等温扩增 - 核酸序列依赖扩增NASBA 

1. 原理：

NASBA技术是检测RNA的等温扩增方法，通常在42 ℃左右进行，需要逆转录酶Maxima H Minus Reverse Transcriptase(200 U/µL)（#EP0751/EP0752/EP0753）

、RNA酶H（#EN0201/EN0202）、T7 RNA聚合酶（#EP0111/EP011）和一对引物来完成。其正向引物包含T7启动子互补序列。反应过程中正向引物与RNA链结合，由逆转录酶

催化形成DNA-RNA双链；RNA酶H消化杂交双链中的RNA,保留DNA单链；在反向引物与逆转录酶的作用下形成含有T7启动子序列的DNA双链；在T7 RNA聚合酶的作用下完成转录过程，产生大量目的RNA。

2．特点：

NASBA的优点在于产物是单链RNA，不易造成遗留污染；由于转录过程产生大量RNA，具有更高的灵敏度；将反转录和扩增反应一步完成，适用于RNA样品的分析，缺点是需用RNA酶抑制剂防止RNA降解。

核酸序列依赖扩增

 (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification , NASBA) 

• 以RNA为模板进行等温扩增并能实时观测结果的检测方法

• 反应分两步：非循环和循环扩增

• 通过分子信标探针检测扩增得到的RNA产物

• 广泛应用于细菌、病毒等多种病原微生物的检测

NASBA的优势： 

• 反转录和扩增在同一反应管中进行

• 灵敏——扩增产物可高达109拷贝

• 低成本

谁会进行NASBA？

• 对感染性疾病进行病毒检测和监测的科研人员

• 目前使用PCR方法进行病毒检测的科研人员

• 进行现场核酸检测的科研、工业、POC客户 

等温扩增 – 多重置换扩增MDA/WGA

多重置换扩增(Multiple dilacement amplification, MDA)是1998年由耶鲁大学Lizardi博士首次提出。这种恒温扩增的方法依赖于链置换扩增原理，利用噬菌体中phi29DNA聚合酶（#EP0091/EP0092/EP0094），高度扩增DNA。该酶对于模板有很强的模板结合能力，能连续扩增100Kb的DNA模板而不从模板上解离。同时这种酶具有3’-5"外切酶活性，错误率仅为5x10^-6，大约比Taq DNA聚合酶低100倍，因此可以保证扩增的高保真性。

多重置换扩增（Multiple Displacement Amplification, MDA)

• MDA是最常用的全基因组扩增（Whole Genome Amplification, WGA）方法

• 利用Phi29 DNA聚合酶（#EP0091/EP0092/EP0094）的链置换活性，在恒温下进行基因组 DNA的扩增

MDA的优势：

• 扩增能力强，高保真扩增

• 产量高，使用极少量的DNA样本便可获得大量扩增产物，且扩增片段长

谁会进行MDA？

• 进行单细胞研究的客户，如单细胞全基因组测序

等温扩增 - RCA

1．原理：

RCA借鉴了自然界中环状DNA复制方式。所需酶为phi29DNA聚合酶（#EP0091/EP0092/EP0094），在37 ℃左右进行。普通RCA的过程为：引物与环状DNA模板结合后延伸，生成含有大量目的基因的DNA单链。在此基础上还发展出了多种改进技术，如多位点同时进行扩增的多引物RCA、使用两条引物提高扩增效率的指数RCA。

2．特点：

RCA的优点有：扩增效率高；种类多，应用广；产物为单链DNA，能与探针直接结合实现信号放大。局限性在于所需模板为环状DNA。

滚环扩增（Rolling Circle Amplification, RCA)

• 以环状 DNA为模板，通过一个短的DNA引物（与部分环状模板互补），在phi29 DNA 聚合酶催（#EP0091/EP0092/EP0094）化下合成长重复单链DNA。

• RCA检测模板需为单链环状结构，如果是线性DNA，需经过环化处理； 

RCA的优势： 

• 不仅可以直接扩增 DNA 和 RNA，还可以通过指数扩增实现对靶核酸的信号放大

• 灵敏度达到一个拷贝的核酸分子

谁会进行MDA？

• 细胞原位检测、SNP检测，蛋白质分析、免疫芯片、全基因组扩增、DNA生物传感器

等温扩增 – LAMP/RT-LAMP

1．原理：

2000年，日本学者Notomi等报道了LAMP技术。LAMP在60~65 ℃条件下进行，需要4条引物和具有链置换功能的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶(DNA polymerase of Bacillus stearothermophilus，BstDNA聚合酶)（#EP0691）。外引物与PCR引物类似，而内引物则含有两段序列。过程如下：

（1）内引物结合目的基因，在BstDNA聚合酶的作用下延伸为双链。外引物与双链DNA的5′端结合，在一端形成环状结构。另一端经过同样过程，形成两端为环的哑铃状结构。

（2）哑铃状结构的单链DNA具有模板与引物的双重功能，在Bst聚合酶（#EP0691）的催化下即能延伸。

（3）内引物也能与环状结构结合，在酶的作用下进行延伸。

2．特点：

LAMP的优点为特异性和灵敏度高；扩增产物可通过电泳、电化学传感器、横向流动试纸条等方法判定结果。局限性在于引物设计繁琐，易出现非特异性扩增，可通过标准化引物和调整缓冲液浓度克服此缺点。

环介导等温扩增（ Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)

• LAMP是一种在恒温下进行快速、简单和特异性的DNA扩增方法，利用 Bst/Bsm DNA聚合酶（#EP0691）的强链置换活性

• RT-LAMP包含反转录步骤，从RNA中合成cDNA模板 

LAMP的优势： 

• 不需要昂贵的仪器，成本低

• 检测流程快速（15-60分钟）、简单

• 耐受抑制剂，对样本质量要求不高

• 多种结果验证方法（浊度法、比色法、凝胶电泳法，实时定量法）

谁会进行LAMP？ 

• 病原体检测

• 食品和水质安全检测

• 癌症研究和诊断

等温扩增应用酶

名称

货号

                                         等温扩增技术

 NASBA

MDA

RCA

LAMP

T7 RNA Polymerase (20 U/µL

EP0111/EP011

√

RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL)

EO0381/EO0382/EO0384

√

√

RNase H (5 U/µL)

EN0201/EN0202

√

Phi29 DNA Polymeras

EP0091/EP0092/EP0094

√

√

EquiPhi29™ DNA Polymerase

A39390/A30391/A30392

√

√

Exo-Resistant Random Primer

SO181

√

Maxima H Minus Reverse Transcriptase

(200 U/µL)

EP0751/EP0752/EP0753

√

√

T4 DNA Ligase (5 U/µL)

EL0011/EL001

√

Bsm DNA Polymerase, large fragment

EP0691

√