1. 用4%新鲜多聚甲醛固定类器官，置于4℃摇床4-6小时。

2. 用PBS室温下洗涤3次，置于摇床，每次30 min。

3. 样品中加入含2% PBST（2% Triton X-100的PBS含 0.05% 叠氮化钠） 的5ml 管中置于摇床室温孵育2 天 

4. 用PBS室温下洗涤3次，置于摇床，每次30 min。

5. 免疫荧光检测简易步骤

- 封闭液封闭（Blocking）, 2天；

- 一抗, 1:200稀释，孵育4 天； 

- 二抗,1:200稀释，孵育3 天；

抗体的稀释浓度可根据不同厂家抗体要求进行稀释。

注：免疫荧光操作过程中，可将样品置于2mL管中，15℃摇床孵育一抗和二抗。

6. 样品转移至含RapiClear的2mL管中，RapiClear可反复使用数次。

7. 将透明的样品转移至载玻片，透明试剂中含抗淬灭封片剂，加RapiClear封片即可。

8. 共聚焦成像。较常用显微镜如Zeiss 25x/0.8 multiple immersion (WD 0.57mm), Leica 20x/0.75 multiple immersion (WD 0.68mm), Nikon 25x/1.05silicone immersion (WD 0.55mm), Nikon 20x/0.95 water immersion (0.95mm WD), and Olympus 30x/1.05 silicone immersion (WD 0.8mm)，均可获得较高品质的3D图像。

直径1.2mm之类脑器官(organoid)使用RC149进行透明化

Organoid神经元表达GFP荧光蛋白的景深影像。