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小肠/结肠类器官

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在过去的十年中,一个重大的转变是从事肠道研究的科研工作者使用模型的变化,目前使用肠类器官进行肠上皮研究占据了重要位置。肠类器官培养物是三维(3D)体外组织模型,该模型具有体内肠道组织的许多生理学相关特征。这些特征包括:围绕功能性管腔的极化上皮层,及所有类型的肠上皮细胞都按体内肠道的比例和空间进行排列

肠类器官的类型


原代肠组织来源的类器官

2009年,Hans Clevers实验室对于肠类器官培养体系进行了开创性的研究1,该项研究描述了一种培养体系,其中对成年肠道干细胞的干细胞niche进行了体外表征。2011年,Sato等人1发表的第一个研究方案描述了从小鼠肠组织分离出的完整的肠隐窝以及对它们随后的培养,以形成类器官。肠隐窝被嵌入Matrigel中,并在一种生长培养基中培养,该培养基含有特殊的生长因子,其目的是为了模拟体内肠隐窝基底里的信号通路。这项研究工作表明,从解离肠隐窝、通过流式挑选所获得的单一LGR5+肠道干细胞,是有可能生成能肠类器官的。该小鼠小肠培养体系被建立后,经过调整,可用于从来自人体小肠以及人体和小鼠结肠隐窝和单个肠干细胞生成类器官2,3。相对于小鼠和人体肠上皮类器官首次研发的基本培养方法,已经有了很多的进步和改良。Stemcell Technology基于Hans Clevers文献,研发了首个完全、成份确定的小鼠肠道类器官培养基(货号#06005)和人肠类器官培养基(货号#06010)。

多能干细胞来源的类器官


在引入肠道干细胞衍生的类器官培养体系之后不久,研究人员发现了一种新方法,用于将hPSCs诱导为人体肠类器官,而这种方法在很大程度上使用了与3D类器官培养的相同方法4。相比于从分离的隐窝或LGR5+肠道干细胞而生长的肠上皮类器官,hPSCs来源的肠类器官包含了间充质部分,而这有助于培养物里的肠道干细胞niche的信号通路5。人多能干细胞(PSC)衍生的小肠类器官是三维细胞培养体系,包括一层极性的单层肠上皮。顶端细胞表面围绕着中空的官腔,基底外侧细胞表面与胞外基质和产生相关肠龛因子的间充质部分相接触。这些类器官具有主要的细胞类型和肠上皮关键的功能特征,提供与体内组织直接相关的生理特性。这些类器官保持稳定扩增的干/祖细胞群,可以通过传代进行长期维持培养和扩增,或被冻存用于后续的实验。

从未经分化的细胞建立肠类器官的方案涵盖以下流程:首先将hPSCs分化为定型内胚层以及中、后肠道规格的单层培养物,通过三维培养物进行肠道诱导形成肠类器官4。有趣的是,在定向分化为后肠的培养物中,三维培养物的形成可自发性地发生;显示后肠标记物的球状细胞从单层培养物萌出芽来,而且可以轻易地从培养上清中分离出来。类似于原代组织来源的类器官,这些部分分化的球状细胞被嵌入Matrigel液滴中,并在细胞培养基中进行培养,从而促进它们分化为肠系以及随后的部分成熟4。基于Spence等2的文献,开发了STEMdiff肠类器官试剂盒(货号#05140)用于在30天内有效的从胚胎干细胞(ESCs)或诱导多能干细胞(iPSCs)构建小肠类器官。


肠类器官完全培养基


培养基肠类器官

IntestiCult肠类器官生长培养基(小鼠)(货号 #06005)

首个完全、且成分确定,用于培养小鼠肠类器官的生长培养基。使用该培养基,研究人员可以在五到七天的时间内轻松培养出适用于实验的、可繁殖的类器官。IntestiCult可实现对小鼠肠上皮类器官的有效建立、扩增和长期维持培养。

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IntestiCult肠类器官生长培养基(人)(货号 #06010

    首个完全、且成分确定,用于培养人肠类器官的生长培养基。使用该培养基不到一周的时间,即可观察到类器官, 每7到10天传代一次以进行维持培养和扩增。不同的供体样本来源的类器官均可实现肠干细胞的高效扩增。目前已有多篇发表的文献使用了该培养基。

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STEMdiff肠类器官试剂盒(人)(货号#05140

    用于在30天内有效的从hPSCs构建小肠类器官

   支持从多种人ES和iPS细胞系高效分化为肠类器官。本试剂盒不含血清,在已发表的配方上进行了优化,提高了类器官形成和扩增的效率和实验的重现性。

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肠类器官培养方法


在最初培育小鼠小肠类器官时,培养基中添加了EGF(表皮生长因子),R-spondin-1Noggin等生长因子2。后来发现,培养小鼠结肠类器官时,除上述三种生长因子外,还需添加Wnt-3A。然而对人类小肠及结肠类器官的研究表明,除了上述的4种生长因子(EGFR-spondin-1NogginWnt-3A)外,还需要加入TGF-β抑制剂(A-83-01)和p38 MAP激酶抑制剂(SB 202190)2。最近的研究显示,从人胚胎干细胞(ESCs)或诱导多能干细胞(iPSCs)在体外培育得到的人小肠类器官(HIO)移植入体内后可形成有功能的成熟小肠组织。为诱导其形成定向内胚层(definitive endoderm,DE),人ESCs或iPSCs需先用含Activin A的培养基培养,然后在含有Activin AFGF-4以及GSK3抑制剂(CHIR 99021)的培养基中培养形成球状 体 (spheroids)。这些球状体随后被放置在Matrigel中,并用添加了EGFNoggin的小肠生长培养基维持培养,即可产生上述的HIO。最后,研究人员将HIO移植到免疫缺陷小鼠的体内进行进一步观察6


Intestine肠
细胞来源相关细胞因子和小分子相关培养基文献
组织NogginEGFFGF10DMEMAdvanced DMEM/F12Sato, T, et al., Gastroenterology. 2011 
组织EGFNogginAdvanced DMEM/F12Sato, T., et al., Nature, 2009 
PSCActivinFGF4BMP2EGFNogginSHHN/AMunera, J.O., et al., Cell Stem Cell. 2017 
PSCActivinFGF4NogginEGFDMEM/F12RPMI1640Advanced DMEM/F12Spence, J.R., et al., Nature. 2011 
PSCIGF1FGF2Knockout DMEMUchida, H., et al., JCI Insight. 2016 
PSCActivinFGF4EGFNogginRPMI1640Advanced DMEM/F12Watson, C.L., et al., Nature Medicine. 2014 
Colon结肠
细胞来源相关细胞因子相关培养基文献
hAdSCEGF, Rspondin, Noggin, WNT3A, Nicotinamide, Gastrin, TGFβinhibitor, p38 inhibitor
Toshiro Sato, Daniel E Stange, Marc Ferrante,et al.,Gastroenterology. 2011



参考文献


1. Sato T et al. (2011) Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epitheliumGastroenterology 141(5): 1762–72.

2. Sato T et al. (2009) Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche Nature 459(7244): 262–5.

3. Jung P et al. (2011) Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells Nat Med 17(10): 1225–7.

4. Spence JR et al. (2011) Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro Nature 470(7332): 105–9

5. van de Wetering M et al. (2015) Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients Cell 161(4): 933–45

6. Watson CL, Mahe MM, Múnera J, et al. An in vivo model of human small intestine using pluripotent stem cells.   Nat. Med. 2014; 20:1310-1314.


                                                                                                                                         

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