细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，是一个高度调节的过程，它不仅能使机体摆脱不需要的细胞和组织，实现正常的生长和发育，还能通过破坏免疫系统多余的细胞和病毒感染或DNA损伤的细胞，将对机体的威胁降到最低。

      膜联蛋白是一系列钙离子依赖型磷脂结合蛋白，可优先结合磷脂酰丝氨酸 (PS)。在正常生理条件下，PS 主要位于细胞质膜的内叶上。细胞凋亡开始后，PS 透过磷脂双分子层使其非对称分布逐渐消失，并转移至细胞外膜叶上，将细胞标记为吞噬作用目标。在细胞膜外表面时，可通过荧光标记的膜联蛋白 V 在钙离子依赖模式下检测 PS。

      在细胞凋亡早期，质膜可阻挡碘化丙啶 (PI)、7-AAD 等活性染料或者 eFluor™ 660 或 eFluor™ 780 等 Fixable Viability Dye 进入细胞。这些细胞将被膜联蛋白 V 染色，但不被活性染料染色，这样可以区分处于细胞凋亡早期的细胞。然而，在细胞凋亡晚期，细胞膜丧失完整性，因此膜联蛋白 V 也可接触细胞内的 PS。活性染料可用于从早期凋亡细胞（膜联蛋白 V 阳性，活性染料阴性）中分辨出这些晚期凋亡和坏死细胞（膜联蛋白 V、活性染料阳性）。

主要试剂

Annexin V FITC/PI 凋亡检测试剂盒（#227495）

实验步骤

1. 细胞样品的准备：

a)悬浮细胞：

1. 1) 收集细胞至离心管中1000-2000rpm离心5min，小心去除上清。

2. 2)用1mL 4℃预冷PBS轻轻重悬细胞并计数，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。

3. 3)再加入1mL 4℃预冷的PBS重悬细胞，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。

b)贴壁细胞：

1. 1)吸出细胞培养液至离心管中，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量不含EDTA的胰酶细胞消化液消化细胞。

2. 2)室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。

3. 3)加入以上步骤中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。

4. 注：加入的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶；残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-FITC导致染色失败。

5. 4)用1mL 4℃预冷PBS轻轻重悬细胞并计数，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。

6. 5)再加入1mL 4℃预冷的PBS重悬细胞，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。

1. 2. 用去离子水按1：4稀释Binding Buffer（4mL Binding Buffer+12mL去离子水）；

2. 3. 用250 μL结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1×106/mL；

3. 4. 取100 μL的细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀；

4. 5. 室温(20-25℃)避光孵育10min；

5. 6. 上机前5min加入10 μL碘化丙啶溶液，轻轻混匀；

6. 7. 上机前在反应管中补加400 μL PBS重悬细胞， 避光保存，随即进行流式细胞仪（FACS）检测， Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

注意事项：

1. 微量试剂需离心数秒将试剂收集至管底后再开盖取用。

2. Propidium Iodide（PI）有毒，操作时要带手套，使用时避免与皮肤，眼睛和黏膜接触。

3. Annexin V-FITC中含有剧毒成分叠氮化钠（NaN3）, 操作时要带手套，使用时避免与皮肤，眼睛和黏膜接触。

4. 染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。

5. Annixin V检测凋亡细胞的方法适用于悬浮生长的细胞，如：淋巴细胞等细胞的检测。对于贴壁生长的细胞，由于在胰酶等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤，会造成较高的假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测，可将胰酶消化后的细胞保存在含2%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。尽管目前，包括国外也有一些单位采用该方法检测贴壁生长的细胞。我不推荐用该方法检测。因为其重复性较差，且需要操作时非常小心。

6. 消化贴壁细胞残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC，最终导致染色失败。

7. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。