)

• 7-AAD活性染料(货号 00-6993)

• 流式细胞染色缓冲液(货号 00-4222)

• 12x75mm流式管

实验步骤

1. 染色细胞的表面抗原之后，用流式细胞染色缓冲液洗涤细胞1-2次。

2. 在适量的流式细胞染色缓冲液中重悬细胞。

3. 每100μL细胞中加入5μL PI或7-AAD染色液。

4. 在冰上或室温下孵育5-15分钟。切勿洗涤细胞。

注：在实验过程中，缓冲液内必须含有PI或7-AAD。加入PI或7-AAD后切勿洗涤细胞。

5. 使用流式细胞仪分析样本。

注：应在孵育后4小时内进行分析，因为细胞长期保留在PI或7-AAD之中，会造成细胞死亡。在2-8°C下避光存放，直到分析。

 -方案B：用钙黄绿素染料染色活细胞

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材料

• 钙黄绿素染料

• 钙黄绿素AM（超纯净级） (货号 65-0853)

• 钙黄绿素紫450 AM(货号 65-0854)

• 钙黄绿素蓝AM(货号 65-0855)

• 无水DMSO

• [可选]PI (货号 00-6990)或7-AAD (货号 00-6993)

• 流式细胞染色缓冲液(货号 00-4222)

• 12x75mm圆底离心管

实验步骤

1. 准备单细胞悬液。

2. 在流式细胞染色缓冲液（0.1–1 mL）中重悬细胞，浓度为1-5x10⁶细胞/mL。

3. 加入建议浓度的钙黄绿素染料并混匀。（有关钙黄绿素染料的推荐浓度范围，参见产品说明）

注：根据实验情况，可以使用流式细胞染色缓冲液或PBS制备稀释的工作液。

4. 室温下孵育30分钟，注意避光。

5. 加入2mL流式细胞染色缓冲液，并在室温、400–600 x g下离心5分钟，弃上清。

6. 重复第5步。

7. [可选]染色细胞的表面蛋白。

8. 使用流式细胞仪分析样本。

-方案C：使用可固定的活性染料（FVD）染色死细胞

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-方案C₁： 12x75mm流式管内的标准染色

材料

• 磷酸缓冲盐溶液（PBS），不含叠氮化物和蛋白质

• 流式细胞染色缓冲液(货号 00-4222)

• 12 x 75 mm流式管

实验步骤

1. 在12 x 75 mm流式管中准备细胞。

2. 在不含叠氮化物和血清/蛋白质的PBS中洗涤细胞2次。

3. 在不含叠氮化物和蛋白质的PBS中重悬细胞至1–10x10⁶/mL。

注：为了保持细胞染色的一致性，不建议对体积不足0.5mL的样本进行染色。

4. 向每毫升细胞中加入1μL FVD并立即涡旋。

5. 在2-8°C下孵育30分钟，避光。

6. 用流式细胞染色缓冲液或同类溶液洗涤细胞1-2次。

7. 按需继续实验。

-方案C₂：用FVD染色未裂解的全血细胞

材料

• 流式细胞染色缓冲液(货号 00-4222)

• 红细胞裂解液，例如：

• 1X红细胞裂解液(货号 00-4333),

• 10X红细胞裂解液（多物种）(货号 00-4300)或

• 一步法固定/裂解液 (10X) (货号 00-5333)

• 12 x 75 mm流式管

实验步骤

1. 将未裂解的全血加入12 x 75 mm流式管内。

2. 向100μL全血中加入1μL FVD。

3. 加入FVD后，加入其他表面染色抗体。

注：或者按照每份样本1μL的比例，将FVD直接加入表面染色抗体混合物中进行染色。混合液应该在加入全血样本之前制备。

4. 在2-8°C下孵育30分钟；避光。

5. 用流式细胞染色缓冲液洗涤细胞1-2次。

6. 按需裂解红细胞并继续实验。

-方案C₃：在抗体混合物中加入FVD染料

材料

• 磷酸缓冲盐溶液（PBS），不含叠氮化物和蛋白质

• 流式细胞染色缓冲液(货号 00-4222)

• 12 x 75 mm流式管

实验步骤

1. 在12x75 mm流式管中制备细胞，浓度为1–10x10⁶/100μL缓冲液（参见下面的注释）。

注：为了使FVD达到最佳染色效果，可以在不含叠氮化物和血清/蛋白质的PBS中悬浮细胞（参见“方案C₁：在12x75mm流式管中的标准染色”）。

2. 在流式细胞染色缓冲液中制备所需的抗体混合液。

3. 在抗体加入细胞之前,将FVD加入抗体混合液，比例为每份样本0.5-1μL。

4. 向细胞样本中加入FVD/抗体混合物。

5. 在2-8°C下孵育30分钟，避光。

6. 用流式细胞染色缓冲液洗涤细胞1-2次。

7. 按需继续实验。