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多重qPCR

引言

多重定量PCR(Multiplex PCR),是一种可以高通量检测,可以节省样品,还可以降低成本的技术。这么优秀的它为什么一直“被沉默”?因为做好它需要耗费科研人员大量的精力和时间,颜色也仅仅可以做到三四重,二重居多。本文为大家介绍做到五重荧光定量PCR的两大要素,具体请看下文。


01

荧光干扰及Quenching效率


      LGC Biosearch的全波长荧光染料,不仅发射光峰差距大,还可以显著的降低彼此间的干扰,从而从根本上保证了5重检测的可能性。

图1. LGC Biosearch 专利荧光染料的发射光图谱,用于多重荧光定量PCR选择参考


图2. 发射光谱通过滤光片后分光图示


      多重PCR还面临着另外一个问题就是,5种荧光染料一起检测不仅容易发生串色,还可能导致高信号背景。那么这时就特别需要另外一种工具来解救,即LGC独家专利BHQ系列纯黑淬灭基团,它可以吸收对应的荧光,还可以将能量转化成热量散失,4种BHQ淬灭染料配合使用,真正做到了从430nm到近红外的全波段覆盖。

图3. 4种BHQ吸收光谱范围


没有对比就没有伤害,对比数据充分展现出了BHQ的高姿态,即具有更高的信噪比:


图4. BHQ与TAM和DAB淬灭效果对比图


02

引物及探针问题---引物及探针的相互干扰


      一般情况下,设计多重qPCR引物并不是特别容易的事情。由于引物条数多,不仅要保证引物之间不能相互结合,也需要考虑引物不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合。另外,多重qPCR还需要采用探针法,那么设计特异性探针也是多重qPCR面临的挑战。

      针对这些问题,LGC Biosearch能够提供在线探针设计工具和荧光基团光谱选择工具,再也不用担心多重qPCR引物和探针设计问题,让科研人员更加省心省力。


图5. 在线探针设计软件操作流程图


图6. 荧光基团光谱选择工具图示

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